專(zhuān)利名稱(chēng):含有包含在脂質(zhì)體中的調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有包含在脂質(zhì)體中的調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的藥物，更具體而言，涉及治療過(guò)敏性疾病、自身免疫疾病等免疫疾病的藥物。
背景技術(shù)：
免疫疾病是指過(guò)敏性疾病、自身免疫疾病、移植物抗宿主病(GVHDgraft-versus-host disease)等由于免疫系統(tǒng)異?；蛎庖呦到y(tǒng)不適所引起的疾病。
已報(bào)道其中過(guò)敏性疾病患者有逐年增加的趨勢(shì)，患有某種過(guò)敏性疾病的日本國(guó)民已達(dá)70％。眾所周知，過(guò)敏性疾病的范圍很廣，包括哮喘、特應(yīng)性皮炎、花粉癥、食物過(guò)敏、皮膚過(guò)敏等各種疾病，并且大多數(shù)過(guò)敏患者連鎖并發(fā)稱(chēng)為過(guò)敏進(jìn)程(allergy march)的各種過(guò)敏性疾病。另外，近年來(lái)在日本并發(fā)過(guò)敏性鼻炎或過(guò)敏性結(jié)膜炎的花粉癥或小兒特應(yīng)性哮喘的患者急劇增加，其理由被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)形成的嬰幼兒時(shí)期的生活環(huán)境特別是免疫學(xué)環(huán)境的改變(細(xì)菌感染減少、氣密性高的住房中室塵濃度增大)提高了IgE抗體的產(chǎn)生。很顯然，狹義上稱(chēng)為過(guò)敏性疾病的過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎、特應(yīng)性哮喘是由IgE抗體及誘導(dǎo)其產(chǎn)生的Th2細(xì)胞相關(guān)的I型過(guò)敏反應(yīng)所引起的。另外，已有很多報(bào)道表明在除此之外的各種過(guò)敏性疾病中IgE抗體或Th2的優(yōu)勢(shì)與發(fā)病階段密切相關(guān)?；谝陨鲜聦?shí)，推測(cè)抑制控制I型過(guò)敏反應(yīng)的IgE抗體的產(chǎn)生以及抑制Th2分化是過(guò)敏性疾病治療法的有效手段。針對(duì)今后預(yù)期會(huì)進(jìn)一步增加的過(guò)敏患者而言，采用基于過(guò)敏發(fā)病機(jī)理制備的藥物的病因療法或使過(guò)敏防患于未然的預(yù)防法(疫苗)被認(rèn)為是有效的，這其中有必要保證較高的安全性(副作用低)。
已揭示出人源化抗IgE抗體(rhuMAb-E25、Genentech Inc.)在以特應(yīng)性哮喘患者為對(duì)象的臨床治療中具有高的有效性(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。在使用人工化合物抑制抗原特異性IgE抗體產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)中，在用整合了柳杉花粉抗原Cryjl基因的質(zhì)粒DNA免疫的BALB/c小鼠中引起了Th1型的免疫應(yīng)答，其結(jié)果是產(chǎn)生了IgG2a抗體，即使用Cryjl抗原和氫氧化鋁(alum)進(jìn)行加強(qiáng)免疫，IgG1和IgE抗體的產(chǎn)生也被抑制(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。另?yè)?jù)報(bào)道，在用OVA-IL-12融合蛋白免疫小鼠時(shí)也會(huì)引起OVA特異性Th1型免疫應(yīng)答，其效率遠(yuǎn)比用OVA和IL-12的混合液免疫時(shí)的效率要好，使得產(chǎn)生OVA特異性IgG2a抗體(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。該報(bào)告顯示可能出現(xiàn)由于抗原和細(xì)胞因子誘導(dǎo)因子復(fù)合體的免疫的Th1偏向，并抑制與之相伴的IgE抗體的抗原特異性的產(chǎn)生。
另外，為了預(yù)防和緩解過(guò)敏性疾病，對(duì)抑制產(chǎn)生Th或和產(chǎn)生IgE抗體的B細(xì)胞的分化增殖以及機(jī)能的調(diào)節(jié)性細(xì)胞的控制成為有效的手段。NKT細(xì)胞被認(rèn)為是在排除癌細(xì)胞、寄生蟲(chóng)或和原蟲(chóng)，以及李斯特菌或結(jié)核菌等細(xì)胞內(nèi)感染細(xì)菌中起著重要作用的調(diào)節(jié)性細(xì)胞(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。已表明，NKT細(xì)胞為中度表達(dá)T細(xì)胞受體(TCR)的中間TCR細(xì)胞(TCRint細(xì)胞)，在表現(xiàn)出大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)樣的形態(tài)、組成性表達(dá)IL-2Rβ鏈和在具有穿孔素顆粒等方面為與自然殺傷(NK)細(xì)胞相似的細(xì)胞，但在具有TCR方面是與NK細(xì)胞完全不同的細(xì)胞群(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)5)。Vα14+NKT細(xì)胞為上述NKT細(xì)胞的一種亞型，大多數(shù)Vα14+NKT細(xì)胞表達(dá)Vα14Jα281mRNA，并將其作為T(mén)CRα鏈。與小鼠α14Jα281鏈相同的人同源物Vα24JaQ鏈在健康個(gè)體的外周血液中的CD4-/CD8-T細(xì)胞中存在20-50％(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。
由于這些NKT細(xì)胞的配體化合物α-半乳糖神經(jīng)酰胺可誘導(dǎo)IFN-γ和IL-4兩種細(xì)胞因子產(chǎn)生，因此NKT細(xì)胞被認(rèn)為是Th1/Th2分化的調(diào)節(jié)細(xì)胞(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)。已知若將α-半乳糖神經(jīng)酰胺給予C57BL/6小鼠，由DNP-OVA和氫氧化鋁引起的IgE抗體的產(chǎn)生就會(huì)被抑制，在使用Vα14-NKT細(xì)胞缺失小鼠的相同實(shí)驗(yàn)中，未觀察到IgE抗體產(chǎn)生被抑制(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)8)。另外，由于在給予I型糖尿病模型NOD小鼠α-半乳糖神經(jīng)酰胺的實(shí)驗(yàn)中觀察到癥狀得到改善，因此提示Vα14-NKT細(xì)胞具有增強(qiáng)Th2介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的可能性(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)9)。但是，僅用α-半乳糖神經(jīng)酰胺得到的效果并不理想，需要藥效得到進(jìn)一步的改善。
另一方面也指出，盡管β-半乳糖神經(jīng)酰胺和β-葡糖神經(jīng)酰胺廣泛存在于生物體內(nèi)，但是與α-半乳糖神經(jīng)酰胺的免疫激活作用或抗腫瘤作用相比，卻只有非常低的活性(參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)10-12、專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。
另外已知NKT細(xì)胞對(duì)自身免疫疾病模型也具有有效的作用(參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)13-16)。因此可以認(rèn)為，若能選擇性增強(qiáng)NKT細(xì)胞的免疫抑制機(jī)能如IL-10的產(chǎn)生，那么不僅僅對(duì)過(guò)敏疾病的治療有效，同時(shí)對(duì)自身免疫疾病或GVHD等其他免疫疾病的治療也有效。但是，單獨(dú)地能選擇性增強(qiáng)NKT細(xì)胞的免疫抑制機(jī)能的配體尚不為人所知。另外，尚沒(méi)有人基于此目的使用脂質(zhì)體。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1特開(kāi)平1-93562號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1Immunopharmacology，48307(2000)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2Immunology，99179(2000)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3J.Immunol.，1584137(1997)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4Clin.Immunol.，28，1069(1996)非專(zhuān)利文獻(xiàn)5J.Immunol.，155，2972(1995)非專(zhuān)利文獻(xiàn)6J.Exp.Med.182，1163(1995)非專(zhuān)利文獻(xiàn)7Nakayama.T.，et al.，Int Arch Allergy Immunol 124，38-42(2001)非專(zhuān)利文獻(xiàn)8J.Exp.Med.，190，783-7921999非專(zhuān)利文獻(xiàn)9Nat.Med.，71052-1056(2001)非專(zhuān)利文獻(xiàn)10Biochem.Biophys.Acta，280，626(1972)非專(zhuān)利文獻(xiàn)11Biochem.Biophys.Acta，316，317(1973)非專(zhuān)利文獻(xiàn)12Biol.Pharm.Bull.，18，1487(1995)非專(zhuān)利文獻(xiàn)13J.Exp.Med.，186677(1997)非專(zhuān)利文獻(xiàn)14J.Immunol.，16662(2001)非專(zhuān)利文獻(xiàn)15J.Exp.Med.，1941801(2001)非專(zhuān)利文獻(xiàn)16Nature，413531(2001)

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的課題是提供以活體內(nèi)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞作為靶標(biāo)的藥物，主要是提供針對(duì)過(guò)敏性疾病、自身免疫疾病等免疫疾病的藥物。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體中含有β-半乳糖神經(jīng)酰胺、α-半乳糖神經(jīng)酰胺等調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的組合物，具有在僅有這類(lèi)化合物的溶液中并不能表現(xiàn)出的對(duì)產(chǎn)生IL-10的T細(xì)胞的誘導(dǎo)作用和抑制IgE抗體產(chǎn)生的作用，并且作為過(guò)敏性疾病等免疫疾病的預(yù)防劑或治療劑是有效的。另外還發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體中含有α-半乳糖神經(jīng)酰胺的組合物通過(guò)選擇性增強(qiáng)NKT細(xì)胞的免疫抑制機(jī)能，能抑制病原性T細(xì)胞的分化增殖，因此，作為自身免疫疾病或移植物抗宿主病的預(yù)防劑或治療劑也是有用的。到此完成本發(fā)明。
或者說(shuō)，本發(fā)明為如下所述(1)含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體作為有效成分的藥物。
(2)(1)的藥物，其中調(diào)節(jié)性細(xì)胞為NKT細(xì)胞。
(3)(1)或(2)的藥物，其中調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體為β-半乳糖神經(jīng)酰胺。
(4)(1)或(2)的藥物，其中調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體為α-半乳糖神經(jīng)酰胺。
(5)(1)～(4)任一項(xiàng)的藥物，其中上述脂質(zhì)體進(jìn)一步含有CpG寡核苷酸或咪喹莫特。
(6)(1)～(5)任一項(xiàng)的藥物，其中上述脂質(zhì)體進(jìn)一步含有過(guò)敏原。
(7)(1)～(6)任一項(xiàng)的藥物，為免疫疾病的預(yù)防劑或治療劑。
(8)(7)的藥物，其中免疫疾病為過(guò)敏性疾病。
(9)(8)的藥物，其中過(guò)敏性疾病為特應(yīng)性支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎、花粉癥或特應(yīng)性皮炎。
(10)(4)的藥物，為自身免疫疾病或移植物抗宿主病的預(yù)防劑或治療劑。
(11)含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體作為有效成分的調(diào)節(jié)性細(xì)胞誘導(dǎo)劑。
圖1示出在BALB/c小鼠脾臟中CD11c+DC培養(yǎng)系統(tǒng)中添加Lipo-β或其它脂質(zhì)體組合物或生理鹽水后，體外產(chǎn)生細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？v軸表示添加之后培養(yǎng)上清中的各種細(xì)胞因子的濃度。
圖2示出在C57BL/6 小鼠脾臟中CD11c+DC培養(yǎng)系統(tǒng)中添加Lipo-β或其它脂質(zhì)體組合物或生理鹽水后，體外產(chǎn)生細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？v軸表示添加之后培養(yǎng)上清中的各種細(xì)胞因子的濃度。
圖3示出在BALB/c小鼠脾臟中CD11c+DC培養(yǎng)系統(tǒng)中添加Lipo-β或其它脂質(zhì)體組合物或生理鹽水后，體外產(chǎn)生細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？v軸表示添加之后培養(yǎng)上清中的IL-10的濃度。
圖4示出用DNP-OVA和氫氧化鋁初次免疫給予Lipo-β或生理鹽水的BDF1小鼠之后，以及僅用DNP-OVA加強(qiáng)免疫之后，用ELISA法測(cè)定血漿中DNP-OVA特異性抗體產(chǎn)生的結(jié)果。
圖5示出給予Lipo-β或生理鹽水(陰性對(duì)照)的BALB/c小鼠第七天的脾臟中CD11c+DC細(xì)胞和DO11.10(OVA特異性TCRαβ轉(zhuǎn)基因)小鼠來(lái)源的CD4+T細(xì)胞在OVA肽存在下培養(yǎng)四天后培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子濃度的測(cè)量結(jié)果。
圖6示出在將圖5的實(shí)驗(yàn)中增殖的細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移到BALB/c小鼠中后，用DNP-OVA和氫氧化鋁免疫第14天的血液中抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果。
圖7示出在C57BL/6小鼠脾臟的全細(xì)胞(上部分)、添加了抗CD1d中和抗體的相同細(xì)胞(下部分)或NKT缺失小鼠脾臟的全細(xì)胞(下部分)的培養(yǎng)液中添加培養(yǎng)液、α-半乳糖神經(jīng)酰胺水溶液(α-GalCer)、對(duì)照脂質(zhì)體組合物(Lipo-(-))或含有α-半乳糖神經(jīng)酰胺的脂質(zhì)體(Lipo-αGC)后體外細(xì)胞因子產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。橫軸表示添加后第2天的培養(yǎng)上清中各種細(xì)胞因子的濃度。
圖8示出將生理鹽水、Lipo-(-)或Lipo-αGC給予C57BL/6小鼠后第3天或第7天，用流式細(xì)胞術(shù)分析脾臟中Vα14-NKT細(xì)胞數(shù)的結(jié)果。橫軸表示FITC標(biāo)記的抗TCRβ抗體的熒光強(qiáng)度，縱軸表示PE標(biāo)記的CD1d四聚體+α-Galcer的熒光強(qiáng)度。
圖9示出在C57BL/6小鼠(上部分)或IL-10基因缺失小鼠(下部分)中給予生理鹽水、α-Galcer、Lipo-(-)或Lipo-αGC后第三天用DNP-OVA和氫氧化鋁免疫，此后，第14天測(cè)定得到的血液中抗DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a的抗體效價(jià)。
圖10示出在給予BDF1小鼠生理鹽水、α-Galcer、Lipo-(-)或Lipo-αGC后第三天(day0)用DNP-OVA和氫氧化鋁免疫，此后，在day55僅用DNP-OVA進(jìn)行加強(qiáng)免疫的實(shí)驗(yàn)中，day0、14、55、64測(cè)定得到的血液中抗DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a的抗體效價(jià)以及IgE、IgG1、IgG2a的總值。
圖11示出在給予BDF1小鼠生理鹽水、α-Galcer、Lipo-(-)或Lipo-αGC后第3天用DNP-OVA和氫氧化鋁免疫，第7天的脾臟CD4+T細(xì)胞與放射線照射的正常BDF1小鼠脾臟全細(xì)胞一起用DNP-OVA或PMA和離子霉素(Ionomycin)刺激48小時(shí)后，用MTT法測(cè)定得到的細(xì)胞增殖能力的結(jié)果。左圖的橫軸和縱軸分別表示DNP-OVA濃度和在波長(zhǎng)570nm的吸光度。
圖12表示給予BALB/c小鼠生理鹽水、α-Galcer、Lipo-(-)或Lipo-αGC后第3天的脾臟中的細(xì)胞用抗CD11c抗體和抗CD45RB抗體染色后，用流式細(xì)胞術(shù)分析得到的結(jié)果。
圖13表示采用圖11的流式細(xì)胞術(shù)分析得到的細(xì)胞數(shù)比值和脾臟的全部細(xì)胞數(shù)相乘得到的CD11clowCD45RBhigh細(xì)胞數(shù)和CD11chighCD45RBlow細(xì)胞數(shù)。
圖14表示給予BALB/c小鼠Lipo-αGC后，第3天從脾臟細(xì)胞分離回收CD11clowCD45RBhigh細(xì)胞和CD11chighCD45RBlow細(xì)胞，用LPS刺激后第2天培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子的測(cè)定結(jié)果。橫軸表示培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子濃度。
圖15表示用OVA323-339肽脈沖的CD11clowCD45RBhigh細(xì)胞或CD11chighCD45RBlow細(xì)胞與DO11.10小鼠脾臟來(lái)源的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，48小時(shí)后用MTT法測(cè)定得到的細(xì)胞增殖能力的結(jié)果。橫軸表示波長(zhǎng)為570nM的吸光度。
圖16表示用OVA323-339肽脈沖的CD11clowCD45RBhigh細(xì)胞或CD11chighCD45RBlow細(xì)胞與DO11.10小鼠脾臟來(lái)源的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，用抗CD4抗體和抗CD25、CD28、CD152、ICOS抗體對(duì)增殖的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的分析結(jié)果。
圖17表示用OVA323-339肽脈沖的CD11clowCD45RBhigh細(xì)胞或CD11chighCD45RBlow細(xì)胞與DO11.10小鼠脾臟來(lái)源的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，用PMA和離子霉素刺激增殖的細(xì)胞后，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的結(jié)果。上部分和下部分分別表示同種型對(duì)照抗體、細(xì)胞因子特異性抗體的細(xì)胞內(nèi)染色模式。
圖18表示給予Lipo-αGC或Lipo-αGC+OVA的BDF1小鼠脾臟來(lái)源的CD4+T細(xì)胞與在體外用同種放射線照射的脾細(xì)胞一起在OVA蛋白質(zhì)存在下培養(yǎng)，第6天用PMA和離子霉素刺激后，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的結(jié)果。上部分和下部分分別表示給予Lipo-αGC的小鼠脾臟來(lái)源的CD4+T細(xì)胞和給予Lipo-αGC+OVA的小鼠脾臟來(lái)源的CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)染色。
圖19表示在用DNP-OVA和氫氧化鋁免疫BDF1小鼠后第21、28、35天給予單獨(dú)的脂質(zhì)體(載體)、Lipo-αGC或Lipo-αGC+OVA，此后，第42天僅用DNP-OVA抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫，第48天測(cè)定得到的血液中抗DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a抗體效價(jià)(上部分)和IgE、IgG1、IgG2a總值(下部分)。*，p＜0.05；**，p＜0.005；***，p＜0.00具體實(shí)施方式
在本說(shuō)明書(shū)中，所述“調(diào)節(jié)性細(xì)胞”是指NKT細(xì)胞(自然殺傷T細(xì)胞)、產(chǎn)生IL-10的Tr1細(xì)胞、DC細(xì)胞(樹(shù)突細(xì)胞)等，其中特別優(yōu)選NKT細(xì)胞。
所述“調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體”沒(méi)有特別的限制，只要它能夠與上述調(diào)節(jié)性細(xì)胞的細(xì)胞表面受體相結(jié)合，促進(jìn)該調(diào)節(jié)性細(xì)胞的分化增殖或活化，如下文所列舉的物質(zhì)。但是，調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體不僅限于此。
(i)NKT細(xì)胞的配體α-半乳糖神經(jīng)酰胺、β-半乳糖神經(jīng)酰胺等半乳糖神經(jīng)酰胺類(lèi)；(ii)對(duì)調(diào)節(jié)性樹(shù)突細(xì)胞(DC)的分化增殖起作用的維生素D3、地塞米松、TGF-β、IL-10等；(iii)對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化增殖起作用、誘導(dǎo)IL-10或FoxP3等表達(dá)的物質(zhì)。
本發(fā)明所述的“調(diào)節(jié)性細(xì)胞誘導(dǎo)劑”是指誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性細(xì)胞的分化增殖或活化的藥劑。調(diào)節(jié)性細(xì)胞的分化增殖或活化的促進(jìn)可通過(guò)例如下述方法確定如實(shí)施例所示，使用脾臟CD11c+DC等，可以對(duì)其中所含有的NKT細(xì)胞和產(chǎn)生IL-10的Tr1細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行測(cè)定，也可以對(duì)由NKT細(xì)胞和產(chǎn)生IL-10的Tr1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-10、IL-4等)進(jìn)行定量。
本發(fā)明所述“含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體”優(yōu)選可誘導(dǎo)作為調(diào)節(jié)性細(xì)胞的NKT細(xì)胞和產(chǎn)生IL-10的Tr1細(xì)胞，還具有抑制輔助T細(xì)胞活化的活性，并且具有抑制B細(xì)胞釋放IgE抗體產(chǎn)生的作用。具體而言，脂質(zhì)體中含有上述“調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體”，其中優(yōu)選的是在脂質(zhì)體的雙層脂質(zhì)膜內(nèi)含有α-半乳糖神經(jīng)酰胺或β-半乳糖神經(jīng)酰胺的組合物。此外，本發(fā)明的“含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體”也可以含有2種以上“調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體”。
本發(fā)明所述“含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體”除含調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體外，還可含有TLRs(Toll樣受體)家族配體類(lèi)物質(zhì)。通過(guò)添加TLRs家族配體類(lèi)物質(zhì)，能增加調(diào)節(jié)“調(diào)節(jié)性細(xì)胞”作用的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，更能提高效果。TLRs家族配體類(lèi)物質(zhì)可為CpG寡核苷酸(CpGODN)咪喹莫特(imiquimod1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺，1-(2-methylproryl)-1H-imidazo[4，5-c]quinolin-4-amine)等。
此外，所述“含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體”還可含有過(guò)敏原。過(guò)敏原是引起過(guò)敏的物質(zhì)，優(yōu)選為花粉抗原或螨抗原。具體而言，過(guò)敏原可為OVA(卵白蛋白)。
本發(fā)明提供包括作為水溶性高分子物質(zhì)的上述調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體、優(yōu)選半乳糖神經(jīng)酰胺等脂溶性化合物的脂質(zhì)體。
在本發(fā)明書(shū)中，微團(tuán)(由含有親水性區(qū)域和疏水性區(qū)域的兩親性分子凝集得到的水溶性顆粒)是具有封閉的囊泡結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，被稱(chēng)為脂質(zhì)體。脂質(zhì)體組分可為用現(xiàn)有的方法能形成囊泡的兩親性分子中的任何物質(zhì)，優(yōu)選脂質(zhì)。在本發(fā)明中，脂質(zhì)為例如二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等磷脂、神經(jīng)鞘脂等脂質(zhì)、甘油糖脂等，可將一種或兩種以上這類(lèi)物質(zhì)用于脂質(zhì)體的制備，或者將其與脂質(zhì)衍生物等組合用于脂質(zhì)體的制備，該脂質(zhì)衍生物是膽固醇等非極性物質(zhì)或聚乙二醇等水溶性高分子結(jié)合在脂質(zhì)上所形成的物質(zhì)。
脂質(zhì)體可用公知的方法制備。例如可采用記載在《脂質(zhì)體技術(shù)》(Liposome Technology，vol.1，2ndedition(by Gregory Gregoriadis(CRC Press，Boca Raton，Ann Arbor，London，Tokyo))第4章第67-80頁(yè)，第10章第167-184頁(yè)和第17章第261-276頁(yè)(1993)中的方法。更具體而言，例如超聲處理法、乙醇注入法、French壓力法、乙醚注入法、膽酸法、鈣融合法、凍融法、反相蒸發(fā)法等，但不限于此。本發(fā)明的脂質(zhì)體的大小并沒(méi)有特別的限制，通常優(yōu)選平均為100～200nm，更優(yōu)選100-150nm。脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)也沒(méi)有特別的限定，單層、多層等任何脂質(zhì)體均可。在脂質(zhì)體的內(nèi)部所含有的溶液，除水之外，可以使用緩沖液、生理鹽水等。也可在其中添加適量的水溶性有機(jī)溶劑(例如丙三醇等)使用。
此外，為了將“含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體”靶向到目標(biāo)位置，也可以將本發(fā)明的藥物中所使用的脂質(zhì)體的表面進(jìn)行修飾。目標(biāo)位置為例如肝臟、脾臟、淋巴結(jié)、骨髓、肺、眼、皮膚、眼、鼻等。
修飾脂質(zhì)體表面的物質(zhì)可為低分子化合物、高分子化合物、核酸、肽、蛋白質(zhì)、糖鏈等。高分子化合物可為聚乙二醇等(參見(jiàn)例如特許第2948246號(hào))。核酸可為例如識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞Toll樣受體TLR-7或TLR-9的單鏈RNA或單鏈DNA以及這些核酸的衍生物等。蛋白質(zhì)可為例如識(shí)別在抗原提呈細(xì)胞樹(shù)突細(xì)胞(DC)或其前體細(xì)胞等目標(biāo)細(xì)胞表面特異性表達(dá)的分子的抗體或受體等。用糖鏈修飾包括使用能與在DC細(xì)胞表面表達(dá)的甘露糖受體相結(jié)合的甘露糖結(jié)合脂質(zhì)的修飾等(參見(jiàn)例如Copland，M.J.，et al.，(2003)Liposome delivery of antigento human dendritic cells，Vaccine，21883-890)。
將配體裝入脂質(zhì)體可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行。例如，如實(shí)施例所示，將脂質(zhì)體成分和配體分別溶解到有機(jī)溶劑中，然后將其混合，通過(guò)加水就可得到含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體。但是，含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體的制備方法不限于上述方法。
“含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體”可作為藥物的有效成分使用。
也就是說(shuō)，由于“含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體”可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性細(xì)胞NKT或產(chǎn)生IL-10的Tr1細(xì)胞、具有抑制輔助T細(xì)胞活化的活性，并且具有抑制從B細(xì)胞釋放IgE抗體產(chǎn)生的作用，因此本發(fā)明的藥物作為IgE抗體所引起的過(guò)敏性疾病的預(yù)防劑或治療劑是有效的。IgE抗體與過(guò)敏性疾病的關(guān)系特別密切，通過(guò)對(duì)其產(chǎn)生(分泌)進(jìn)行抑制，能獲得對(duì)I型過(guò)敏性疾病的預(yù)防或治療效果。與IgE抗體相關(guān)的過(guò)敏性疾病包括特應(yīng)性支氣管哮喘、特應(yīng)性皮炎以及過(guò)敏性鼻炎或花粉癥等過(guò)敏性鼻炎。此外，在本發(fā)明中，過(guò)敏性疾病的預(yù)防不僅包括使包括未患過(guò)敏性疾病的人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物不患該疾病，并且還包括暫時(shí)未出現(xiàn)癥狀的過(guò)敏性疾病患者(包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物)中也不出現(xiàn)該癥狀。
另外，由于“含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體”具有抑制T細(xì)胞活化的作用，因此本發(fā)明的藥物作為暴發(fā)性肝炎等疾病的預(yù)防劑或治療劑也是有效的。
另外，由于含有α-半乳糖神經(jīng)酰胺的脂質(zhì)體具有選擇性增強(qiáng)NKT細(xì)胞的免疫抑制機(jī)能的效果，因此含有作為有效成分的脂質(zhì)體的藥物作為具有免疫抑制能力的藥物也是有效的，該脂質(zhì)體含有α-半乳糖神經(jīng)酰胺。具體而言，作為針對(duì)風(fēng)濕病、多發(fā)性硬化癥、全身性紅斑狼瘡、膠原病等自身免疫疾病的藥物，或者作為針對(duì)移植時(shí)出現(xiàn)的排異反應(yīng)等GVHD的藥物是有效的。
此外，α-半乳糖神經(jīng)酰胺沒(méi)有特別的限制，只要它能夠結(jié)合NKT細(xì)胞表面受體、選擇性增強(qiáng)NKT細(xì)胞的免疫抑制機(jī)能，優(yōu)選結(jié)合在人中由Vα24JαQ、在小鼠中由Vα14Jα281構(gòu)成的受體，分子量?jī)?yōu)選400～2000。
另一方面，本發(fā)明中所用的β-半乳糖神經(jīng)酰胺優(yōu)選分子量為400～2000。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了含有將米喹莫特的脂質(zhì)體作為有效成分的藥物。由于脂質(zhì)體中含有米喹莫特，與單獨(dú)使用米喹莫特時(shí)相比，IL-10和IFN-α等的產(chǎn)量上升，由此NKT細(xì)胞被活化。因此，含有米喹莫特的脂質(zhì)體作為有效成分的藥物作為預(yù)防或治療上述過(guò)敏性疾病的藥物是有用的。
作為本發(fā)明的藥物的給予途徑，口服給予和非口服給予均可，由臨床醫(yī)生適當(dāng)選擇。另外，可單獨(dú)或與通常使用的載體一起給予有效成份“含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體”。
口服給予本發(fā)明的藥物時(shí)，藥物的形態(tài)可為片劑、包被片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑等固體制劑，液劑(如滴眼劑、點(diǎn)鼻藥等)，懸濁劑、乳劑、糖漿劑等液體制劑、氣霧劑、霧化劑、噴霧劑等吸入劑以及脂質(zhì)體封入劑等。
非口服給予本發(fā)明的藥物時(shí)，藥劑的形態(tài)可為在靜脈注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、肌肉注射以及腹腔內(nèi)注射等中所使用的注射劑(液劑、懸濁劑等)、液劑、懸濁劑、乳劑、點(diǎn)滴劑等。
本發(fā)明的藥物為液體制劑時(shí)，可冷凍保存或通過(guò)冷凍干燥等除去水分保存。冷凍干燥制劑在使用時(shí)加入注射用蒸餾水再次溶解后使用。
本發(fā)明的藥物中所使用的可藥用的載體為例如根據(jù)制劑的使用狀態(tài)通常所使用的結(jié)合劑、分解劑、表面活性劑、吸收促進(jìn)劑、保濕劑、吸附劑、潤(rùn)滑劑、填充劑、擴(kuò)張劑、付濕劑、防腐劑、安定劑、乳化劑、增溶劑、調(diào)節(jié)滲透壓的鹽、緩沖劑等稀釋劑或賦形劑，這些載體應(yīng)根據(jù)得到的制劑的給藥單位形態(tài)適當(dāng)選擇使用。
進(jìn)一步而言，必要時(shí)本發(fā)明的藥物中還可含有著色劑、防腐劑、香料、調(diào)味劑、甜味劑等其它醫(yī)藥品，可以藥劑方式制備。
技術(shù)人員參照現(xiàn)有的技術(shù)可很容易地決定“含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體”的有效量，如體重1kg為0.1-100mg，優(yōu)選1-10mg，可將其在1天里分1到3次給予，優(yōu)選根據(jù)各種制劑的形態(tài)、患者的性別、年齡、疾病程度作適合調(diào)整。
實(shí)施例以下通過(guò)列舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明并不由這些實(shí)施例作任何限制，因此無(wú)需說(shuō)明在本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域：
里能進(jìn)行常規(guī)改變。
實(shí)施例1《含有配體的脂質(zhì)體的制備和活性測(cè)定》1.含有β-半乳糖神經(jīng)酰胺的脂質(zhì)體(Lipo-β)的制備將L-α-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，和光純藥#166-16183)0.77mg、3β-N-(二甲基氨乙基)鹽酸碳酸酯-膽固醇(DC-Chol，cholesteryl3β-N-(dimethylaminoethyl)carbonate hydrochloride，SIGMA-Aldrich)0.83mg、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](1，2-distearoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(polyethylene glycol)-2000]，AVANTI POLAR-LIPIDS，INC.#i88653)0.0029mg溶解在250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。再將β-半乳糖神經(jīng)酰胺(Ceramide β-D-galactoside，Sigma-Aldrich#C4905)0.16mg溶解在另外250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。然后，將兩者混合、用蒸發(fā)器干燥后，在真空干燥器內(nèi)干燥一晚上。然后添加800μl水，置于超聲破碎裝置中處理1分鐘后，用擠壓機(jī)(AVESTIN；LiposoFast-Basic)通過(guò)加壓過(guò)濾制備成顆粒，用孔徑為0.22μm的膜滅菌。該脂質(zhì)體組合物(Lipo-β)的最終濃度為200μl/ml。用相同的方法制備不含β-半乳糖神經(jīng)酰胺的脂質(zhì)體組合物(Lipo-0)。另外，將寡核苷酸CpGODN(1668)(SIGMA GENOSIS制備)以重量比1∶5混合在Lipo-β中之后，過(guò)脫鹽柱NAP-10回收洗脫物L(fēng)ipo-β-CpG。
2.含有米喹莫特的脂質(zhì)體的制備將L-α-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，和光純藥#166-16183)0.77mg、3β-N-(二甲基氨乙基)鹽酸碳酸酯-膽固醇(DC-Chol，SIGMA-Aldrich)0.83mg、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](AVANTI POLAR-LIPIDS，1NC.#i88653)0.029mg溶解在250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。再將米喹莫特(Imiquimod，SequoiaResearch Products Ltd；SRP0058i)0.16mg溶解在另外250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。然后，將兩者混合、用蒸發(fā)器干燥后，在真空干燥器內(nèi)干燥一晚上。然后添加800μl水，置于超聲破碎裝置中處理1分鐘后，用擠壓機(jī)(AVESTIN；LiposoFast-Basic)通過(guò)加壓過(guò)濾制備成顆粒，用孔徑為0.22μm的膜滅菌。該脂質(zhì)體組合物(Lipo-Imq)的最終濃度為200μl/ml。用與制備上述組合物相同的方法再制備含有β-D-半乳糖神經(jīng)酰胺(Sigma-Aldrich#C4905)的脂質(zhì)體組合物(Lipo-Imq-βGC)。另外，將寡核苷酸CpGODN(1668)以重量比1∶5混合在Lipo-Imq中之后，過(guò)脫鹽柱NAP-10回收洗脫物L(fēng)ipo-Imq-CpG。
3.針對(duì)含有配體的脂質(zhì)體的樹(shù)突細(xì)胞(DC)的體外活性測(cè)定在BALB/c或C57BL/6 小鼠的脾臟中注入1mg/ml的膠原酶D(Roche)，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育45分鐘。再將從脾臟中提取的細(xì)胞懸浮于3ml HistoDenz(14.1％，SIGMA)中后，將含有50μM 2-巰基乙醇(2-ME)的X-VIVO 15(Takara Bio公司)覆于其上。1500rpm離心5分鐘后，回收中間層的細(xì)胞，在含有50μM 2ME、0.5％胎牛血清和20ng/ml rmGM-CSF(Pharmingen)的X-VIVO 15培養(yǎng)基中、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1小時(shí)30分鐘。輕輕吹打后，除去未貼壁細(xì)胞，加入含有50μM 2ME、0.5％胎牛血清和20ng/ml rmGM-CSF(Pharmingen)的X-VIVO 15培養(yǎng)基，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18小時(shí)。將未貼壁細(xì)胞回收之后，回收與抗CD11c抗體磁性微球(Miltenyi)結(jié)合的細(xì)胞，此即脾臟CD11c+DC。在將1×104個(gè)CD11c+DC懸浮于200μl含有10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中后，添加最終濃度為1μg/ml脂質(zhì)體組合物，在96孔U底微量培養(yǎng)板中，于37℃、含有5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48小時(shí)后回收培養(yǎng)上清，用ELISA法測(cè)定IFN-α、IL-10、IL-12(圖1、2)。在Lipo-β和Lipo-Imq添加組中，IL-10和IFN-α的產(chǎn)生較高，IL-12的產(chǎn)生較低，相反的是，在Lipo-β-CpG和Lipo-Imq-CpG添加組中，IL-10和IFN-α的產(chǎn)生較低，IL-12的產(chǎn)生較高。另一方面，在非添加組(對(duì)照組)以及Lipo-0或β-半乳糖神經(jīng)酰胺(β-GalCer)溶液添加組中，全部細(xì)胞因子的產(chǎn)生不能檢出或者值較低。另外，用相同的評(píng)估方法測(cè)定在Lipo-Imq-βGC的影響下CD11c+DC產(chǎn)生IL-10的產(chǎn)生能力，結(jié)果表明與僅有Lipo-β或僅有Lipo-Imq相比，具有顯著提高的IL-10產(chǎn)生能力(圖3)。
實(shí)施例2《Lipo-β抑制體內(nèi)IgE抗體產(chǎn)生的效果》以2μg/只的用量腹腔內(nèi)給予BDF1小鼠(5只/組)Lipo-β，第7天(0天)用DNP-OVA 0.1μg(Cosmobio)和氫氧化鋁10mg進(jìn)行初次免疫。初次免疫后第14天眼窩采血，用ELISA法測(cè)定小鼠血漿中的抗DNP-IgG1、-IgE、-IgG2a抗體效價(jià)(圖4中的14天)。然后，在初次免疫后第35天僅用DNP-OVA抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫，此后第7天眼窩采血，用ELISA法測(cè)定血漿中的抗DNP-IgG1、-IgE抗體效價(jià)(圖4的42天)。在Lipo-β給予組中，在14天觀察到對(duì)IgG1抗體和IgE抗體的產(chǎn)生已經(jīng)具有抑制傾向，在加強(qiáng)免疫后的42天IgG1抗體和IgE抗體的增加被完全抑制。
實(shí)施例3《(給予Lipo-β的小鼠來(lái)源樹(shù)突細(xì)胞(DC)對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)作用》
1.體外的T細(xì)胞活化能力的評(píng)價(jià)2μg/只腹腔內(nèi)給予BALB/c小鼠Lipo-β或生理鹽水，7天后取出脾臟。將1mg/ml膠原酶D(Roche)注入脾臟，CO2培養(yǎng)箱中孵育45分鐘。再將從脾臟中提取的細(xì)胞懸浮于3ml HistoDenz(14.1％，SIGMA)中后，將含有50μM 2-巰基乙醇(2-ME)的X-VIVO 15覆于其上。1500rpm離心5分鐘后，回收中間層的細(xì)胞，在含有50μM2ME、0.5％胎牛血清和20ng/ml rmGM-CSF(Pharmingen)的X-VIVO 15培養(yǎng)基中、于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1小時(shí)30分鐘。輕輕吹打后，除去未貼壁細(xì)胞，加入含有50μM 2ME、0.5％胎牛血清和20ng/ml rmGM-CSF(Pharmingen)的X-VIVO 15培養(yǎng)基，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18小時(shí)。將未貼壁細(xì)胞回收之后，回收與抗CD11c抗體磁性微球(Miltenyi)結(jié)合的細(xì)胞，此即脾臟CD11c+DC。用抗體磁性微球(Miltenyi)從OVA特異性TCRαβ轉(zhuǎn)基因DO11.10小鼠(Science，1990，vol.250，p1720；從千葉大學(xué)研究生院醫(yī)學(xué)研究院中山俊憲氏獲得)的脾臟回收CD4+T細(xì)胞。然后將2×104個(gè)CD11c+DC和1×105個(gè)CD4+T細(xì)胞在OVA肽存在下于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4天，然后回收培養(yǎng)上清，用ELISA法測(cè)定IFN-γ、IL-4和IL-10的產(chǎn)量(圖5)。其結(jié)果是在使用給予Lipo-β小鼠脾臟來(lái)源的DC和給予生理鹽水小鼠(正常)脾臟來(lái)源的DC時(shí)，未觀察到IL-4和IFN-γ的產(chǎn)量存在差異，IL-10的產(chǎn)生僅僅在給予Lipo-β小鼠脾臟DC中、OVA肽濃度為3nM和30nM時(shí)才被檢出。另外同時(shí)也確認(rèn)了調(diào)節(jié)性細(xì)胞的增殖情況。
2.通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移法對(duì)體內(nèi)IgE抗體產(chǎn)生的抑制作用的評(píng)價(jià)回收在上述1.的體外實(shí)驗(yàn)中給予Lipo-β的小鼠來(lái)源脾臟DC和在OVA肽濃度為3nM或30nM下增殖的DO11.10-CD4+T細(xì)胞，將1×106個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到BALB/c小鼠(3只/組)的腹腔內(nèi)。此后1個(gè)小時(shí)后，用DNP-OVA(10μg)和氫氧化鋁(10mg)進(jìn)行初次免疫，第14天進(jìn)行眼窩采血。用ELISA法測(cè)定血漿中的抗DNP-IgG1、抗DNP-IgE、抗DNP-IgG2a各自的抗體效價(jià)(圖6)。其結(jié)果是在用濃度為3nM的OVA肽刺激后增殖得到的DO11.10-CD4+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移的小鼠中，IgE抗體的產(chǎn)生被完全抑制。另一方面，在用濃度為30nM的OVA肽刺激后增殖得到的DO11.10-CD4+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移的小鼠中，對(duì)IgE抗體產(chǎn)生的抑制效果較低。另外，對(duì)IgG1抗體和IgG2a抗體的抑制在兩組中均不顯著。
實(shí)施例4《含有配體的脂質(zhì)體的制備和活性測(cè)定》1.含有α-半乳糖神經(jīng)酰胺的脂質(zhì)體的制備將L-α-二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE，和光純藥#166-16183)0.77mg、3β-N-(二甲基氨乙基)鹽酸碳酸酯-膽固醇(DC-Chol，SIGMA-Aldrich#C2832)0.83mg溶解在250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。然后再將α-半乳糖神經(jīng)酰胺(獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所免疫過(guò)敏科學(xué)綜合研究中心制；KRN7000、參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)小冊(cè)子第98/44928號(hào))0.16mg溶解在另外250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。然后，將兩者混合、用蒸發(fā)器干燥后，在真空干燥器內(nèi)干燥一晚上。然后添加800μl水，置于超聲破碎裝置中處理1分鐘，然后通過(guò)孔徑為0.22μm的滅菌用膜。該脂質(zhì)體組合物(Lipo-αGC)的最終濃度為200μg/ml。再用同樣的方法制備不含有α-半乳糖神經(jīng)酰胺的對(duì)照用脂質(zhì)體組合物(Lipo-(-))。
2.Lipo-αGC的細(xì)胞因子產(chǎn)生能力的測(cè)定將C57BL/6小鼠脾臟的全細(xì)胞2×105個(gè)懸浮在200μl含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基添加了100ng/ml的Lipo-(-)、Lipo-αGC或α-半乳糖神經(jīng)酰胺水溶液(α-GalCer)，然后添加到96孔U底培養(yǎng)板中，于37℃、含有5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2天。用ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清中的IFN-γ、IL-4、IL-10(圖7上部分)。Lipo-αGC添加組的IF-γ、IL-4的產(chǎn)量與α-GalCer添加組相同，但是Lipo-α添加組的IL-10的產(chǎn)生大約是α-GalCer水溶液添加組的5倍。另外在最終濃度為10μg/ml的抗CDld中和抗體(1B1，BDBioscience Pharmingen)存在下進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)時(shí)，以及使用Vα14-NKT細(xì)胞缺失小鼠(C57BL/6本底)脾臟的全細(xì)胞時(shí)，在培養(yǎng)上清中不能檢出IFN-γ、IL-4、IL-10(圖7下部分)。
3-Lipo-αGC的Vα14-NKT細(xì)胞增殖能力的評(píng)價(jià)以2μg/小鼠腹腔內(nèi)給予C57BL/6小鼠Lipo-αGC、作為對(duì)照的Lipo-(-)或生理鹽水，第3天(DAY3)和第7天(DAY7)的脾臟中用α-GalCer/CD1d四聚體和抗TCRβ抗體染色雙陽(yáng)性的細(xì)胞(Vα14-NKT細(xì)胞)數(shù)用流式細(xì)胞術(shù)分析。其結(jié)果表明給予Lipo-α后DAY3的小鼠脾臟中Vα14-NKT細(xì)胞數(shù)相對(duì)于生理鹽水組增殖了2倍以上，而在DAY7與給予對(duì)照的小鼠相比反而有所減少(圖8)。
實(shí)施例5《Lipo-αGC的體內(nèi)抗體產(chǎn)生的抑制效果》1.使用C57BL/6小鼠和IL-10缺失小鼠的體內(nèi)抗體產(chǎn)生系統(tǒng)的活性評(píng)價(jià)以2μg/小鼠腹腔內(nèi)給予C57BL/6小鼠(5只/組)生理鹽水、α-GalCer、Lipo-(-)或Lipo-αGC，在第3天用DNP-OVA和氫氧化鋁免疫。免疫后第14天眼窩采血，用ELISA法測(cè)定小鼠血漿中的抗DNP-IgG1、-IgE、IgG2a抗體效價(jià)。其結(jié)果表明與α-GalCer給予組相比，在Lipo-αGC給予組中抗體產(chǎn)生的抑制效果就全部同種型而言有較高的傾向(圖9上部分)。另外，用C57BL/6本底IL-10缺失小鼠進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果沒(méi)有觀察到上述抗體產(chǎn)生的抑制效果(圖9下部分)。
2.使用BDF1小鼠的體內(nèi)抗體產(chǎn)生系統(tǒng)的活性評(píng)價(jià)以2μg/小鼠腹腔內(nèi)給予BDF1小鼠(C57BL/6×DBA/2F1)(5只/組)生理鹽水、α-GalCer、Lipo-(-)或Lipo-αGC，在第3天(day0)用DNP-OVA和氫氧化鋁進(jìn)行初次免疫，初次免疫后第55天(day55)僅用DNP-OVA抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫。分別在day0、14、55、64眼窩采血，用ELISA法測(cè)定小鼠血漿中的抗DNP-IgE、-IgG1、IgG2a抗體效價(jià)以及IgE、IgG1、IgG2a的總值。其結(jié)果表明Lipo-αGC給予組的全部同種型抗DNP抗體的效價(jià)的上升以及全部IgE的產(chǎn)生基本被完全抑制(圖10)。另一方面，IgG1和IgG2a的總值變化在Lipo-αGC給予組和α-GalCer或Lipo-(-)給予組間基本相同(圖10)。
3.使用BDF1小鼠的T細(xì)胞活化能力的評(píng)估以2μg/小鼠腹腔內(nèi)給予BDF1小鼠生理鹽水、α-GalCer、Lipo-(-)或Lipo-αGC，在第3日用DNP-OVA和氫氧化鋁進(jìn)行初次免疫，此后第7天取出脾臟，用磁性微球(Miltenyi)制備CD4+T細(xì)胞。然后用20Gy放射線照射正常BDF1小鼠脾臟全細(xì)胞，制備抗原提呈細(xì)胞。在96孔U底培養(yǎng)板的1個(gè)孔內(nèi)，加入200μl培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液中懸浮了2×105個(gè)CD4+T細(xì)胞和用DNP-OVA脈沖的2×105個(gè)抗原提呈細(xì)胞，于37℃、含有5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時(shí)后用MTT法(Promega#G4000)測(cè)定細(xì)胞增殖能力，結(jié)果表明給予Lipo-αGC的BDF1小鼠脾臟來(lái)源的CD4+T細(xì)胞針對(duì)所有濃度的DNP-OVA沒(méi)有增殖能力，其他CD4+T細(xì)胞按照α-GalCer、生理鹽水、Lipo-(-)的順序增殖能力遞增(圖11左圖)。另一方面，在37℃、含有5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，分別用50ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA；Sigma-aldrich#P-1585)和500nM離子霉素(Sigma-aldrich，#I-0634)對(duì)2×105個(gè)CD4+T細(xì)胞施加48小時(shí)的抗原非特異性刺激時(shí)，給予Lipo-αGC的小鼠來(lái)源的CD4+T細(xì)胞與其他細(xì)胞相比，表現(xiàn)出雖然比較低但顯著的增殖能力(圖11右圖)。
4.對(duì)給予Lipo-αGC的小鼠脾臟中樹(shù)突細(xì)胞(DC)的分析4-1流式細(xì)胞術(shù)分析以2μg/小鼠腹腔內(nèi)給予BALB/c小鼠生理鹽水、α-GalCer、Lipo-(-)或Lipo-αGC，在第3日取出脾臟。脾臟中注入1mg/ml膠原酶D(Roche)、CO2培養(yǎng)箱中孵育45分鐘。再將從脾臟中提取的細(xì)胞懸浮于3ml HistoDenz(14.1％，Sigma-aldrich)中后，將含有50μM2-巰基乙醇(2-ME)的X-VIVO 15培養(yǎng)基(CAMBREX Bio SicenceWalkerville，Inc.)覆于其上。1500rpm離心5分鐘后，回收中間層的細(xì)胞，用含有50μM 2ME、10％FCS的X-VIVO 15培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后、懸浮于含有0.5％FCS的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，添加生物素化抗CD3、CD11b、CD19、CD49b、Gr-1、TER-119、B220抗體(以上購(gòu)自BD Bioscience Pharmingen)。10℃孵育20分鐘后，用含有0.5％FCS的PBS洗滌一次，然后添加結(jié)合磁性微球的鏈霉親和素(SA，Miltenyi)。10℃孵育15分鐘，接著用含0.5％FCS的PBS洗滌兩次，然后用微球分離柱和磁石(以上購(gòu)自Miltenyi)回收磁性微球陰性細(xì)胞。用PE標(biāo)記抗CD11c抗體(BD Bioscience Pharmingen)和APC標(biāo)記抗CD45RB抗體(BD Bioscience Pharmingen)將此細(xì)胞染色后，用流式細(xì)胞術(shù)分析。其結(jié)果是在給予Lipo-αGC的小鼠脾臟來(lái)源細(xì)胞中，CD45RBhighCD11clow細(xì)胞的比例比CD45RBlowCD11chigh細(xì)胞的比例高，與之相對(duì)的是，在給予生理鹽水、Lipo-(-)或α-GalCer的小鼠來(lái)源的細(xì)胞中，該比例反而降低(圖12)。此后換算脾臟中的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果表明給予Lipo-αGC的小鼠脾臟中的CD45RBhighCD11clow細(xì)胞數(shù)較給予α-GalCer的小鼠脾臟中相應(yīng)細(xì)胞數(shù)增加了大約三倍，與之相對(duì)的是，CD45RBlowCD11chigh細(xì)胞數(shù)在給予α-GalCer小鼠中的與給予Lipo-αGC小鼠的相比反而有所增加(圖13)。
由于CD45RBhighCD11clow細(xì)胞被報(bào)道是調(diào)節(jié)性樹(shù)突細(xì)胞的細(xì)胞群，能引起免疫抑制，相反，CD45RBlowCD11chigh細(xì)胞是活化T細(xì)胞的樹(shù)突細(xì)胞，能引起免疫激活，因此認(rèn)為NKT細(xì)胞的免疫抑制機(jī)能是由于CD45RBhighCD11clow細(xì)胞數(shù)的增加所引起的。
4-2細(xì)胞因子產(chǎn)生能力的評(píng)價(jià)用流式細(xì)胞儀(FACS Vantage SE、BD Bioscience)分別回收用上述1中所記載的方法分離得到的CD45RBhighCD11clow細(xì)胞團(tuán)和CD45RBlowCD11chigh細(xì)胞團(tuán)，在96孔U底培養(yǎng)板的1個(gè)孔內(nèi)加入1×105個(gè)細(xì)胞/200μl培養(yǎng)液。在含有或不含最終濃度為1μg/ml脂多糖(LPS，T3382、Sigma-ald rich)的情況下將細(xì)胞培養(yǎng)2天。ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子IL-10和IL-12的結(jié)果是在LPS刺激的CD45RBhighCD11clow細(xì)胞的培養(yǎng)上清中檢出IL-10，而未檢出IL-12，另一方面不管有無(wú)LPS刺激，在CD45RBlowCD11chigh細(xì)胞的培養(yǎng)上清中檢出IL-12，而未檢出IL-10(圖14)。
4-3T細(xì)胞活化能力的評(píng)價(jià)在96孔U底培養(yǎng)板的1個(gè)孔內(nèi)以1×104個(gè)細(xì)胞/200μl培養(yǎng)液加入通過(guò)上述2中所述的方法分離得到的CD45RBhighCD11clow細(xì)胞或CD45RBlowCD11chigh細(xì)胞，然后以4×105個(gè)細(xì)胞/200μl培養(yǎng)液加入用磁性微球(Miltenyi)從DO11.10小鼠脾臟純化得到的CD4+T細(xì)胞。在添加或未添加最終濃度為600nM OVA323-339肽的條件下，于37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48小時(shí)后，用MTT法(Promega#G4000)測(cè)定細(xì)胞增殖能力，結(jié)果表明CD45RBhighCD11clow細(xì)胞和OVA肽刺激的CD4+T細(xì)胞與CD45RBlowCD11chigh細(xì)胞所引起的增殖能力相比，略為遜色，但增殖能力依然很強(qiáng)(圖15)。在培養(yǎng)第7天回收用CD45RBhighCD11clow細(xì)胞和OVA肽刺激增殖得到的CD4+T細(xì)胞，在添加OVA肽條件下，與剛剛分離回收得到的CD45RBhighCD11clow細(xì)胞或CD45RBlowCD11chigh細(xì)胞進(jìn)行兩個(gè)7天的培養(yǎng)，之后第5天用流式細(xì)胞術(shù)分析培養(yǎng)液中的細(xì)胞。其結(jié)果表明增殖的細(xì)胞群為CD4+CD25+CD28+CD152-ICOS+基本均一的細(xì)胞團(tuán)(圖16)。然后在最終濃度PMA為50ng/ml、離子霉素為500nM以及莫能霉素(Monensin，Sigma-aldrich#M-5273)為2μM存在下將5×105個(gè)該細(xì)胞于37℃、含有5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)。回收細(xì)胞后，懸浮于100μl BD Cytofix/Cytoperm液(BD Bioscience)中，4℃孵育15分鐘。用BD Perm/Wash液(BD Bioscience)洗滌后，用FITC標(biāo)記抗IFN-γ抗體、PE標(biāo)記抗IL-4抗體(BD Bioscience Pharmingen)和APC標(biāo)記抗IL-10抗體(BD Bioscience Pharmingen)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)三重染色，并且采用與之相同的熒光標(biāo)記的同種型對(duì)照抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)三重染色(圖17上部分)，用流式細(xì)胞術(shù)分析。其結(jié)果表明在表達(dá)細(xì)胞因子的細(xì)胞群中，僅僅表達(dá)IL-4的細(xì)胞基本不存在，并且依照僅僅表達(dá)IFN-γ的細(xì)胞、表達(dá)IL-10和IFN-γ的細(xì)胞、僅僅表達(dá)IL-10的細(xì)胞的順序，細(xì)胞數(shù)增多(圖17下部分)。
實(shí)施例6《含有過(guò)敏原和調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體對(duì)IgE抗體產(chǎn)生的抑制效果》1.含有卵白蛋白和α-半乳糖神經(jīng)酰胺的脂質(zhì)體的制備將L-α-二油酰磷脂酰膽堿(DOPC，和光純藥)0.77mg和3β-N-(二甲基氨乙基)鹽酸碳酸酯-膽固醇(DC-Chol，Sigama-Aldrich)0.83mg和1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](銨鹽)(PEG-PE；Avanti Polar Lipids)0.029mg溶解在250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。然后再將α-半乳糖神經(jīng)酰胺(獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所免疫過(guò)敏科學(xué)綜合研究中心制)0.16mg溶解在另外250μl氯仿/甲醇(1∶1)溶劑中。然后，將兩者混合、用蒸發(fā)器干燥后，在真空干燥器內(nèi)干燥一晚上。然后添加200μl卵白蛋白(OVA，生化學(xué)工業(yè))濃度為0.4mg/ml的水溶液，置于超聲破碎裝置中處理10分鐘后，然后通過(guò)孔徑為0.22μm的滅菌用膜。然后在裝有孔徑為100nm的聚碳酸酯膜的LiposoFast-Basic擠壓機(jī)(Avestin Inc.)上通過(guò)25次，借此制備成顆粒。用Amicon Ultra-4離心過(guò)濾器(PL-100)(Millipore)對(duì)封入OVA的脂質(zhì)體進(jìn)行濃縮，并用純水洗滌以除去未封入脂質(zhì)體的OVA蛋白質(zhì)，最后用純水調(diào)整成為800μl水溶液。含有該脂質(zhì)體組合物(Lipo-αGC+OVA)的水溶液用SDS電泳分析，結(jié)果表明OVA蛋白質(zhì)濃度為50μg/ml。另外假定α-GalCer完全進(jìn)入脂質(zhì)體膜內(nèi)，那么Lipo-αGC+OVA溶液中的α-GalCer的最終濃度為200μg/ml。
2.Lipo-αGC+OVA對(duì)產(chǎn)生IL-10的調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo)BDF1小鼠(C57BL/6×DBA/2F1)腹腔內(nèi)給予Lipo-αGC或Lipo-αGC+OVA(以α-GalCer的量計(jì)相當(dāng)于2μg)后，第7日取出脾臟，用磁性微球(Miltenyi)制備CD4+T細(xì)胞。然后用20Gy的放射線照射正常BDF1小鼠脾細(xì)胞，制備抗原提呈細(xì)胞。在6孔U底培養(yǎng)板的1個(gè)孔中，添加3ml培養(yǎng)液和1.5×106個(gè)CD4+T細(xì)胞以及7.5×106個(gè)抗原提呈細(xì)胞，并添加最終濃度為100μg/ml的OVA蛋白質(zhì)的，在37℃、含5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天。然后在最終濃度PMA為50ng/ml和離子霉素為500nM以及莫能霉素(Sigma-aldrich)為2μM存在下將5×105個(gè)細(xì)胞于37℃、含有5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)?；厥占?xì)胞后，用生物素化抗CD4抗體和鏈霉親和素-Per CP-Cy5.5(BD Bioscience)染色。然后在100μl BD Cytofix/Cytoperm液(BD Bioscience)中懸浮，4℃孵育15分鐘。用BD Perm/Wash液(BDBioscience)洗滌后，用FITC標(biāo)記抗IFN-γ抗體、PE標(biāo)記抗IL-4抗體(BD Bioscience Pharmingen)和APC標(biāo)記抗IL-10抗體(BDBioscience Pharmingen)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，用流式細(xì)胞術(shù)分析(圖18)。其結(jié)果是在給予未封入OVA的Lipo-αGC的小鼠脾細(xì)胞來(lái)源的CD4+T細(xì)胞中，檢出1.4％的細(xì)胞僅表達(dá)IL-4、1.1％的細(xì)胞僅表達(dá)IFN-γ，而基本沒(méi)有檢出僅產(chǎn)生IL-10、或者同時(shí)產(chǎn)生IL-10和IFN-γ兩者的CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞團(tuán)。另一方面，在給予Lipo-αGC+OVA的小鼠脾細(xì)胞來(lái)源的CD4+T細(xì)胞的分析中，檢出僅表達(dá)IL-4(1.0％)、僅表達(dá)IFN-γ(9.9％)的輔助T細(xì)胞團(tuán)和產(chǎn)生IL-10的CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(14.1％)、IL-10和IFN-γ兩者均表達(dá)的CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(9.1％)。以上結(jié)果提示含有過(guò)敏原的Lipo-αGC能使具有抑制IgE產(chǎn)生作用的過(guò)敏原特異性CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在體內(nèi)分化增殖。
3.Lipo-αGC+OVA對(duì)小鼠二次抗體應(yīng)答的抑制效果用DNP-OVA(0.1μg)和氫氧化鋁凝膠(2mg)初次免疫BDF1小鼠，之后，第14天測(cè)定血液中抗-DNP-IgE抗體效價(jià)，將平均抗體效價(jià)相同的組分為3組(5只/組)。初次免疫后第21、28、35天，分別腹腔內(nèi)給予以α-GalCer的量計(jì)相當(dāng)于2μg的單獨(dú)的脂質(zhì)體(載體)、Lipo-αGC或Lipo-αGC+OVA。初次免疫后第42天僅用DNP-OVA抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫，用ELISA法測(cè)定第48日的血液中DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a抗體效價(jià)以及IgE、IgG1、IgG2a的全值(圖19)。其結(jié)果是在Lipo-αGC+OVA給予組中抗DNP-IgE、-IgG1、-IgG2a抗體效價(jià)被顯著抑制。另一方面，在不含OVA的Lipo-αGC給予組中，沒(méi)有觀察到除抗DNP-IgG1以外的抗體效價(jià)被顯著抑制。以上結(jié)果提示，含有過(guò)敏原的Lipo-αGC能抑制由于過(guò)敏原所引起的二次抗體產(chǎn)生。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的“含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體”由于能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性細(xì)胞的分化增殖以及活化，因此具有抑制輔助T細(xì)胞的活化作用以及IgE抗體產(chǎn)生的作用。因此，作為IgE抗體密切相關(guān)的I型過(guò)敏性反應(yīng)所引起的過(guò)敏性疾病，特別是特應(yīng)性支氣管哮喘、特應(yīng)性皮炎以及花粉癥等過(guò)敏性鼻炎和結(jié)膜炎的預(yù)防劑和治療劑是有用的。
另外，由于“含有α-半乳糖神經(jīng)酰胺的脂質(zhì)體”通過(guò)選擇性增強(qiáng)NKT細(xì)胞的免疫抑制機(jī)能，能抑制病原性T細(xì)胞的分化增殖，因此作為針對(duì)自身免疫疾病或移植物抗宿主病等的藥物也是有用的。
另外，由于本發(fā)明的藥物不僅保持了選擇性結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞的分子，而且在脂質(zhì)膜內(nèi)含有細(xì)胞配體的脂質(zhì)體作為有效成分，因此沒(méi)有令人擔(dān)心的副作用。
權(quán)利要求
1.含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體作為有效成分的藥物。
2.權(quán)利要求
1所述的藥物，其中調(diào)節(jié)性細(xì)胞為NKT細(xì)胞。
3.權(quán)利要求
1或2所述的藥物，其中調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體為β-半乳糖神經(jīng)酰胺。
4.權(quán)利要求
1或2所述的藥物，其中調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體為α-半乳糖神經(jīng)酰胺。
5.權(quán)利要求
1到4任一項(xiàng)所述的藥物，其中所述脂質(zhì)體進(jìn)一步含有CpG寡核苷酸或咪喹莫特。
6.權(quán)利要求
1到5任一項(xiàng)所述的藥物，其中所述脂質(zhì)體進(jìn)一步含有過(guò)敏原。
7.權(quán)利要求
1到6任一項(xiàng)所述的藥物，為免疫疾病的預(yù)防劑或治療劑。
8.權(quán)利要求
7所述的藥物，其中免疫疾病為過(guò)敏性疾病。
9.權(quán)利要求
8所述的藥物，其中過(guò)敏性疾病為特應(yīng)性支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎、花粉癥或特應(yīng)性皮炎。
10.權(quán)利要求
4所述的藥物，為自身免疫疾病或移植物抗宿主病的預(yù)防劑或治療劑。
11.含有調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體作為有效成分的調(diào)節(jié)性細(xì)胞誘導(dǎo)劑。
專(zhuān)利摘要
含有α－半乳糖神經(jīng)酰胺、β－半乳糖神經(jīng)酰胺等調(diào)節(jié)性細(xì)胞配體的脂質(zhì)體作為預(yù)防或治療免疫疾病等疾病的藥物的有效成分。
文檔編號(hào)A61K31/7088GK1997395SQ200580019128
公開(kāi)日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2005年6月3日
發(fā)明者石井保之, 野澤理咲, 谷口克 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan