專利名稱：抗病毒組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗病毒劑的組合物，更具體地講它是關(guān)于1，3-氧硫環(huán)戊烷(1，3-Oxanthiolane)核苷類似物與其它抗病毒劑，尤其抗HIV病毒有效的抗病毒劑的組合物。
人體免疫缺陷病毒(HIV)引起各種臨床癥狀包括獲得性免疫缺陷綜合征(艾滋病)和慢性神經(jīng)病學(xué)上的紊亂。核苷如AZT、ddc和ddI在體外抑制HIV的復(fù)制，并通過細胞對它們的5′三磷酸衍生物代謝作用使該病毒編碼逆轉(zhuǎn)錄酶而顯示出它們的抗病毒活性。
AZT減輕患有艾滋病病人的發(fā)病率和致命性，然而，細胞感染HIV導(dǎo)致病毒基因組整合到宿主染色體中，因此需長期連續(xù)使用AZT進行治療，AZT長期治療的結(jié)果會引起骨髓毒性和HIV-1的抗AZT變異體出現(xiàn)。類似地，一些用ddc治療的艾滋病病人出現(xiàn)外周神經(jīng)疾病和使用ddI可以誘導(dǎo)胰腺炎和外周神經(jīng)疾病。
化合物組合物的使用可產(chǎn)生相同的抗病毒效果且減小毒性，或者化合物間產(chǎn)生協(xié)同作用而提高藥效。全病程較低的藥物用量也可能減小抗藥HIV變種產(chǎn)生的機率。許多不同的方法已用于檢驗在不同分析體系共同起作用的化合物組合物的效果。所有的這些方法均有其局限性，而且如一些方法被應(yīng)用的體系已不是那些為該方法所設(shè)計的體系。AZT表明與作用于HIV-1復(fù)制階段而并非逆轉(zhuǎn)錄階段的藥物在體外產(chǎn)生協(xié)同抗病毒作用。這些藥物包括重組體可溶性CD4澳洲粟精胺(Castanospermine)和重組α-干擾素。然而，必須指出的是化合物的組合物可以增加細胞毒性，AZT與重組α-干擾素組合物就可增加對正常人體骨髓原細胞的細胞毒性。
AZT與其它核苷的組合物也已被研究，ddc可消除高劑量AZT引起的骨髓細胞毒性而并未影響其抗病毒的活性，ddI和AZT在組合物中表現(xiàn)出某些選擇性的加強作用，通過協(xié)同的抗病毒作用而克服對正常人體骨髓原細胞疊加的毒性。
結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的化合物，也被稱作BCH-189或NGPB-21已被描述具有抗病毒作用，尤其是具有抗作為艾滋病病原體的人體免疫缺陷病毒(HIV′S)的作用。(5th Anti-Aids Conference，montreal，Canada 5th-9th June 1989Abstracts T.C.O.1 and M.C.P.63，歐洲專利申請公開號EP-0382562)。
結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物是一種結(jié)構(gòu)式(Ⅰ-1)和(Ⅰ-2)兩個對映體的外消旋混合物
盡管結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物的對映體具有同等的抗HIV作用，而對映體之一(左旋對映體)比右旋對映體有相當(dāng)?shù)偷募毎拘浴?br> 左旋對映體的化學(xué)名稱為(-)順-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷基-5基)-(1H)-嘧啶-2-酮。它具有結(jié)構(gòu)式(Ⅰ-1)化合物絕對的立體化學(xué)，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ-1)化合物的名稱為(2R，順)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷基-5基)-(1H)-嘧啶-2-酮，該化合物現(xiàn)稱為3TC。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物，尤其是它的左旋對映體當(dāng)與已知的HIV復(fù)制抑制劑共用時顯示出意想不到的優(yōu)點，特別是當(dāng)它與已知的HIV復(fù)制抑制劑共用時表現(xiàn)出協(xié)同的抗病毒效果和/或消除細胞毒性。
因此，該發(fā)明的首要目的是提供一種組合物，包括結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的化合物或一種其藥物制劑上可接受的衍生物和一種HIV復(fù)制抑制劑。
抑制劑可包括任何HIV復(fù)制抑制劑而不管其抑制HIV復(fù)制的方式如何，抑制劑包括那些如抑制HIV逆轉(zhuǎn)酶、HIV蛋白酶、TAT及類似的抑制劑。
抑制劑包括的例子有3′-疊氮基-3′-脫氧胸腺嘧啶核苷(AZT，Zidovudine)，2′，3′-二脫氧胞苷(ddc)，2′，3′-二脫氧次黃苷(ddI)，N′-[1cs)-芐基-3-[4a(s)，8a(s)-3(s)-(叔-丁基氨基甲?；?+氫異喹啉基-2基]-2(R)-羥丙基]-N″-(喹啉基-2-羰基)-L-天門冬酰胺(羅馬尼亞專利RO31-8959)和(+)-S-4，5，6，7-四氫-5-甲基-6-(3-甲基-2-丁烯基)-咪唑并(4，5，1-jk)(1，4)-苯并二氮雜
-2(1H)硫酮(R-82150;TIBO)或其藥物制劑上可接受的衍生物。
優(yōu)選的結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物是它的左旋對映體的形式(3TC)。
優(yōu)選的HIV復(fù)制抑制劑是選自AZT、ddI、RO31-8959或R-82150(TIBO)。
特別優(yōu)選的HIV復(fù)制抑制劑是ddI或尤其是AZT。
當(dāng)結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的化合物是左旋對映體的形式時，它基本上不含有相應(yīng)的右旋對映體，也就是說右旋對映體含量不超過約5%(W/W)，優(yōu)選的不超過約2%(W/W)，尤其是低于約1%(W/W)。
關(guān)于“藥物制劑上可接受的衍生物”的意思是指任何藥物制劑上可接受的鹽、酯、或其酯的鹽、母核化合物或任何當(dāng)用于受體時能夠(直接或間接地)提供母核化合物或其有抗病毒活性的代謝產(chǎn)物或殘基的其它化合物。
對于本專業(yè)技術(shù)人員來說可以想到結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物可通過修飾堿基部分和氧硫環(huán)戊烷上羥甲基的功能基來提供其藥物制劑上可接受的衍生物，所有這種功能基的修飾均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，然而特別感興趣的是通過氧硫環(huán)戊烷上的2-羥甲基的修飾來獲得藥物制劑上可接受的衍生物。
結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物優(yōu)選的酯包括化合物中2-羥甲基上的氫被?；?
取代生成的酯，其中酯的非羰基部分R選自氫、直鏈或支鏈烷基(如甲基、乙基、正-丙基、叔-丁基、正-丁基)、烷氧基烷基(如，甲氧基甲基)、芳烷基(如芐基)、芳氧基烷基(如芐氧基甲基)、芳香基(如由鹵素、C1-4烷基或C1-4烷氧基隨意取代的苯基);磺酸酯(sulphonate esters)如烷基或芳烷基硫代酰基(如甲烷硫代?；?;氨基酸酯(如L-纈氨酰或L-異亮氨酰)和單、雙或三磷酸酯。
關(guān)于上面所描述的酯，如果沒有特殊說明，其中的烷基部分優(yōu)選包含1-16個碳原子，特別是1-4個碳原子，該酯中好的芳基部分優(yōu)選包含一個苯基。
尤其是，該酯可以是C1-16烷基酯、未取代的芐基酯或由至少一個鹵素(溴、氯、氟、碘)、C1-6烷基、C1-6烷氧基、硝基或三氟甲基取代的芐基酯。
結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物的藥物制劑上可接受的鹽包括那些制劑上可接受的無機和有機的酸、堿的衍生物。合適的酸的例子包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、延胡索酸、馬來酸、磷酸、羥基乙酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、甲苯-對-磺酸、酒石酸、乙酸、枸椽酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。其它本身不屬于藥物制劑上可接受的酸如草酸也可用作獲得本發(fā)明化合物和其制劑上可接受的酸加成的鹽的中間體。
從適當(dāng)?shù)膲A衍生的鹽包括堿金屬(如鈉)、堿土金屬(如鎂)、NH+4和NR+4(其中R為C1-4烷基)的鹽。
結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物可與組合物中的第二組分產(chǎn)生協(xié)同作用和/或消除第二組分的細胞毒性。
結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物與另一種抗病毒劑的優(yōu)良效果可在寬的比例范圍內(nèi)被實現(xiàn)，如從1∶250到250∶1，合適的范圍是1∶50到50∶1，特別是從1∶10到10∶1。方便的是在組合物中，每種化合物的用量就是它們單獨使用時能表現(xiàn)出抗病毒活性的量。
預(yù)計本組合物將普遍地用于人體的抵抗病毒感染或抵抗由病毒引起的腫瘤，而且在體外或體內(nèi)用它們抑制病毒感染或腫瘤生長的方法也屬于本發(fā)明的范圍。
另一方面，提供一種治療哺乳動物(包括人)的病毒感染的方法，包括聯(lián)合使用結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的一種抗病毒化合物和HIV復(fù)制抑制劑，治療方法包括使用結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物和一種以上其它抗病毒劑的組合物，共服或配對組合的分服均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
可以想到，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物和另一種抗病毒劑，既可一并地、相繼地使用也可組合使用。如果用法是相繼的，與第二種活性組分使用的間隔時間不致于失去組合物的協(xié)同效果，優(yōu)選的使用方法是同時使用。
本專業(yè)技術(shù)人員可以想到，這里的治療將延伸到預(yù)防和對已發(fā)生的感染或癥狀的治療。
更進一步地想到，用于治療時本發(fā)明組合物所要求的量，不僅隨特定化合物的選擇而不同，而且隨給藥的途徑、所治療的自然條件、年齡、病情以及甚至因護理醫(yī)生或獸醫(yī)的意見而發(fā)生變化。然而總的來說，組合物中的各個活性組分合適的劑量范圍約為1-750mg/kg，如約10-75mg/kg體重/天，3-120mg/kg體重/天，優(yōu)選的范圍為6-90mg/kg/天，最好的范圍為15-60mg/kg/天。
理想劑量是一次劑量使用或在適當(dāng)?shù)臅r間間隔中分劑給藥，如每天兩次、三次、四次或更多的分劑量。
本發(fā)明組合物以單位劑量形式給藥為方便，如每單位劑量中包含10-1500mg的每種活性組分，方便地為20-1000mg，最方便的是50-700mg。
理想地，給藥后將使各個活性化合物的血漿峰值濃度達到約1-75mM，較好約為2-50mM，最好約為3-30mM。為實現(xiàn)這一目的，可以例如通過靜脈注射0.1-5%活性組分的溶液，也可以是鹽溶液，或口服給藥每劑含有約1-100mg每種活性組分的大丸藥。理想的血液水平可通過連續(xù)輸入約0.01-5.0mg/kg/小時或通過間歇輸入每劑約含0.4-15mg/kg的每種活性組分來維持。
盡管出于治療的目的，組合物中的活性組分可以是化學(xué)粗制品，但是，本組合物最好以藥物制劑形式使用。
本發(fā)明進一步提供一種藥物制劑包括結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物或其藥物制劑上可接受的衍生物和HIV復(fù)制抑制劑，與其一種或多種制劑上可接受的載體及任意的其它具有治療和/或預(yù)防作用的組分。載體必須是“可接受的”，在這種意義上說與其它制劑組分是兼容的并對其受體是無害的。
藥物制劑包括適于口腔、直腸、鼻腔、表皮(包括頰和舌下)、陰道或非腸道(包括肌肉、皮下和靜脈)給藥或適于通過吸入法或吹入法給藥。在合適的情況下，本發(fā)明組合物可以是分劑量單位給藥，并可通過藥學(xué)領(lǐng)域中公知的方法制得。所有的方法都包括將液體載體或能很好分散的固體載體與活性化合物結(jié)合在一起的步驟，如果需要，再將產(chǎn)品制成所需制劑。
適用于口服給藥的藥物制劑方便的可以是分散的單位，如分別各含有預(yù)定量的活性組分的膠囊劑、扁囊劑或片劑;可以是粉劑或顆粒劑，也可以是溶液劑、混懸劑或乳劑?；钚越M分可以大藥丸、藥糖劑或糊劑形式提供。口服給藥的片劑和膠囊劑可含有常規(guī)的賦形劑如粘合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑或潤濕劑，片劑可按現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法包衣?？诜后w制劑可以是如水或油的混懸劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑或酏劑的形式，或者可以干產(chǎn)品的形式提供，用前再與水或其它合適的媒介物配制。此液體制劑可包含常規(guī)的添加物如混懸劑、乳化劑、非水媒介物(可包括食用油)或防腐劑。
按照本發(fā)明，化合物也可以制備成非腸道給藥的劑型(如注射劑如局部注射或連續(xù)輸注)，其劑型包裝可以是安瓿、預(yù)先填充的注射器、小容量輸液的單位劑量包裝或是含有防腐劑的多劑量容器。該組合物可制成混懸液、溶液或在油或水媒介中的乳液的形式，也可含有賦形劑如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。另外，活性組分可通過滅菌固體的無菌分裝或通過溶液的冷凍干燥而獲得粉劑，用前，再以合適的溶媒如無菌無熱原的水溶解。
用于表皮的局部給藥，按本發(fā)明化合物可為軟膏劑、霜劑或洗劑、或者為透皮膏貼。比如軟膏劑和霜劑可由水性或油性基質(zhì)中加入合適的增稠劑和/或膠水劑而構(gòu)成。洗劑可由水性或油性基質(zhì)構(gòu)成，且一般含有一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、助懸劑、增稠劑或調(diào)色劑。
適于口腔局部給藥的制劑包括由活性組分和蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠香味基質(zhì)組成的錠制，由活性組分和明膠與甘油或蔗糖和阿拉伯膠等惰性基質(zhì)組成的軟錠劑，由活性組分和合適的液體載體組成的漱口劑。
載體是固體的適于直腸給藥的藥物制劑最好是單位劑量栓劑，合適的載體包括可可脂和其它現(xiàn)有技術(shù)中的常用材料。栓劑可通過將活性組分與軟性或可熔性載體混合，經(jīng)在模中冷卻成形而制成。
適于陰道給藥的制劑可以是除含有活性組分外還含有現(xiàn)有技術(shù)中已知理想的載體的陰道栓、棉塞、霜劑、膠劑、糊劑、泡劑或噴霧劑。
用于鼻腔給藥，本發(fā)明的化合物可以是液體噴霧劑或可分散的粉劑或滴劑形式。
滴劑可由水性或非水性基質(zhì)構(gòu)成，并且還含有一種以上的分散劑、溶解劑或混懸劑。液體噴霧劑可由壓力瓶來方便地給藥。
用于吸入給藥，按本發(fā)明，化合物可以通過吹入器、噴霧器或壓力瓶可以含有一種合適的推進劑如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。壓力氣霧劑劑量單位可由所提供的閥門計量來決定。
另外，吸入法或吹入法給藥，按本發(fā)明，化合物可制成干粉組合物，如化合物與合適的粉性基質(zhì)如乳糖或淀粉組成的粉狀混合物。干粉組合物可以是單位劑量形式，如膠囊劑或藥筒(cartridges)或明膠劑或發(fā)泡劑(blister packs)，這粉末可以借助吸入器或吹入器給藥。
上述所描述的適于提供持續(xù)釋放活性組分的制劑均可被使用。
按本發(fā)明，藥物組合物也可包含如其它抗微生物劑的活性組分或防腐劑。
結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物可通過歐洲專利申請公開號0382562中所描述的方法而獲得。
它的單一對映體可由外消旋體通過任何現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法將外消旋體分離拆開而獲得。尤其是它們可通過手工操作高壓液相色譜(HPLC)、使用如胞苷脫氨基酶進行酶調(diào)節(jié)對映體選擇性代謝或通過使用5′核苷對合適的衍生物進行選擇性的酶降解來獲得。3TC的制備方法在國際專利申請公開號WO91/17159中有所描述。
下面例子說明本發(fā)明但并不僅僅以此為限。
中間體15-甲氧基-1，3-氧硫環(huán)戊烷基-2-甲醇苯甲酸酯將氯化鋅(1.6g)的熱甲醇(15ml)溶液加到攪拌的巰基乙醛，二甲基乙縮醛(34.2g)和苯甲酰氧基乙醛(48.3g)的甲苯溶液(1300ml)中，然后在通氮氣加熱回流50分鐘，冷卻后的混合物濃縮，用甲苯稀釋，然后經(jīng)硅藻土(kiesulguhr)過濾。結(jié)合的濾液和甲苯經(jīng)飽和的碳酸氫鈉水溶液(兩次)和鹽水洗滌，干燥(MgSO4)，蒸發(fā)后得到揮發(fā)油，然后經(jīng)硅膠(2kg，merok9385)柱層析，氯仿洗脫，得到端基異構(gòu)混合物(約1∶1)的油狀物(45.1g)即為標(biāo)題產(chǎn)物;1HNMR(DMSO-d6)3.1-3.3(4H)，3.42(6H)，4.4-4.6(4H)，5.41(1H)，5.46(1H)，5.54(1H)，5.63(1H)，7.46(4H)，7.58(2H)，8.07(4H);γmax(CHBr3)1717.6cm-1。
中間體2(±)-順-1-(2-苯甲?；趸谆?1，3-氧硫環(huán)戊烷基-5-基)-(1H)-嘧啶-2，4-二酮將尿嘧啶細粉(9.62g)、六甲基乙硅烷(50ml)和硫酸銨(30mg)混合物在氮氣環(huán)境中加熱回流直到獲得透明溶液，冷卻并蒸發(fā)得有色油狀物，在氮氣環(huán)境中溶于100毫升乙腈。將該溶液加到冰冷攪拌的5-甲氧基-1，3-氧硫環(huán)戊烷基-2-甲醇苯甲酸酯(中間體1)(19.43g)的乙腈溶液(600ml)中并加入三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸鹽(14.7ml)，移去冰浴并將溶液在氮氣環(huán)境下加熱回流45分鐘，冷卻并蒸發(fā)后，殘渣用氯仿/甲醇/9∶1從1千克硅膠(Merck9385)的柱層析上洗脫而得到純化。適當(dāng)餾分被冷卻并蒸發(fā)得到粗品，經(jīng)最小量的熱甲醇(L，1200ml)分步結(jié)晶得到白色結(jié)晶狀的標(biāo)題化合物(6.32g)。1HNMR(d6DMSO)δ11.36(1H，bs)，7.50-8.00(6H，m)，6.20(1H，t)，5.46(2H，m)，4.62(2H，m)，3.48(1H，m)，3.25(1H，m)。
中間體3(±)-(順)-4-氨基-1-(2-苯甲酰基氧基甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷基-5基)-(1H)-嘧啶-2-酮方法(a)將胞嘧啶(20.705g)和硫酸銨(幾mg)的六甲基二硅烷混懸液(110ml)在氮氣環(huán)境中攪拌并加熱回流2 1/2 小時，蒸去溶劑，并將固體殘渣溶于無水乙腈(350ml)中，在氮氣環(huán)境中采用撓性針狀技術(shù)(flexibleneedle techniques)移入攪拌的冰冷的5-甲氧-1，3-氧硫環(huán)戊烷基-2-甲醇苯甲酸酯(中間體1)(43.57g)的乙腈溶液中(650ml)，并加入三甲基甲硅烷基三氟甲烷磺酸鹽(33ml)，將溶液恢復(fù)到環(huán)境溫度(1/2小時)，然后加熱回流過夜。該殘余混合物經(jīng)濃縮，用碳酸氫鈉的飽和水溶液(500ml)稀釋，然后用乙酸乙酯(3×500ml)提取3次，合并的提取液用水(2×25ml)和鹽水(250ml)洗滌，干燥(MgSO4)，然后蒸發(fā)得泡沫狀物經(jīng)硅膠(600g，Merk 7734)柱層析，用乙酸乙酯-甲醇混合物洗脫，得到端基異構(gòu)混合物(約1∶131.59g)，該混合物經(jīng)水(45ml)和乙醇(9.0ml)結(jié)晶得到固體物(10.23g)，再經(jīng)乙醇(120ml)和水(30ml)重結(jié)晶得到白色固體(9.26g)即標(biāo)題產(chǎn)物;λmax(MeOH)229.4mm(E1%1cm610);272.4mm(E1%1cm293);1HNMR(DMSOd6)δ3.14(1H)，3.50(1H)，4.07(2H)，5.52(1H)，5.66(1H)，6.28(1H)，7.22(2H)，7.56(2H)，7.72(2H)，8.10(2H)。
方法(b)將三氯氧化磷(7.0ml)滴加到攪拌的、冰冷的1，2，4-三唑(11.65g)的乙腈混懸液(120ml)中，保持內(nèi)部溫度低于15℃，再滴加三乙基氨(22.7ml)，10分鐘后，緩慢加入(±)-順-1-(2-苯甲?；趸谆?1，3-氧硫環(huán)戊烷基-5基)-(1H)-嘧啶-2，4-二酮(中間體2)(6.27g)的乙腈溶液(330ml)，在室溫下繼續(xù)攪拌過夜，混合物通過冰浴的方式冷卻并緩慢加入三乙基氨后(30ml)，再加入水(21ml)，將所得溶液蒸發(fā)，殘渣在飽和的碳酸氫鈉水溶液(400ml)和氯仿(3×200ml)間進行分配，合并所得氯仿提取物，經(jīng)硫酸鎂干燥，過濾并蒸干得到粗品(9.7g)，粗品溶于1，4-二噁烷(240ml)并加入濃氨水(比重0.880，50ml)，經(jīng)1 1/2 小時后，將溶液蒸干并將殘渣溶于甲醇，濾掉固體沉淀物，母液硅膠(Merk 9385，600g)柱層析純化，適當(dāng)餾分經(jīng)沉集和蒸干得到淺黃褐色固體(2.188g)的標(biāo)題化合物，獲得與方法(a)所得到的相同的物質(zhì)。
中間體4(±)-(順)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷基-5基)-(1H)-嘧啶-2-酮將(順)-4-氨基-1-(2-苯甲?；趸谆?1，3-氧硫環(huán)戊烷基-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(中間體3)(8.19g)和陰離子交換樹脂-400(OH)(8.24g)的甲醇(250ml)混懸液攪拌并加熱回流1 1/4 小時，濾去固體物質(zhì)并用甲醇洗滌，合并的濾液蒸干，殘渣經(jīng)乙酸乙酯(800ml)研制，經(jīng)過濾而收集的白色固體得到標(biāo)題產(chǎn)品(5.09g)。1HNMR(DMSO-d6)3.04(1H)，3.40(1H)，3.73(2H)，5.29(1H)，5.73(1H)，6.21(1H)，7.19(2H)，7.81(1H)。
實施例1(-)-順-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷基-5基)-(1H)-嘧啶-2-酮(ⅰ)用從營養(yǎng)瓊脂盤上刮得的大腸肝菌(ATCC 23848)接種三個50毫升燒瓶的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(oxiod Ltd.)。燒瓶在以250轉(zhuǎn)/分鐘振搖下37℃培養(yǎng)過夜，然后用每個燒瓶在7升的發(fā)酵桶中用于接種4升的CDD培養(yǎng)基(谷氨酸3g/L;MgSO40.2g/L;K2SO42.5g/L;NaCl2.3g/L;Na2HPO4·2H2O1.1g/L;NaH2PO4·2H2O0.6g/L;胞嘧啶核苷1.2g/L)，該培養(yǎng)物在750轉(zhuǎn)/分，37℃溫度、4升/分鐘通氣下發(fā)酵。生長24小時后的細胞經(jīng)離心(5000g，30分鐘)收集，濕重產(chǎn)量72克。細胞片再次混懸于300毫升的20mm的三羥甲基氨基甲烷鹽酸(TrisHCl)緩沖液(PH7.5)中并經(jīng)超聲處理破碎(4×45秒)，經(jīng)離心(30，000g，30分鐘)去除細胞碎片并經(jīng)加入75%飽和的硫酸銨沉淀上清液中的蛋白質(zhì)。經(jīng)離心(30，000g，30分鐘)收集沉淀物并將其再次混懸于25毫升含有硫酸銨(75%飽和)的HEPES緩沖液中(100mm，PH7.0)，經(jīng)在2，000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘制得酶液，棄去上清液并將下層片溶于TrisHCl緩沖液(PM，7.0，100mM)到原體積。
(ⅱ)中間體4(115mg)溶于水中(100ml)，并攪拌，加入酶液(0.5ml)，混合物經(jīng)續(xù)加HCl(25mM)而維持恒定的PH，由手征性HPLC監(jiān)測轉(zhuǎn)變情況，表明其中底物的右旋對映物被優(yōu)先脫去氨基，22小時后，底物的右旋對映物(保留時間12.5分鐘)已完全被消除，續(xù)加入濃氫氧化鈉將溶液PH調(diào)到10.5。
上述得到的溶液通過季胺乙基交聯(lián)葡聚糖預(yù)平衡PH11柱(A25，pharmacia 30×1.6cm)洗脫，用水(200ml)和HCl(0.1M)先后洗滌柱子，收集餾分(40ml)，并經(jīng)反相HPLC分析，將含有未反應(yīng)的底物左旋對映體的餾分5-13合并并用HCl調(diào)PH為7.5，含有脫氨產(chǎn)物的餾分47用稀NaOH調(diào)PH到7.5。經(jīng)手征性HPLC分析表明被檢測的材料是由一個對映體(保留時間10.2分鐘)為主要成分和其它對映體(保留時間8.5分鐘)為次要組分組成(相差約90%)的混合物。
(ⅲ)上述步驟(ⅱ)在大規(guī)模下進行重復(fù)，溶于250毫升水的實施例1化合物(363mg)用步驟(ⅰ)中所制得的酶溶液(0.5ml)進行培養(yǎng)，分別在18和47小時時加入等量(0.5ml)的酶液。反應(yīng)混合物攪拌70小時，然后放置64小時，經(jīng)手征性HPLC分析，表明底物的右旋對映體已完全被脫去氨基，將所得溶液的PH用NaOH調(diào)到10.5。
將上述溶液裝于同樣的季胺乙基(OAE)柱上，并如步驟(ⅰ)的方法洗脫，將含有殘余底物和脫氨產(chǎn)物的餾分2-6合并，含有殘余底物(左旋對映體)的餾分7-13被合并并調(diào)PH至7.5，含有脫氨基產(chǎn)物的餾分25-26被合并并中和。
將上述餾分2-6在同樣的季胺乙基柱上重新洗脫，此次洗脫后的餾分3-11包含未反應(yīng)成分(左旋對映體)，餾分70包含脫氨基產(chǎn)物。
(ⅳ)將步驟(ⅱ)和(ⅲ)中餾分分離物合并并調(diào)PH為7.5，此溶液通過填充在水中的XAD-16(40×2.4cm)柱被洗脫，該柱用水洗，然后用丙酮∶水(1∶4v/v)洗脫，將含有所需的左旋對映體的餾分合并并冷凍干燥得白色粉末(190mg)。
使用上述HPLC方法如下1、反相HPLC分析柱基本柱體Spherisorb ODS-2(5μm)150×4.6mm
洗脫劑磷酸二氫銨(50mM)+5%甲氰流速1.5毫升/分鐘檢測UV270nm保留時間BCH189 5.5分鐘脫氨基BCH-189 8.1分鐘2、手征性HPLC分析柱環(huán)鍵Ⅰ乙酰基(Cycloband Ⅰ Acetyl)250×4.6mm洗脫劑0.2%三乙基乙酸胺(PH7.2)流速1.0毫升/分鐘檢測UV270nm保留時間BCH189 11.0和12.5分鐘脫氨基BCH-189 8.5和10.2分鐘(生物轉(zhuǎn)化之后監(jiān)測在12.5分鐘峰值的衰減并收集10.2分鐘產(chǎn)品)。
實施例23.1 單獨或組合的抗病毒活性首先將化合物以兩倍遞減的方式嚴格稀釋在96-孔微量滴定板中，將每個化合物的單一或組合物的稀釋液的25毫升等分試樣混合而制得滴定方格盤(最終體積為50毫升的新的96-孔微量滴定板)。用HIV-1RF株以2×10-3moi/細胞的感染劑量感染RPMI1640生長培養(yǎng)基中的MT-4細胞等份試樣(106細胞/ml)。病毒在室溫下被吸附90分鐘之后將細胞在RPMI1640生長培養(yǎng)基中洗滌除去未吸收的病毒，再次以106細胞/毫升混懸于RPMI1640生長培養(yǎng)基中，將50毫升感染細胞混懸液在含有化合物或僅含有生長培養(yǎng)基的孔中接種。將50毫升假性感染細胞的混懸液在未含化合物的孔中接種，該板在37℃、5%二氧化碳/空氣下培養(yǎng)7天。
培養(yǎng)后，將所有的孔中加入7.5毫克/毫升的3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四吡咯溴化物(MTT)10毫升并將此板在37℃下進一步培養(yǎng)90分鐘，然后加入150毫升10%(V/V)的Tritonx-100的異丙醇溶液而使細胞混懸。室溫下15分鐘后，該板在405nm波長處經(jīng)Mutiskan MC(Flow labora tories，Irvine Uk)讀數(shù)器分析，黃色MTT轉(zhuǎn)化為其甲
衍生物在未感染未處理細胞中最多，在未處理感染細胞中沒有。
繪制關(guān)于各個單一化合物(Ic50%值)的量效曲線和各個化合物在第二個化合物固定濃度下雙向滴定的量效曲線，并繪制所有有Ic50%值的化合物組合物的(isobolograms)量效曲線。


圖1-5是3TC分別與AZT、ddc、ddI、Ro31-8959及R-82150(TIBO)組合的isobolograms。如果化合物組合物的Ic50%值落在其自身單一化合物的Ic50%線上，那么兩個化合物的作用是相加的;如果組合物的Ic50%落在線的左邊，化合物的作用是協(xié)同的。
3TC與AZT、ddc、ddI、Ro31-8959及R-82150(TIBO)組合的量效曲線分別可見圖1-5。
當(dāng)檢測組合物的抗病毒活性時，沒有發(fā)現(xiàn)毒副作用。
實施例3單一化合物和其組合物的細胞毒性在這些實驗中，3TC、AZT及ddc的單一化合物及其組合物(mg/ml比例為1∶1、1∶5和5∶1)的細胞毒性在未感染外周血液淋巴細胞(PBL)和確定的T-淋巴細胞系進行比較。
使用[3H]-胸苷吸收檢測裝置來測量細胞毒性，由單一化合物或1∶1組合在PBL細胞中獲得的典型的量效曲線可見圖6和7。
權(quán)利要求
1.一種組合物，包含一個結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的化合物
或其藥物制劑上可接受的衍生物和一個HIV復(fù)制抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所要求的組合物，其中結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的化合物是(2R，順)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷基-5基)-1H-嘧啶-2-酮(3TC)或其藥物上可接受的鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所要求的組合物，其中3TC基本上不含有結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物的相應(yīng)右旋對映體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一個所要求的組合物，其中HIV復(fù)制抑制劑是一種HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一個所要求的組合物，其中抑制劑選自3′-疊氮基-3′-脫氧胸腺嘧啶核苷(AZT)，2′，3′-脫氧次黃苷(ddI)，N-芐基-3[4a(s)，8a(s)-3(s)-(叔-丁基氨基甲?；?十氫異喹啉基-2-基]-2(R)-羥丙基]-N″-(喹啉基-乙基-氨基甲酰基)-L-天門冬酰胺(RO31-8959)和[+)-S-4，5，6，7-四氫-5-甲基-6-(3-甲基-2-丁烯基)-咪唑并(4，5，1-jk)(1，4)-苯并二氮雜
-2(1H)硫酮(R-82913，TIBO)或其藥物制劑上可接受的衍生物。
6.一種組合物，包含(2R，順)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷基-5-基)-1H-嘧啶-2-酮(3TC)或其藥物制劑上可接受的衍生物和3′-疊氮基-3′-脫氧胸腺嘧啶核苷或其藥物制劑上可接受的衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一個所要求的組合物，其中結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物與HIV復(fù)制抑制劑的比例是從250∶1到1∶250(重量)。
8.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1中所定義的結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物或其藥物制劑上可接受的衍生物和一種HIV復(fù)制抑制劑及其藥物制劑上可接受的載體。
9.一種用于治療哺乳動物包括人患有或易受HIV感染的方法，包括權(quán)利要求1中所定義的結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物或其藥物制劑上可接受的鹽與一種HIV復(fù)制抑制劑的聯(lián)合使用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所要求的方法，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物與HIV復(fù)制抑制劑是同時使用。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所要求的方法，結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物與HIV復(fù)制抑制劑是相繼使用的。
12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任何一個所要求的方法，其中結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)化合物為(2R，順)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷基-5-基)-1H-嘧啶-2-酮(3TC)。
13.根據(jù)權(quán)利要求9-12中任何一個所要求的方法，其中HIV復(fù)制抑制劑選自3′-疊氮基-3′-脫氧胸腺嘧啶核苷和2′，3′-脫氧次黃苷。
全文摘要
組合物包括結(jié)構(gòu)(I)化合物?；蚱渌幬镏苿┥峡山邮艿难苌锖鸵环NHIV復(fù)制抑制劑，藥物組合物及其用于治療HIV感染的方法。
文檔編號A61K45/06GK1068570SQ9210455
公開日1993年2月3日 申請日期1992年5月15日 優(yōu)先權(quán)日1991年5月16日
發(fā)明者J·M·卡梅倫, N·坎馬克 申請人:格拉克索公司