本發(fā)明涉及bestrophin?1(best1)作為缺血性卒中亞急性期治療靶點(diǎn)的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥。

背景技術(shù)：

1、卒中是由腦部血液循環(huán)障礙導(dǎo)致腦功能缺損的腦血管疾病，其中缺血性卒中大約占80％。近年來(lái)藥物溶栓、血管內(nèi)治療等在缺血性卒中急性期治療方面取得了較大進(jìn)展，進(jìn)一步突顯高致殘率帶來(lái)的醫(yī)療和社會(huì)問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)現(xiàn)有700萬(wàn)卒中幸存者中約75％的病人留下殘疾，不同程度地喪失勞動(dòng)和生活能力。缺血性卒中急性期之后存在一個(gè)對(duì)神經(jīng)功能修復(fù)極為關(guān)鍵的亞急性期，從數(shù)天開(kāi)始，長(zhǎng)達(dá)數(shù)周甚至數(shù)月。然而，臨床上除康復(fù)鍛煉外，目前缺乏針對(duì)缺血性卒中亞急性期治療的明確靶點(diǎn)和有效藥物。

2、bestrophins是位于細(xì)胞質(zhì)膜上鈣激活的氯離子通道(calcium-activatedchloride?channels，caccs)，主要在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中表達(dá)。在bestrophins家族成員中，bestrophin?1(best1)編碼了在突觸傳遞中具有重要作用的caccs。研究表明，best1mrna廣泛分布于腦中，尤其是嗅球、海馬和小腦的含量較高，并且在神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞中均顯著表達(dá)。best1離子通道可以通透cl-和hco3-等陰離子外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，最重要的特性是對(duì)谷氨酸和γ-氨基丁酸兩種神經(jīng)遞質(zhì)具有高通透性；尤其是在病理情況下，由best1介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放具有重要意義。但是在缺血性卒中的亞急性期，best1對(duì)缺血性卒中神經(jīng)功能的恢復(fù)有何價(jià)值，是否可以作為治療靶點(diǎn)等問(wèn)題尚無(wú)報(bào)道。

3、目前對(duì)于best1這類(lèi)沒(méi)有特異性小分子抑制劑的潛在治療靶點(diǎn)，可采用小干擾rna(small?interfering?rna,sirna)下調(diào)特定基因的表達(dá)，這種rna干擾(rnainterference,rnai)技術(shù)為許多重大疾病的治療以及有效治療靶點(diǎn)的識(shí)別和確認(rèn)開(kāi)辟了一條新思路，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。然而sirna的分子量較大，表面帶有大量的負(fù)電荷，這導(dǎo)致其跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力極低，并且sirna極易被核酸酶降解，穩(wěn)定性很差，其體內(nèi)外遞送通常需要載體幫助。現(xiàn)有的sirna遞送載體分為病毒載體和非病毒載體：病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺病毒等雖然具有良好的感染效率，但由于具有較強(qiáng)的免疫原性且存在較大的生物安全隱患，其臨床應(yīng)用受到限制；非病毒載體如陽(yáng)離子脂質(zhì)體等甚至包括目前已用于臨床的脂質(zhì)或聚合物納米粒雖然安全性?xún)?yōu)于病毒載體，但轉(zhuǎn)染效率較低，采取傳統(tǒng)靜脈給藥模式后從血中被快速清除不利于sirna在靶部位富集，缺乏靶部位選擇性，并且跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力仍然有限，很難穿過(guò)血腦屏障。因此，在best1特異性小干擾rna(sibest1)應(yīng)用于缺血性卒中治療的相關(guān)研究中，構(gòu)建一種安全有效的納米載體系統(tǒng)高效遞送sibest1至腦缺血損傷部位十分有必要。目前，還未見(jiàn)有靶向遞送sibest1入腦的自組裝納米粒的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)缺血性卒中治療窗窄以及缺乏靶點(diǎn)明確的亞急性期治療藥物的臨床問(wèn)題，提供了一種缺血性卒中亞急性期治療的靶點(diǎn)best1；本發(fā)明發(fā)現(xiàn)下調(diào)或敲減星型膠質(zhì)細(xì)胞best1的表達(dá)，能夠提高梗死周邊區(qū)神經(jīng)元興奮性并促進(jìn)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮層的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重塑，從而改善運(yùn)動(dòng)功能。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是：

3、第一方面，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)bestrophin?1(best1)作為缺血性卒中亞急性期治療靶點(diǎn)在制備缺血性卒中亞急性期治療藥物中的應(yīng)用。

4、其中，所述bestrophin?1為哺乳動(dòng)物bestrophin?1。

5、優(yōu)選的，所述哺乳動(dòng)物bestrophin?1為小鼠bestrophin?1或人bestrophin?1。

6、更優(yōu)選的，所述小鼠bestrophin?1基因序列見(jiàn)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_000085.7？from＝9962536&to＝9978997&report＝genban?k&strand＝true，蛋白質(zhì)氨基酸序列見(jiàn)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_036043.2，具體為：mtitytnkvanarlgsfsslllcwrgsiykllygeflvfiflyysirglyrmvlssdqqllfeklalycdsyiqlipisfvlgfyvtlvvsrwwsqyenlpwpdrlmiqvssfvegkdeegrllrrtliryailgqvlilrsistsvykrfptlhhlvlagfmthgehkqlqklglphntfwvpwvwfanlsmkaylggrirdtvllqslmnevctlrtqcgqlyaydwisiplvytqvvtvavysfflacligrqflnpnkdypghemdlvvpvftilqflfymgwlkvaeqlinpfgeddddfetnwiidrnlqvsllsvdgmhqnlppmerdmywneaapqppytaasarsrrhsfmgstfnislkkedlelwskeeadtdkkesgysstigcflglqpknyhlplkdlktkllcsknpllegqckdanqknqkdvwkfkgldflkcvprfkrrgshcgpqapsshpteqsapsssdtgdgpstdyqeichmkkktvefnlnipesptehlqqrrldqmstniqalmkehaesypyrdeagtkpvlye，如seq?id?no：1所示。

7、更優(yōu)選的，人bestrophin?1基因序列見(jiàn)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ng_009033.1？from＝5468&to＝19578&report＝genbank，蛋白質(zhì)氨基酸序列見(jiàn)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/np_001132915.1，具體為：mfekltlycdsyiqlipisfvlgfyvtlvvtrwwnqyenlpwpdrlmslvsgfvegkdeqgrllrrtliryanlgnvlilrsvstavykrfpsaqhlvqagfmtpaehkqleklslphnmfwvpwvwfanlsmkawlggrirdpillqsllnemntlrtqcghlyaydwisiplvytqvvtvavysffltclvgrqflnpakaypgheldlvvpvftflqfffyvgwlkvaeqlinpfgeddddfetnwivdrnlqvsllavdemhqdlprmepdmywnkpepqppytaasaqfrrasfmgstfnislnkeemefqpnqedeedahagiigrflglqshdhhppransrtkllwpkresllheglpknhkaakqnvrgqednkawklkavdafksaplyqrpgyysapqtplsptpmffplepsapsklhsvtgidtkdkslktvssgakksfellsesdgalmehpevsqvrrktvefnltdmpeipenhlkepleqsptnihttlkdhmdpywalenrsvlhlnqghcialcptpaslalslpflhnflgfhhcqstldlrpalawgiylatftgilgkcsgpfltspwyhpedflgpgegr，如seq?idno：2所示。

8、在具體的實(shí)施方案中，所述藥物用于改善運(yùn)動(dòng)功能。

9、第二方面，本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)下調(diào)或者敲除best1的藥物在制備缺血性卒中亞急性期治療藥物中的應(yīng)用。

10、在具體的實(shí)施方案中，所述藥物用于促進(jìn)卒中后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

11、在具體的實(shí)施方案中，所述下調(diào)或者敲除best1的藥物中的活性成分為bestrophin?1的sirna(sibest1)或能夠特異性抑制best1的小分子化合物。

12、在更具體的實(shí)施方案中，所述sibest1的核酸序列為：uugccaacuugucaaugaatt。該sibest1對(duì)小鼠和人bestrophin?1均具有良好的干擾效應(yīng)。

13、在具體的實(shí)施方案中，所述藥物為復(fù)合納米制劑，命名為snp-sibest1，其以聚乳酸羥基乙醇酸共聚物(polylactic-co-glycolic?acid,plga)為主要內(nèi)核，包裹兩親性陽(yáng)離子材料聚乙烯亞胺-環(huán)氧十二烷(pei-c12)及best1，吐溫80分布在內(nèi)核表面，粒徑為110nm。

14、在具體的實(shí)施方案中，所述plga與所述pei-c12的質(zhì)量比為3～5:1如3:1、4∶1、5:1等。

15、在具體的實(shí)施方案中，所述pei-c12與所述bestrophin?1的sirna的質(zhì)量比為20～30:1優(yōu)選20～27：1、23～27：1、24～30:1等、具體如20:1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、30:1等，可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。

16、在具體的實(shí)施方案中，所述吐溫80在水相中的濃度為1～5mg/ml優(yōu)選為1～3mg/ml、2～4mg/ml、3～5mg/ml，更具體如1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml等。

17、在具體的實(shí)施方案中，所述復(fù)合納米制劑的制備方法如下：將有機(jī)相在劇烈攪拌下滴加到水相中，獲得納米粒。

18、在更具體的實(shí)施方案中，所述復(fù)合納米制劑的制備方法如下：

19、(1)將plga、pei-c12加入到n,n-二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide,dmf)中，攪拌均勻后，加入溶于depc水中的bestrophin?1的sirna，攪拌獲得有機(jī)相；

20、(2)將吐溫80加入到水中，攪拌獲得水相；

21、(3)將有機(jī)相逐滴加入到水相中，劇烈攪拌獲得納米粒。

22、第三方面，本發(fā)明保護(hù)一種藥物，所述藥物包括藥學(xué)上可接受的載體和有效量的活性成分，其中所述活性成分為bestrophin?1的sirna。

23、在具體的實(shí)施方案中，所述bestrophin?1的sirna的核酸序列為：uugccaacuugucaaugaatt。該sibest1對(duì)小鼠和人bestrophin?1均具有良好的干擾效應(yīng)，可以同時(shí)應(yīng)用于小鼠和人。

24、在具體的實(shí)施方案中，所述藥物為復(fù)合納米制劑，其以聚乳酸羥基乙醇酸共聚物(polylactic-co-glycolic?acid,plga)為主要內(nèi)核，包裹兩親性陽(yáng)離子材料聚乙烯亞胺-環(huán)氧十二烷(pei-c12)及bestrophin?1的sirna，吐溫80分布在內(nèi)核表面。

25、在具體的實(shí)施方案中，所述plga與所述pei-c12的質(zhì)量比為4：1，所述pei-c12與所述bestrophin?1的sirna的質(zhì)量比為25：1，所述吐溫80在水相中的濃度為2mg/ml。

26、在具體的實(shí)施方案中，所述復(fù)合納米制劑的制備步驟如下：

27、(1)將plga、pei-c12加入到n,n-二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide,dmf)中，攪拌均勻后，加入溶于depc水中的bestrophin?1的sirna，攪拌獲得有機(jī)相；

28、(2)將吐溫80加入到水中，攪拌獲得水相；

29、(3)將有機(jī)相逐滴加入到水相中，劇烈攪拌獲得納米粒。

30、為安全高效遞送sibest1入腦，本發(fā)明合成由低分子量聚乙烯亞胺(polyetherimide,pei)和1,2-環(huán)氧十二烷(1,2-epoxydodecane,o-c12)組成的陽(yáng)離子脂質(zhì)樣兩親性聚合物(pei-c12)，pei-c12可通過(guò)靜電相互作用有效壓縮sibest1形成納米級(jí)復(fù)合物，該復(fù)合物隨后可主動(dòng)包封入具有吐溫80外殼的plga納米粒中，自組裝形包載sibest1的復(fù)合納米粒。本發(fā)明設(shè)計(jì)的納米粒能很好地保護(hù)其所包載的sibest1免受核酸酶降解。此外，納米粒表面的吐溫80增加了其表面親水性，使粒子不易被吞噬細(xì)胞吞噬，延長(zhǎng)了納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，使納米粒及其包載的sibest1更易到達(dá)體內(nèi)作用部位。同時(shí)吐溫80可與內(nèi)源性載脂蛋白結(jié)合，從而識(shí)別血腦屏障上高表達(dá)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1(low-density?lipoprotein?recepctor-related?protein-1,lrp-1)，并通過(guò)lrp-1介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)納米粒透過(guò)血腦屏障。陽(yáng)離子聚合物pei具有較強(qiáng)的質(zhì)子緩沖能力，可促進(jìn)sibest1的溶酶體逃逸，從而有助于實(shí)現(xiàn)高效的基因沉默效應(yīng)。由于pei的毒性取決于其分子量并且隨著分子量的增加而增強(qiáng)，因此本發(fā)明在制備納米粒時(shí)選用了分子量為800da的低毒pei。此外，本發(fā)明所使用的plga和吐溫80，均為批準(zhǔn)使用的藥用輔料。

31、本技術(shù)至少具有如下任一技術(shù)效果或優(yōu)點(diǎn)：

32、(1)研究發(fā)現(xiàn)缺血性腦損傷后，星型膠質(zhì)細(xì)胞被大量激活，誘導(dǎo)best1從腦缺血后第7天開(kāi)始長(zhǎng)期維持高水平表達(dá)，介導(dǎo)突觸外γ-氨基丁酸大量釋放，形成對(duì)神經(jīng)元的異常張力抑制，從而影響亞急性期梗死周邊區(qū)神經(jīng)元興奮性以及感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮層的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重塑，導(dǎo)致?lián)p傷的神經(jīng)功能難以恢復(fù)。通過(guò)sibest1特異性敲減星型膠質(zhì)細(xì)胞best1的表達(dá)，為缺血性卒中亞急性期治療提供了治療靶點(diǎn)。

33、(2)制備腦部靶向遞送sibest1的長(zhǎng)循環(huán)納米制劑，在腦缺血后通過(guò)靜脈注射給藥，能夠在腦損傷區(qū)域富集并有效敲減星型膠質(zhì)細(xì)胞best1表達(dá)，從而顯著改善腦缺血后運(yùn)動(dòng)功能缺陷，達(dá)到長(zhǎng)期的治療效果。