本發(fā)明屬于rna干擾，涉及基于mpeg-pei-c-swcnts的sirna遞送系統(tǒng)及其制備方法和應用。

背景技術：

1、凡納濱對蝦(litopenaeus?vannamei)，又稱太平洋白對蝦，因其生長速度快、成活率高和適應性強，已成為全球水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模最大的物種之一。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和養(yǎng)殖年限的延長，養(yǎng)殖過程中各種病毒和細菌病原體引發(fā)的疾病對養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟造成了嚴重影響。常見的疾病主要包括白斑綜合征病毒(wssv)、桃氏綜合征病毒(tsv)、黃頭病毒(yhv)和傳染性肌壞死病毒(imnv)等。

2、傳統(tǒng)的對蝦養(yǎng)殖業(yè)疾病管理方法主要依賴于抗生素和化學處理。然而，這些方法也存在一些弊端，例如抗生素的過度使用導致耐藥菌株的出現(xiàn)，增加了疾病控制的難度。此外，化學處理對水生環(huán)境造成不利影響，影響生物多樣性和水質(zhì)安全。此外，對蝦產(chǎn)品中抗生素和化學物質(zhì)的殘留對消費者健康和監(jiān)管帶來了隱患，進而導致對蝦養(yǎng)殖經(jīng)濟損失和抗生素消耗的增加。

3、目前，越來越多的替代策略正在被推廣，其中包括rna干擾(rnai)技術。這是一種利用小干擾rna(sirna)進行基因沉默的前景廣闊的策略，能夠增強水生生物種類的抗病能力。sirna通過降解特定的mrna分子來實現(xiàn)其功能，從而阻止靶基因的翻譯。該技術可用于下調(diào)與免疫反應、代謝途徑或病原體易感性相關的基因，潛在地增強養(yǎng)殖物種的健康和復原力。盡管rnai目前被認為是一種非常有前途的蝦病毒疾病控制策略，但將sirna有效遞送到對蝦的靶細胞和組織中仍然是一個重大挑戰(zhàn)。

技術實現(xiàn)思路

1、基于以上，本發(fā)明解決的技術問題是提供基于mpeg-pei-c-swcnts的sirna遞送系統(tǒng)及其制備方法和應用。通過對納米材料性質(zhì)的表征，優(yōu)化sirna的負載比例，以合成轉(zhuǎn)染效率高且細胞毒性低的納米復合物，從而安全有效地將sirna遞送至凡納濱對蝦的受精卵。

2、本發(fā)明提供了基于mpeg-pei-c-swcnts的sirna遞送系統(tǒng)的制備方法，包括：

3、將聚乙二醇枝接聚乙烯亞胺mpeg-pei添加到羧化單壁碳納米管c-swcnts的懸浮液中，在室溫下攪拌24小時后，超濾離心去除多余的mpeg-pei，收集過濾器中的液體，得到聚乙二醇枝接聚乙烯亞胺非共價修飾的單壁碳納米管mpeg-pei-c-swcnts。

4、優(yōu)選地，所述聚乙二醇枝接聚乙烯亞胺mpeg-pei與羧化單壁碳納米管c-swcnts的懸浮液的質(zhì)量比為2：1。

5、優(yōu)選地，所用聚乙二醇的分子量為mn＝5000da，支化聚乙烯亞胺的分子量為mn＝25000da；和/或所述羧化單壁碳納米管的規(guī)格為直徑4～5nm，長度0.5～1.5μm，純度>90％。

6、優(yōu)選地，所述超濾離心包括使用100,000mwco過濾器在室溫下以800rpm的速度離心1小時。

7、優(yōu)選地，羧化單壁碳納米管c-swcnts的懸浮液采用以下方法制備：

8、取羧化單壁碳納米管c-swcnts粉末加入去離子水，在室溫下以300～600w的功率進行超聲波處理，持續(xù)30分鐘，靜置10分鐘后，以最高轉(zhuǎn)速14000rpm離心1小時，收集除最后2～3ml外的所有上清液，得到均一懸浮的c-swcnts溶液。

9、優(yōu)選地，上述制備方法還包括：將mpeg-pei-c-swcnts溶液與sirna充分混合，并在室溫下共同孵育30分鐘，即可獲得mpeg-pei-c-swcnts-sirna納米復合物。

10、更優(yōu)選地，所述mpeg-pei-c-swcnts溶液的濃度為5μg/ml；和/或mpeg-pei-c-swcnts溶液與sirna的質(zhì)量比為4：1。

11、本發(fā)明還提供了基于mpeg-pei-c-swcnts的sirna遞送系統(tǒng)，通過任一上述制備方法制成。

12、本發(fā)明另提供了上述sirna遞送系統(tǒng)在凡納濱對蝦基因沉默中的應用。

13、優(yōu)選地，所述mpeg-pei-c-swcnts溶液的濃度在10μg/ml以下。

14、本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

15、本發(fā)明制備的基于mpeg-pei-c-swcnts的sirna遞送系統(tǒng)成功、安全且有效地將sirna遞送至凡納濱對蝦的受精卵中，實現(xiàn)了目標基因的沉默，具有高轉(zhuǎn)染效率和良好安全性的優(yōu)點。該遞送系統(tǒng)的建立有助于功能基因的研究，并促進rnai療法在對蝦類物種中的應用，有助于推動基因治療手段在提高凡納濱對蝦抗病能力和培育健康種蝦方面的應用。并且，本發(fā)明所采用的mpeg-pei-c-swcnts-sirna納米復合物的制備工藝溫和、經(jīng)濟且省時，能夠在海水中穩(wěn)定分散，適用于海洋生物的基礎應用。

技術特征：

1.基于mpeg-pei-c-swcnts的sirna遞送系統(tǒng)的制備方法，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述聚乙二醇枝接聚乙烯亞胺mpeg-pei與羧化單壁碳納米管c-swcnts的懸浮液的質(zhì)量比為2：1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所用聚乙二醇的分子量為mn＝5000da，支化聚乙烯亞胺的分子量為mn＝25000da；和/或所述羧化單壁碳納米管的規(guī)格為直徑4～5nm，長度0.5～1.5μm，純度>90％。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述超濾離心包括使用100,000mwco過濾器在室溫下以800rpm的速度離心1小時。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述羧化單壁碳納米管c-swcnts的懸浮液采用以下方法制備：

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，還包括：將mpeg-pei-c-swcnts溶液與sirna充分混合，并在室溫下共同孵育30分鐘，即可獲得mpeg-pei-c-swcnts-sirna納米復合物。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述mpeg-pei-c-swcnts溶液的濃度為5μg/ml；和/或mpeg-pei-c-swcnts溶液與sirna的質(zhì)量比為4：1。

8.基于mpeg-pei-c-swcnts的sirna遞送系統(tǒng)，通過權(quán)利要求1～7任意一項所述的制備方法制成。

9.權(quán)利要求8所述的sirna遞送系統(tǒng)在凡納濱對蝦基因沉默中的應用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應用，其特征在于，所述mpeg-pei-c-swcnts溶液的濃度在10μg/ml以下。

技術總結(jié)
本發(fā)明提供了基于mPEG?PEI?c?SWCNTs的siRNA遞送系統(tǒng)及其制備方法和應用，通過非共價修飾使羧化單壁碳納米管c?SWCNTs與聚乙二醇枝接聚乙烯亞胺mPEG?PEI結(jié)合，得到mPEG?PEI?c?SWCNTs，通過優(yōu)化siRNA的負載比例，安全有效地將siRNA遞送至凡納濱對蝦的受精卵，實現(xiàn)了目標基因的沉默，具有高轉(zhuǎn)染效率和良好安全性的優(yōu)點，有助于推動基因治療手段在提高凡納濱對蝦抗病能力和培育健康種蝦方面的應用。并且，本發(fā)明所采用的基于mPEG?PEI?c?SWCNTs的siRNA遞送系統(tǒng)的制備工藝溫和、經(jīng)濟且省時，能夠在海水中穩(wěn)定分散，適用于海洋生物的基礎應用。

技術研發(fā)人員：周海龍,門佳麗
受保護的技術使用者：海南大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/2