本發(fā)明涉及生物醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)，是一種慢性乙肝治療性dc疫苗。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)，全球流行最廣的嗜肝病毒，感染后可引起急、慢性和重型肝炎，并與肝硬化、肝癌的發(fā)病密切相關(guān)。在我國(guó)，hbv攜帶者約9300萬(wàn)人，其中慢性乙肝患者高達(dá)2500萬(wàn)，是我國(guó)最為嚴(yán)重的三大傳染病之一。目前臨床上對(duì)慢性乙肝患者的主要治療藥物包括核苷(酸)類(lèi)似物、干擾素和免疫調(diào)節(jié)劑，這些藥物均不能徹底清除乙肝病毒，并且復(fù)發(fā)率高。因此，研發(fā)有效的治療策略顯得極為迫切。

如何誘導(dǎo)強(qiáng)有力的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，打破體內(nèi)hbv特異性t細(xì)胞免疫耐受已經(jīng)成為目前的主要研究方向。由于dc疫苗在誘導(dǎo)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已作為針對(duì)慢性乙肝具有潛力的免疫治療手段被廣泛研究。目前慢性乙肝dc疫苗研究的焦點(diǎn)：(1)如何獲得有效的hbv抗原(抗原必須在慢性乙肝中不耐受)。(2)如何進(jìn)一步增強(qiáng)dc疫苗的免疫效應(yīng)。

hbv表面蛋白質(zhì)或抗原(hbsag)是由pres(pres1和pres2)區(qū)域及s區(qū)域的基因通過(guò)三種起始密碼子各自進(jìn)行交替翻譯編碼的三種包膜蛋白(l蛋白，m蛋白和s蛋白)。s-hbsag由226個(gè)氨基酸組成，僅包括s區(qū)域，是慢性乙型肝炎患者血清中假病毒顆粒的主要成分，也是目前臨床預(yù)防性乙肝疫苗的成分；m-hbsag是由281個(gè)氨基酸組成，包括s和pres2區(qū)域，也是假病毒顆粒的重要組成成分；l-hbsag是約400個(gè)氨基酸組成(根據(jù)乙肝不同亞型，ay型389個(gè)，ad型400個(gè))，包括pres1域，pres2域及s域。目前研究表明：慢性hbv感染過(guò)程中，不同的病毒抗原存在不同的耐受狀態(tài)。s區(qū)域存在著很強(qiáng)的免疫耐受狀態(tài)，直接以此作為疫苗，無(wú)法在hbv耐受小鼠中產(chǎn)生治療性效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)以上不足，但是以pres1區(qū)域作為疫苗就能夠在hbv耐受模型體內(nèi)引起細(xì)胞免疫反應(yīng)。并且聯(lián)合pres1疫苗和hbsag疫苗，可以誘導(dǎo)hbsag-hbsab的血清學(xué)轉(zhuǎn)化，降低肝內(nèi)的乙肝病毒感染。由此可知，同時(shí)含有pres1抗原和s抗原的疫苗與只含有s抗原的疫苗相比免疫原性更強(qiáng)。由此本發(fā)明提供一種慢性乙肝治療性dc疫苗

本發(fā)明的方案是：

一種慢性乙肝治療性dc疫苗，包括經(jīng)基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞，所述經(jīng)基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞中含有粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞簇因子受體信號(hào)肽引導(dǎo)編碼m-hbsag的pres2區(qū)域和s區(qū)域的融合基因片段。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞簇因子受體信號(hào)肽為序列表seqidno.1所示的核苷酸序列。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述m-hbsag為序列表seqidno.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了一種將樹(shù)突狀細(xì)胞負(fù)載融合基因片段的方法：將所述粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞簇因子受體信號(hào)肽引導(dǎo)編碼m-hbsag的pres2區(qū)域和s區(qū)域的基因片段緩慢插入慢病毒表達(dá)載體plent-c-gfp中，包裝成攜帶gm-csfrsp-m-hbsag編碼基因的慢病毒，同時(shí)，將慢性乙型肝炎患者的體外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)成imdc，將攜帶gm-csfrsp-m-hbsag編碼基因的慢病毒感染所述imdc，并將感染后的imdc經(jīng)成熟因子誘導(dǎo)，得到成熟dc疫苗。

本發(fā)明還提供了一種將所述慢性乙型肝炎患者的體外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)成imdc的方法：采集慢性乙型肝炎病人外周靜脈血50ml，利用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)基中，37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)2-3小時(shí)后，倒掉懸浮t細(xì)胞，留取貼壁細(xì)胞，并加入細(xì)胞因子rhil-4，rhgm-gsf，誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞分化成dc，每隔48小時(shí)更換新培養(yǎng)基，培養(yǎng)第5天得到imdc。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述成熟因子為成熟因子tnf-α。

本發(fā)明還提供了一種將包裝成攜帶gm-csfrsp-m-hbsag編碼基因的慢病毒的方法：將慢病毒包裝細(xì)胞系293t接種于含有dmem+10％fbs10cm培養(yǎng)皿中，37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)，貼壁率為70％-80％后進(jìn)行轉(zhuǎn)染；慢病毒包裝質(zhì)粒和目的表達(dá)質(zhì)粒采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后24h后，細(xì)胞明顯增大、呈球形，細(xì)胞核變大，變圓，貼壁能力下降而易脫落；48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白表達(dá)；72h后，收集上清，過(guò)濾除菌，得到重組gm-csfrsp-m-hbsag慢病毒，所述重組gm-csfrsp-m-hbsag慢病毒在-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

由于采用了上述技術(shù)方案，一種慢性乙肝治療性dc疫苗，包括經(jīng)基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞，所述經(jīng)基因修飾的樹(shù)突狀細(xì)胞中含有粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞簇因子受體信號(hào)肽引導(dǎo)編碼m-hbsag的pres2區(qū)域和s區(qū)域的融合基因片段。

本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)首次采用pres2區(qū)域和s區(qū)域作為抗原基因制備慢性乙肝dc疫苗，傳統(tǒng)的乙肝疫苗即乙肝表面抗原小蛋白存在著很強(qiáng)的免疫耐受狀態(tài)，無(wú)法在慢性乙肝患者中產(chǎn)生治療性效果。包含pres2抗原的m-hbsag在hbv與肝細(xì)胞相應(yīng)受體的粘附中起重要作用，免疫機(jī)體時(shí)就可以產(chǎn)生針對(duì)pres2抗原的特性抗體，這些抗體具有良好的中和hbv病毒的作用，從而保護(hù)宿主免受hbv病毒的感染。

(2)采用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞簇因子受體信號(hào)肽引導(dǎo)m-hbsag抗原的表達(dá)，能夠提高抗原的表達(dá)效率，增強(qiáng)其免疫效應(yīng)，產(chǎn)生更強(qiáng)的抗hbv特異性的免疫反應(yīng)。

(3)采用慢病毒作為表達(dá)載體，對(duì)dc細(xì)胞感染率高，并且m-hbsag抗原基因能穩(wěn)定整合至dc細(xì)胞基因組中并長(zhǎng)期表達(dá)，大量的m-hbsag抗原持續(xù)刺激和活化dc，從而提高dc抗原遞呈的效率。

附圖說(shuō)明

圖1為對(duì)照組、m-hbsag疫苗組與gm-csfrsp-m-hbsag組的野生型小鼠hbsag特異性t細(xì)胞應(yīng)答對(duì)比圖；

圖2為對(duì)照組、m-hbsag疫苗組與gm-csfrsp-m-hbsag組的耐受型小鼠hbsag特異性t細(xì)胞應(yīng)答對(duì)比圖；

圖3為對(duì)照組、m-hbsag疫苗組與gm-csfrsp-m-hbsag組的耐受型小鼠血清中hbsag抗原水平對(duì)比圖；

圖4為對(duì)照組、m-hbsag疫苗組與gm-csfrsp-m-hbsag組的耐受型小鼠血清中hbsag抗體水平對(duì)比圖；

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施如下：

1.將基因片段gm-csfrsp-m-hbsag插入慢病毒表達(dá)載體plent-c-gfp。

(1)gm-csfrsp核酸人工序列(seqidno.1)

(2)m-hbsag核酸人工序列(seqidno.2)

gm-csfrsp-m-hbsag的核酸人工序列的兩端分別加noti和asisi位點(diǎn)酶切位點(diǎn)(seqidno.4)，委托生工生物工程有限公司合成兩個(gè)完整的表達(dá)框，酶切處理后插入慢病毒plent-c-gfp載體(invitrogen)noti-asisi位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化到e.coli(dh5α)，經(jīng)核酸測(cè)序鑒定正確后，使用qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒提取并純化質(zhì)粒，獲得重組表達(dá)載體的高品質(zhì)質(zhì)粒。

2.重組慢病毒包裝，滴度檢測(cè)

將慢病毒包裝細(xì)胞系293t接種于含有dmem+10％fbs10cm培養(yǎng)皿中，37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)，貼壁率為70％-80％后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。慢病毒包裝質(zhì)粒和目的表達(dá)質(zhì)粒采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，具體方法參考分子克隆。轉(zhuǎn)染后24h后，細(xì)胞明顯增大、呈球形，細(xì)胞核變大，變圓，貼壁能力下降而易脫落。48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白表達(dá)。72h后，收集上清，過(guò)濾除菌，在-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)lenti-x^tmgostix^tm試劑盒(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司產(chǎn)品)測(cè)定病毒滴度，結(jié)果表明，重組gm-csfrsp-m-hbsag慢病毒的滴度2.74×10⁶pfu/ml。

3.未成熟dc(imdc)的誘導(dǎo)

采集慢性乙型肝炎病人外周靜脈血50ml，利用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)基(購(gòu)自takara公司，gt-t551)中，37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)2-3小時(shí)后，倒掉懸浮t細(xì)胞，留取貼壁細(xì)胞，并加入細(xì)胞因子rhil-4(終濃度：50ng/ml)，rhgm-gsf(終濃度100ng/ml)，誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞分化成dc，每隔48小時(shí)更換新培養(yǎng)基，培養(yǎng)第5天得到imdc。

4.重組慢病毒分別感染imdc及dc細(xì)胞的成熟

將imdc以1×10⁶個(gè)細(xì)胞/孔的量接種在12孔培養(yǎng)板中，以moi＝10的重組慢病毒感染上述imdc，感染8-12h后，用pbs洗滌細(xì)胞2-3次，加入成熟因子tnf-α繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)得到成熟的dc細(xì)胞(mdc)，通過(guò)倒置顯微鏡觀察dc成熟后細(xì)胞形態(tài)，探針檢測(cè)m-hbsag基因表達(dá)情況；pcr分析慢病毒載體染色體整合情況；流式細(xì)胞儀分析dc細(xì)胞成熟標(biāo)志的表達(dá)情況。重組慢病毒感染dc前體細(xì)胞后，m-hbsag陽(yáng)性細(xì)胞率都為92.3％以上，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，病毒感染組dc細(xì)胞的成熟標(biāo)志cd11c+cd86+的平均值為74.04％，cd11c+cd83+的平均值為88.05％，高表達(dá)cd83、cd86。該mdc可直接注射作為預(yù)防hbv的疫苗。

m-hbsag疫苗制備：

1.將基因片段m-hbsag分別插入慢病毒表達(dá)載體plent-c-gfp。

(1)m-hbsag核酸人工序列(seqidno.2)

m-hbsag的核酸人工序列的兩端分別加noti和asisi位點(diǎn)酶切位點(diǎn)(seqidno.3)，委托生工生物工程有限公司合成兩個(gè)完整的表達(dá)框，酶切處理后插入慢病毒plent-c-gfp載體(invitrogen)noti-asisi位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化到e.coli(dh5α)，經(jīng)核酸測(cè)序鑒定正確后，使用qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒提取并純化質(zhì)粒，獲得重組表達(dá)載體的高品質(zhì)質(zhì)粒。

2.重組慢病毒包裝，滴度檢測(cè)

將慢病毒包裝細(xì)胞系293t接種于含有dmem+10％fbs10cm培養(yǎng)皿中，37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)，貼壁率為70％-80％后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。慢病毒包裝質(zhì)粒和目的表達(dá)質(zhì)粒采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，具體方法參考分子克隆。轉(zhuǎn)染后24h后，細(xì)胞明顯增大、呈球形，細(xì)胞核變大，變圓，貼壁能力下降而易脫落。48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白表達(dá)。72h后，收集上清，過(guò)濾除菌，在-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)lenti-x^tmgostix^tm試劑盒(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司產(chǎn)品)測(cè)定病毒滴度，結(jié)果表明，重組m-hbsag慢病毒的滴度2.8×10⁶pfu/ml。

3.未成熟dc(imdc)的誘導(dǎo)

采集慢性乙型肝炎病人外周靜脈血50ml，利用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)基(購(gòu)自takara公司，gt-t551)中，37℃，5％的co2條件下培養(yǎng)2-3小時(shí)后，倒掉懸浮t細(xì)胞，留取貼壁細(xì)胞，并加入細(xì)胞因子rhil-4(終濃度：50ng/ml)，rhgm-gsf(終濃度100ng/ml)，誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞分化成dc，每隔48小時(shí)更換新培養(yǎng)基，培養(yǎng)第5天得到imdc。

4.重組慢病毒分別感染imdc及dc細(xì)胞的成熟

將imdc以1×10⁶個(gè)細(xì)胞/孔的量接種在12孔培養(yǎng)板中，以moi＝10的重組慢病毒感染上述imdc，感染8-12h后，用pbs洗滌細(xì)胞2-3次，加入成熟因子tnf-α繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)得到成熟的dc細(xì)胞(mdc)，通過(guò)倒置顯微鏡觀察dc成熟后細(xì)胞形態(tài)，探針檢測(cè)m-hbsag基因表達(dá)情況；pcr分析慢病毒載體染色體整合情況；流式細(xì)胞儀分析dc細(xì)胞成熟標(biāo)志的表達(dá)情況。重組慢病毒感染dc前體細(xì)胞后，m-hbsag陽(yáng)性細(xì)胞率都為92.3％以上，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，病毒感染組dc細(xì)胞的成熟標(biāo)志cd11c+cd86+的平均值為75.64％，cd11c+cd83+的平均值為88.34％，高表達(dá)cd83、cd86。

對(duì)比試驗(yàn)：

hbv特異性dc疫苗預(yù)防和治療慢性乙肝的效果

慢性hbv感染模型的建立，6-8周齡c57bl/6小鼠(購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)，雌性，屬spf(iii)級(jí)動(dòng)物)，尾靜脈高壓注射法注射10μgpaav/hbv1.2質(zhì)粒(購(gòu)自北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司)。在感染之后4周建立穩(wěn)定的hbv耐受及慢性hbv感染模型。通過(guò)該模型，我們驗(yàn)證本發(fā)明的一種慢性或乙肝治療性dc疫苗，準(zhǔn)備三組進(jìn)行對(duì)比，分別是對(duì)照組、m-hbsag疫苗組和本發(fā)明的一種慢性乙肝治療dc疫苗含有g(shù)m-csfrsp-m-hbsag組，其中對(duì)照組為空白對(duì)照組。

空白對(duì)照組不進(jìn)行任何處理；

m-hbsag疫苗組；以1×10⁶個(gè)細(xì)胞/次尾部注射m-hbsag疫苗進(jìn)行免疫治療，總共免疫兩次，第一次和第二次免疫間隔7天。

本發(fā)明的一種慢性乙肝治療dc疫苗組：以1×10⁶個(gè)細(xì)胞/次尾部注射本發(fā)明基于dc的hbv病毒疫苗進(jìn)行免疫治療，總共免疫兩次，第一次和第二次免疫間隔7天。通過(guò)elispot(購(gòu)自ebioscience公司)和elisa(購(gòu)自thermofisherscientific公司)檢測(cè)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，不論在野生小鼠還是耐受小鼠中，其都能夠誘導(dǎo)強(qiáng)勁的針對(duì)hbsag特異性t細(xì)胞免疫應(yīng)答。并且hbv耐受小鼠中產(chǎn)生的免疫反應(yīng)能夠完全清除血清中hbsag，同時(shí)誘導(dǎo)了部分的血清學(xué)hbsab的轉(zhuǎn)化，這在臨床上被認(rèn)為是hbv治愈的關(guān)鍵指標(biāo)，因此本發(fā)明所制備的疫苗具有更好的治療效果。

盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開(kāi)的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。

序列表

<110>山東興瑞生物科技有限公司

<120>一種慢性乙肝治療性dc疫苗

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>75

<212>dna

<213>gm-csfrsp人工序列

<400>1

atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctg60

atccccgacatccag75

<210>2

<211>843

<212>dna

<213>m-hbsag人工序列

<400>2

atgcagtggaactccacagcattccaccaaactctgcaagatcccagagtaggcggcctg60

tatcttcctgtaggtggctccagttcaggaacagtgaaccctgctccgaatattgcctct120

cacatctcgtcagtctccgcggcgactagggaccctgtaccgaacatgtcaaacatccca180

tcatcactcctaggactcctggccgccttacaggtggtgtatttcttgtggacaaaagtc240

ctcacaatgccacagagtctagactcgttgtggacttctctctcttttccacggcgagca300

cccgcgcgtcctggcctaaattcgcagcctccaacccctaatcactcaccaacctcttgt360

ccttcaatttgtcctggtcatcactggatgcgtctgtggcgttttatcatctacctctta420

gtcctgttgctatgcctcatcttcctcttggttcttctggactatcgaggtgtgttgccc480

gtttgtcctccacttccaggatcatcgaccaccggcacgggaccatgcaaaacctgcacg540

attcctcctcaaggaacctctttgattccctcatgttgctgtacaaaaccttcggacgga600

tcgtgcacctgtattcccatcccatcgtcctgggctttcgcaaagttcctatgggactgg660

gcctcagtccgtttctcctggctctcattactagcgccatttgttcagaggttcgcaggg720

ctttcccccgctgcttggcttttagctacatggatcatctggttctgggggccaaatctg780

ttcaacatcatgaatccctttataccgctgttaccacttttcttttggctctgggtatac840

att843

<210>3

<211>871

<212>dna

<213>兩端加酶切位點(diǎn)m-hbsag人工序列

<400>3

ggatccgcgatcgcatgcagtggaactccacagcattccaccaaactctgcaagatccca60

gagtaggcggcctgtatcttcctgtaggtggctccagttcaggaacagtgaaccctgctc120

cgaatattgcctctcacatctcgtcagtctccgcggcgactagggaccctgtaccgaaca180

tgtcaaacatcccatcatcactcctaggactcctggccgccttacaggtggtgtatttct240

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tcatctacctcttagtcctgttgctatgcctcatcttcctcttggttcttctggactatc480

gaggtgtgttgcccgtttgtcctccacttccaggatcatcgaccaccggcacgggaccat540

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tcctatgggactgggcctcagtccgtttctcctggctctcattactagcgccatttgttc720

agaggttcgcagggctttcccccgctgcttggcttttagctacatggatcatctggttct780

gggggccaaatctgttcaacatcatgaatccctttataccgctgttaccacttttctttt840

ggctctgggtatacattgcggccgcctcgag871

<210>4

<211>946

<212>dna

<213>兩端加酶切位點(diǎn)gm-csfrsp-m-hbsag人工序列

<400>4

cagtgaaccctgctccgaatattgcctctcacatctcgtcagtctccgcggcgactaggg240

accctgtaccgaacatgtcaaacatcccatcatcactcctaggactcctggccgccttac300

aggtggtgtatttcttgtggacaaaagtcctcacaatgccacagagtctagactcgttgt360

ggacttctctctcttttccacggcgagcacccgcgcgtcctggcctaaattcgcagcctc420

caacccctaatcactcaccaacctcttgtccttcaatttgtcctggtcatcactggatgc480

gtctgtggcgttttatcatctacctcttagtcctgttgctatgcctcatcttcctcttgg540

ttcttctggactatcgaggtgtgttgcccgtttgtcctccacttccaggatcatcgacca600

ccggcacgggaccatgcaaaacctgcacgattcctcctcaaggaacctctttgattccct660

catgttgctgtacaaaaccttcggacggatcgtgcacctgtattcccatcccatcgtcct720

gggctttcgcaaagttcctatgggactgggcctcagtccgtttctcctggctctcattac780

tagcgccatttgttcagaggttcgcagggctttcccccgctgcttggcttttagctacat840

ggatcatctggttctgggggccaaatctgttcaacatcatgaatccctttataccgctgt900

taccacttttcttttggctctgggtatacattgcggccgcctcgag946