本發(fā)明涉及醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種保護(hù)慢性心衰腎功能的藥物組合物。

背景技術(shù)：

慢性心力衰竭(chroniccardiacfailure,chf)是許多心血管疾病如心肌梗死、心肌病、高血壓心臟病發(fā)生發(fā)展的最終階段，而心力衰竭的發(fā)生則與心臟的逐步纖維化有關(guān)。心肌纖維化是指在心肌的正常組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過(guò)量積聚，心臟組織中膠原濃度和膠原容積分?jǐn)?shù)顯著增加或膠原成分發(fā)生改變。膠原纖維使心室壁的順應(yīng)性下降，僵硬度增加，舒張期充盈受限；冠狀動(dòng)脈的纖維化，使得管壁增厚，管腔狹窄，彈性降低，心肌細(xì)胞血供減少；心肌細(xì)胞壞死和瘢痕形成損害心肌的收縮功能。此外，心肌組織的電傳導(dǎo)異常，導(dǎo)致心律失常的發(fā)生。慢性心力衰竭是大部分心血管疾病發(fā)展的最終階段，是目前全世界范圍內(nèi)危及健康的主要問題之一，其藥物研究應(yīng)用前景廣泛。

心腎綜合征(cardio-renalsyndrome，crs)即心臟或腎臟對(duì)另一器官的損害不能代償時(shí)，互為因果,形成惡性循環(huán)，最終加速心臟和腎臟功能的共同損害和衰竭。1型心腎綜合征(crs1)的特點(diǎn)是心功能急性惡化的患者繼發(fā)急性腎臟損傷(acutekidneyinjury，aki)和腎功能不全。心力衰竭的直接或間接效應(yīng)可導(dǎo)致急性腎損傷和功能障礙。ii型為慢性心功能不全導(dǎo)致的慢性腎功能不全。腎功能損害可增加患者短期和遠(yuǎn)期的死亡率，而這種改變與心臟、腎臟的纖維化存在密切聯(lián)系。心腎器官的急性和慢性損傷可引起免疫細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞信號(hào)蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并活化成纖維細(xì)胞促使i、iii型膠原沉積，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)增多和心臟與腎臟不可逆的纖維化。因此，心腎綜合征機(jī)制研究和開發(fā)有效的抗纖維化的藥物是目前心功能衰竭及腎功能衰竭研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

循環(huán)和局部腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)參與了心肌纖維化的應(yīng)答。腎血管性高血壓動(dòng)物模型，即結(jié)扎一側(cè)腎動(dòng)脈，可導(dǎo)致循環(huán)ras系統(tǒng)顯著升高，左、右心室均出現(xiàn)纖維化。而部分結(jié)扎腎動(dòng)脈以下腹主動(dòng)脈，這種高血壓以壓力負(fù)荷增加為特點(diǎn)，不伴明顯ras系統(tǒng)的激活，則觀察不到早期纖維化反應(yīng)。這說(shuō)明ras系統(tǒng)在心肌纖維化發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。在ras系統(tǒng)中，血管緊張素ii與醛固酮對(duì)心肌纖維化作用機(jī)制不同，心肌纖維化反應(yīng)在輸注醛固酮3周后才開始出現(xiàn)，而輸注血管緊張素ii只需3-4天后即出現(xiàn)明顯的心肌纖維化。推測(cè)醛固酮對(duì)心肌纖維化的作用不是直接的。更進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)血管緊張素ii升高，不論是外源性(經(jīng)注射途徑)或是內(nèi)源性的(對(duì)腎缺血的反應(yīng))，與早期心肌壞死繼而出現(xiàn)修復(fù)性纖維化有關(guān)。而醛固酮應(yīng)用出現(xiàn)較晚期修復(fù)性纖維化，它本身不直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死。此外，大鼠皮下輸注醛固酮和鹽飼個(gè)月后，腎血管性高血壓和醛固酮輸注引起的高血壓模型中，醛固酮受體拮抗劑—螺內(nèi)酯在不降低血壓的情況下，仍具有抗纖維化的作用。這說(shuō)明血管緊張素ii與醛固酮導(dǎo)致修復(fù)性纖維化(本質(zhì)是心肌細(xì)胞壞死)的作用機(jī)制不同。它們對(duì)纖維膠原的代謝影響也可能存在差別。

近年來(lái)，心衰機(jī)制的研究中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(raas)的作用受到廣泛認(rèn)同，干預(yù)在心衰發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中被過(guò)度激活的raas系統(tǒng)的治療取得了成功。但是足量的轉(zhuǎn)換酶抑制劑對(duì)醛固酮的抑制也是暫時(shí)的，高達(dá)40％的患者在抗血管緊張素ii治療中出現(xiàn)醛固酮逃逸。醛固酮刺激蛋白合成，其增多的骨膠原蛋白是心肌纖維化和心血管重構(gòu)的重要因素。醛固酮逃逸使心衰的治療效果降低，使用其拮抗劑可進(jìn)一步降低心衰的總病死率。因此，抗醛固酮治療在心衰治療中具有重要作用。

安體舒通與醛固酮有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，兩者在遠(yuǎn)曲小管和集合管的皮質(zhì)部位起競(jìng)爭(zhēng)作用，是在細(xì)胞膜的鹽皮質(zhì)激素受體的水平上發(fā)生直接的拮抗作用，從而拮抗醛固酮作用。研究發(fā)現(xiàn)，安體舒通具有抗心肌纖維化作用，能夠降低心衰患者死亡率，是目前臨床最常用的醛固酮受體拮抗劑。

多項(xiàng)研究已證實(shí)醛固酮在腎臟疾病的氧化應(yīng)激，炎性反應(yīng)和纖維化過(guò)程中的重要性。在慢性腎臟疾病早期階段患者用螺內(nèi)酯治療的第一個(gè)月中，通過(guò)嚴(yán)密監(jiān)測(cè)腎功能和電解質(zhì)，發(fā)現(xiàn)使用螺內(nèi)酯是安全的。在慢性心衰大鼠模型中，安體舒通減少腎臟炎細(xì)胞浸潤(rùn)，減少纖維化，保護(hù)腎臟。

此外，安體舒通價(jià)格便宜，具有保鉀利尿的作用，臨床應(yīng)用廣泛并且常與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用。

松弛素(relaxin)，于1926年frederickhisaw在研究妊娠期間骨盆帶變化時(shí)首次發(fā)現(xiàn)，可引起恥骨韌帶的明顯松弛，故而得名。目前已明確，松弛素不僅在妊娠過(guò)程中具有重要作用，而且對(duì)非妊娠動(dòng)物的血管結(jié)構(gòu)和功能等也可產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn)松弛素可刺激一氧化氮和camp的合成，具有擴(kuò)張血管，降解膠原，調(diào)節(jié)液體平衡及阻礙血小板聚集的系列生物功能。

在患充血性心力衰竭患者的心房和心室肌中，內(nèi)源性松弛素均可持續(xù)高表達(dá)。慢性主動(dòng)脈弓縮窄的小鼠肥大左室中松弛素的表達(dá)增加了3-5倍。在異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌缺血損傷模型中，心肌和血漿中的松弛素水平以及心肌松弛素的mrna表達(dá)均明顯升高。自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneouslyhypertensiverat,shr)心臟的松弛素mrna和蛋白水平均顯著升高。松弛素在心血管系統(tǒng)中的作用已開展了廣泛的研究，其具有對(duì)左心房正性變頻及變力的效應(yīng)，擴(kuò)張血管降低血壓，保護(hù)和調(diào)節(jié)心肌肥大，參與心肌梗塞后的修復(fù)與再生等作用。研究已證實(shí)松弛素可降低多種心肌病模型(如松弛素基因缺陷；心臟過(guò)表達(dá)β2腎上腺素受體和高血壓)的左室纖維化。最近，松弛素也被證實(shí)可減輕大劑量異丙基腎上腺素誘導(dǎo)的心肌缺血性損傷模型中的心臟纖維化。這些研究證明松弛素是一種有效的抗纖維化因子。

松弛素對(duì)腎臟的保護(hù)作用已在不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)。小鼠敲除松弛素基因后導(dǎo)致腎臟肥大、功能障礙和纖維化，外源性松弛素治療改善腎小球和腎小管纖維化。松弛素改善老齡大鼠腎小球硬化，減少腎功能損傷。松弛素在腎臟乳頭狀壞死模型、血管緊張素ii誘導(dǎo)的高血壓模型和腎小球基底膜疾病模型中起到抗纖維化作用，此外，松弛素還具有增加腎臟血流，改善腎小球?yàn)V過(guò)率的作用。

本研究小組的前期研究證實(shí)了松弛素的抗心肌纖維化作用及保護(hù)腎臟作用，且證明其抗纖維化作用呈劑量依賴性。松弛素有望被用于人類心臟纖維化性疾病的治療，并同時(shí)保護(hù)腎臟。目前松弛素價(jià)格昂貴，需考慮藥物聯(lián)合治療，減少松弛素用量。因此，安體舒通及松弛素聯(lián)合治療方案為慢性心衰治療的腎臟保護(hù)提供了一種新思路。

近來(lái)，內(nèi)皮-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化或內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymaltransition，endmt)已被證實(shí)可促進(jìn)纖維化。與內(nèi)皮肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變類似，在endmt過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞逐漸失去其自身特點(diǎn)，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)的紡錘型，并逐漸獲得增殖、遷移和合成膠原等間充質(zhì)細(xì)胞的表型特點(diǎn)。endmt過(guò)程中涉及許多特異性生化因子的改變，主要包括內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志如血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(plateletendothelialcelladhesionmolecule-1,cd31),血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascularendothelialcadherin,ve—cadaerin),血管性血友病因子(vonwillibrandfactor,vwf)的表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin,α-sma)，波形蛋白(vimentin)和成纖維細(xì)胞特異性蛋白(fibroblastspecificprotein1,fsp1)的表達(dá)上調(diào)，通過(guò)這些細(xì)胞標(biāo)志物的改變可證實(shí)endmt的存在。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transcriptiongrowerfactor-β，tgf-β)具有促進(jìn)及誘導(dǎo)endmt現(xiàn)象產(chǎn)生的作用。在肺纖維化、肝纖維化、角膜纖維化、腸纖維化、傷口愈合、心臟纖維化和腎纖維化等多種疾病中，均發(fā)現(xiàn)存在endmt并參與了纖維化的發(fā)生發(fā)。zeisberg等首次證實(shí)endmt可導(dǎo)致腎臟纖維化，他們?cè)谌N腎纖維化模型中都發(fā)現(xiàn)，有相當(dāng)一部分肌成纖維細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物cd31(又稱血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1)及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-sma、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1。李等也證實(shí)在糖尿病腎臟纖維化早期存在endmt并可促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生。因此，endmt為心腎綜合征的機(jī)制研究提供了新的方向。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于對(duì)慢性心衰過(guò)程中腎臟保護(hù)提供一種保護(hù)慢性心衰腎功能的藥物組合物。安體舒通具有心臟、腎臟保護(hù)作用，且價(jià)格便宜，臨床應(yīng)用廣泛。松弛素同樣具有心臟、腎臟保護(hù)作用，其抗纖維化作用呈劑量依賴性，目前松弛素價(jià)格昂貴，需考慮藥物聯(lián)合治療，減少松弛素用量。本發(fā)明提供的保護(hù)慢性心衰腎功能的藥物組合物，由安體舒通和松弛素按質(zhì)量比15000：1混合組成。

本發(fā)明藥物組合物的治療效果優(yōu)于單藥治療，本發(fā)明在發(fā)生心肌纖維化的模型中，安體舒通與松弛素聯(lián)合應(yīng)用具有抗心肌纖維化作用。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明藥物組合物由安體舒通和松弛素按質(zhì)量比15000：1混合組成，它是含有效劑量的安體舒通和小劑量范圍的松弛素的聯(lián)合運(yùn)用。該藥物組合物具有心功能保護(hù)作用，腎臟保護(hù)作用，通過(guò)抑制endmt機(jī)制保護(hù)腎臟功能，為心腎綜合征的治療提供了新的思路。

附圖說(shuō)明

圖1，安體舒通及松弛素組合而成的藥物組合物在慢性心衰模型中升高lvsp、+dp/dtmax、-dp/dtmax，降低lvedp，效果優(yōu)于單藥治療；實(shí)驗(yàn)分組：空白組(control)；模型組(iso)；安體舒通組(iso+sp)；松弛組組(iso+rlx)；聯(lián)合治療組(iso+sp+rlx)。

圖2，安體舒通及松弛素組合而成的藥物組合物在慢性心衰模型中減少左心室質(zhì)量指數(shù)(lvwi)，右心室質(zhì)量指數(shù)(rvwi)及腎臟質(zhì)量指數(shù)(kwi)(p<0.05)，效果優(yōu)于單藥治療(p<0.05)。

圖3，安體舒通及松弛素組合而成的藥物組合物在慢性心衰模型中減少心肌組織間質(zhì)增生、心肌排列紊亂、心肌細(xì)胞肥厚、空泡形成，炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3a)，減少腎臟組織腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，纖維增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3b)，效果優(yōu)于單藥治療。

圖4，安體舒通及松弛素組合而成的藥物組合物在慢性心衰模型中減少心肌組織中藍(lán)色纖維組織面積(圖4a，c)及腎臟組織中藍(lán)色纖維組織面積(圖4b，d)(p<0.01)，減少心肌組織內(nèi)collagenⅰ及collageniii含量(圖4e)及腎臟組織內(nèi)collagenⅰ及collageniii含量(圖4f)(p<0.01)。聯(lián)合治療方案效果優(yōu)于單藥治療(p<0.05)。

圖5，安體舒通及松弛素組合而成的藥物組合物在慢性心衰模型中增加腎臟血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子熒光信號(hào)(plateletendothelialcelladhesionmolecule-1,cd31)，減少α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin,α-sma)熒光信號(hào)(圖5a,b)(p<0.01)，增加cd31蛋白表達(dá)，減少α-sma和tgf-β蛋白表達(dá)(圖5c,d和e)(p<0.01)，提示該藥物組合物抑制腎臟內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymaltransition，endmt)現(xiàn)象，效果優(yōu)于單藥治療(p<0.01)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

本發(fā)明通過(guò)試驗(yàn)確定了安體舒通及松弛素組合而成的藥物組合物在慢性心衰中的腎臟保護(hù)作用。

一、安體舒通及松弛素組合而成的藥物組合物保護(hù)心功能，效果優(yōu)于單藥治療。

(1)本發(fā)明利用異丙腎上腺素建立慢性心力衰竭心臟纖維化動(dòng)物模型。

(2)動(dòng)物分組：本發(fā)明選取50只雄性sd大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為5組：對(duì)照組，模型組，安體舒通組，松弛素組和聯(lián)合治療組。

(3)各組心臟功能評(píng)價(jià)：本發(fā)明中大鼠予右頸動(dòng)脈插管記錄分析lvsp、lvedp、+dp/dtmax及-dp/dtmax。結(jié)果表明：慢性心衰模型組lvsp、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低，lvedp升高。藥物組合物改善異丙腎上腺素對(duì)心功能的影響，效果優(yōu)于單藥治療(圖1)。

(4)測(cè)量左右心室質(zhì)量指數(shù)：本發(fā)明中大鼠行左心室質(zhì)量指數(shù)(lvwi)，右心室質(zhì)量指數(shù)(rvwi)測(cè)量。結(jié)果表明：慢性心衰模型組lvwi、rvwi升高。藥物組合物改善異丙腎上腺素對(duì)左右心室質(zhì)量指數(shù)的影響，效果優(yōu)于單藥治療(圖2a,b)。

(5)各組心肌組織學(xué)觀察：本發(fā)明中心肌組織行he染色。結(jié)果表明：慢性心衰模型組見廣泛的間質(zhì)增生，心肌排列紊亂、心肌細(xì)胞肥厚、空泡形成，炎細(xì)胞浸潤(rùn)。藥物組合物改善異丙腎上腺素引起的心肌組織學(xué)改變，效果優(yōu)于單藥治療(圖3a)。

(6)各組左室纖維化評(píng)價(jià)：

本發(fā)明中行masson‘trichome染色光鏡下測(cè)定左室纖維化面積。結(jié)果表明：慢性心衰模型組見大量藍(lán)色纖維化組織。藥物組合物減少左室纖維化面積，效果優(yōu)于單藥治療(圖4a,c)。

本發(fā)明中行心肌組織內(nèi)collagenⅰ及collageniii含量測(cè)定。結(jié)果表明：慢性心衰模型組心肌組織內(nèi)collagenⅰ及collageniii含量升高。藥物組合物減少慢性心衰模型中心肌組織內(nèi)collagenⅰ及collageniii含量，效果優(yōu)于單藥治療(圖4e)。

二、安體舒通及松弛素組合而成的藥物組合物保護(hù)腎功能，效果優(yōu)于單藥治療。

(1)測(cè)量腎臟質(zhì)量指數(shù):本實(shí)驗(yàn)中取雙腎稱量，計(jì)算腎臟質(zhì)量指數(shù)(kwi，mg/g)。結(jié)果表明：慢性心衰模型組腎臟質(zhì)量指數(shù)升高。藥物組合物減少慢性心衰模型中的腎臟質(zhì)量指數(shù)變化，效果優(yōu)于單藥治療(圖2c)。

(2)各組腎臟組織學(xué)觀察：本實(shí)驗(yàn)中行he染色法觀察腎臟組織學(xué)改變。結(jié)果表明：慢性心衰模型組腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，纖維增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。藥物組合物減少慢性心衰模型中的腎臟組織學(xué)變化，效果優(yōu)于單藥治療(圖3b)。

(3)各組腎臟纖維化評(píng)價(jià)：

masson‘trichome染色光鏡下測(cè)定腎臟纖維化面積。結(jié)果表明：慢性心衰模型組腎臟中見大量藍(lán)色纖維化組織。藥物組合物減少慢性心衰模型中的腎臟纖維化面積，效果優(yōu)于單藥治療(圖4b，d)。

elisa法測(cè)定腎臟組織內(nèi)collagenⅰ及collageniii含量。結(jié)果表明：慢性心衰模型組腎臟組織內(nèi)collagenⅰ及collageniii含量升高。藥物組合物減少慢性心衰模型中腎臟組織內(nèi)collagenⅰ及collageniii含量，效果優(yōu)于單藥治療(圖4f)。

三、安體舒通及松弛素組合而成的藥物組合物在慢性心衰模型中抑制腎臟endmt現(xiàn)象，效果優(yōu)于單藥治療。

(1)熒光免疫觀察各組腎臟組織cd31、α-sma表達(dá)：免疫熒光法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中α-sma(纖維性標(biāo)記蛋白)及cd31(內(nèi)皮性標(biāo)記蛋白)的表達(dá)以觀察endmt現(xiàn)象。結(jié)果表明：慢性心衰模型組腎臟組織內(nèi)cd31表達(dá)減少，α-sma增加，提示存在endmt現(xiàn)象。藥物組合物改善慢性心衰模型中的endmt現(xiàn)象，效果優(yōu)于單藥治療(圖5a，b)。

(2)westernblot法檢測(cè)各組腎臟組織tgf-β、cd31、α-sma的表達(dá)。結(jié)果表明：慢性心衰模型組腎臟組織內(nèi)cd31表達(dá)減少，tgf-β、α-sma增加，提示存在endmt現(xiàn)象。藥物組合物改善慢性心衰模型中的endmt現(xiàn)象，效果優(yōu)于單藥治療(圖c,d和e)。

具體實(shí)現(xiàn)如下：

1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件。

健康雄性sd大鼠(約6周)50只，體重200g-220g，標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)環(huán)境完全符合國(guó)際動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到小動(dòng)物生活所必需的基本空間要求。

2)動(dòng)物模型建立：利用異丙腎上腺素法建立大鼠慢性心衰模型。

3)動(dòng)物分組：清潔級(jí)wistar雄性大鼠50只，體質(zhì)量(220±10)g，隨機(jī)分為5組。模型組：大鼠背部皮下注射異丙腎上腺素，5mg/kg/d，共7天。對(duì)照組予等同量的生理鹽水。安體舒通組：大鼠灌胃給藥30mg/kg/d,共21天。松弛素組：大鼠皮下注射給藥2ug/kg/d,共21天。聯(lián)合治療組：大鼠安體舒通灌胃給藥，30mg/kg/d，松弛素皮下注射給藥2ug/kg/d(安體舒通和松弛素按質(zhì)量比15000：1)，共21天。

4)各組心臟功能評(píng)價(jià)：大鼠稱重后，1％的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。大鼠固定于鼠板，頸部去毛備皮，分離右頸動(dòng)脈，插入充滿0.05％肝素生理鹽水的導(dǎo)管至左心室，另一端接壓力換能器輸入多媒體生物信號(hào)記錄儀，記錄分析lvsp、lvedp、+dp/dtmax及-dp/dtmax。

5)測(cè)量左右心室質(zhì)量指數(shù)：大鼠取血后左心室灌注入4℃預(yù)冷的生理鹽水至心臟和腎臟變蒼白后，取出心臟稱量。左心室質(zhì)量除以體重計(jì)為左心室質(zhì)量指數(shù)(lvwi)，右心室質(zhì)量除以體重計(jì)為右心室質(zhì)量指數(shù)(rvwi)。

6)各組心肌組織學(xué)觀察：心肌組織行he染色，觀察其病理變化。取左心室心尖部少量組織(約80mg)，甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋。剩余部分裝入無(wú)菌凍存管并立即放入液氮中速凍保存，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱以用于其他檢測(cè)項(xiàng)目。

石蠟包埋過(guò)程：

⑴4℃，4％多聚甲醛固定，24h；

⑵清水沖洗；

⑶50％乙醇30min；

⑷75％乙醇30min；

⑸85％乙醇30min；

⑹95％乙醇40min；

⑺95％乙醇40min；

⑻100％乙醇ⅰ40min；

⑼100％乙醇ⅱ40min；

⑽二甲苯i浸泡30min；二甲苯ii浸泡30min；

⑾石蠟i，浸蠟2h；石蠟ii，浸蠟2h；

⑿標(biāo)本包埋；

he染色步驟：

⑴石蠟切片制作，厚度約4μm；

⑵常規(guī)脫蠟水化(100％二甲苯液i、ii脫蠟各15min，100％乙醇i、ii，95％乙醇i、ii，90％，80％乙醇水化各5min，超純水洗2min*2次)；

⑶蘇木素染色3min；

⑷超純水洗5分鐘；

⑸1％鹽酸酒精分化約5秒；

⑹超純水沖洗后鏡檢，觀察細(xì)胞核染色情況；

⑺超純水洗5分鐘；

⑻伊紅染色5min；

⑼超純水沖洗；

⑽脫水，透明，封片；

7)各組心肌組織膠原面積檢測(cè)：

心肌組織石蠟切片行masson染色，在masson染色下心肌細(xì)胞呈紅色，膠原呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈黑色。顯微鏡下觀察心肌間質(zhì)纖維化并于200倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)的視野并拍照。采用image-proplus軟件，測(cè)量心肌膠原面積，取平均值，數(shù)值越大纖維化越明顯。

masson染色步驟：

⑴石蠟切片制作，厚度約4μm；

⑵常規(guī)脫蠟水化；

⑶60℃包式液固定2h；

⑷超純水洗5分鐘*2次；

⑸蘇木素染5分鐘；

⑹超純水洗5分鐘*2次；

⑺麗春紅酸性品紅染3分鐘；

⑻超純水洗3分鐘；

⑼1％磷鉬酸中染10分鐘；

⑽不用水洗直接入苯胺藍(lán)液10分鐘，鏡下觀察纖維組織顏色；

⑾超純水洗3分鐘；

⑿快速脫水，二甲苯透明，封固；

8)各組心肌組織內(nèi)collagenⅰ及collageniii含量測(cè)定：100mg心肌組織剪碎并加入pbs(ph7.4)1ml，充分勻漿。離心20分鐘左右(3000轉(zhuǎn)/分)。收集上清。按elisa試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定：

⑴準(zhǔn)備：從冰箱中取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘；

⑵加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)的樣本：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白對(duì)照孔和待測(cè)樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl；待測(cè)樣本孔中加入待測(cè)樣本10μl，再加入樣本稀釋液40μl(即將樣本稀釋5倍)；空白對(duì)照孔不加；

⑶溫育：恒溫箱溫育30min；

⑷洗板：洗滌液反復(fù)洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干；

⑸加酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50μl，空白對(duì)照孔不加；

⑹溫育：恒溫箱溫育30min；

⑺洗板：同上；

⑻顯色：每孔加入顯色劑a液50μl，再加入顯色劑b液50μl，輕輕震蕩混勻30s；

⑼終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)；

⑽測(cè)定：以空白孔調(diào)零，反應(yīng)終止后30分鐘內(nèi)，用450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值；

⑾計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及相對(duì)應(yīng)的od值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線直線回歸方程，根據(jù)樣本的od值，利用回歸方程計(jì)算樣品的濃度；最終濃度為實(shí)際測(cè)定濃度乘以稀釋倍數(shù)；

9)各組腎臟質(zhì)量指數(shù)評(píng)價(jià):取雙腎稱量，平均值(mg)與體質(zhì)量(g)之比為即為腎臟質(zhì)量指數(shù)(mg/g)。

10)各組腎臟組織學(xué)觀察：he染色法觀察腎臟組織學(xué)改變。取腎臟少量組織(約80mg)，甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋。剩余部分裝入無(wú)菌凍存管并立即放入液氮中速凍保存，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱以用于其他檢測(cè)項(xiàng)目。

he染色步驟：

⑴石蠟切片制作，厚度約4μm；

⑵常規(guī)脫蠟水化(100％二甲苯液i、ii脫蠟各15min，100％乙醇i、ii，95％乙醇i、ii，90％，80％乙醇水化各5min，超純水洗2min*2次)；

⑶蘇木素染色3min；

⑷超純水洗5分鐘；

⑸1％鹽酸酒精分化約5秒；

⑹超純水沖洗后鏡檢，觀察細(xì)胞核染色情況；

⑺超純水洗5分鐘；

⑻伊紅染色5min；

⑼超純水沖洗；

⑽脫水，透明，封片；

11)各組腎臟組織膠原面積檢測(cè)：腎臟石蠟切片行masson染色，測(cè)量腎臟膠原面積，取平均值，數(shù)值越大纖維化越明顯。

12)各組腎臟組織內(nèi)collagenⅰ及collageniii含量測(cè)定。100mg腎臟組織剪碎并加入pbs(ph7.4)1ml，充分勻漿。離心20分鐘左右(3000轉(zhuǎn)/分)。收集上清。按elisa試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

13)各組腎臟內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化的評(píng)價(jià)：

(1)熒光免疫觀察各組腎臟組織cd31、α-sma熒光信號(hào)。本研究用免疫熒光法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中α–sma(纖維性標(biāo)記蛋白)及cd31(內(nèi)皮性標(biāo)記蛋白)的表達(dá)以觀察endmt現(xiàn)象。

免疫熒光步驟：

①石蠟切片制作，厚度約4μm；

②石蠟切片60℃烘烤2h；

③常規(guī)脫蠟水化；

④檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(ph＝6.0)高壓抗原修復(fù)3min，自然冷卻，0.1mpbs洗2min*3次；

⑤3％h2o2孵育10min，0.1mpbs洗2min*3次；

⑥10％胎牛血清室溫孵育30min，甩干；

⑦滴加混合一抗(α–sma抗體，博士德，稀釋濃度1:100；cd31抗體，abcam，稀釋濃度1：30)，4℃過(guò)夜，0.1mpbs洗5min*3次；

⑧滴加混合熒光二抗(1:300)，37℃避光孵育2h，0.1mpbs洗5min*6次，抗熒光淬滅封片劑封片。

(2)wb測(cè)α–sma、cd31、tgf-β表達(dá)。

主要溶液配制：

①6％分離膠5ml

超純水2.0ml

30％acr-bis(29:1)1.0ml

1mtris,ph8.81.9ml

10％sds0.05ml

10％過(guò)硫酸銨0.05ml

temed0.004ml

混勻后立即使用

②10％膠5ml

超純水1.3ml

30％acr-bis(29:1)1.7ml

1mtris,ph8.81.9ml

10％sds0.05ml

10％過(guò)硫酸銨0.05ml

temed0.002ml

混勻后立即使用

③5％濃縮膠2ml

超純水1.4ml

30％acr-bis(29:1)0.33ml

1mtris,ph6.80.25ml

10％sds0.02ml

10％過(guò)硫酸銨0.02ml

temed0.002ml

混勻后立即使用

④電泳緩沖液：

tris3.03g

甘氨酸14.4g

sdslg

超純水溶解至1000ml。

⑤轉(zhuǎn)移緩沖液：

tris3g

sdslg

甘氨酸14.4g

甲醇200ml

超純水定容至loooml,最多重復(fù)使用4次。

⑥5xtbs緩沖液：

tris12.1g

nacl40g

超純水溶解，濃hcl調(diào)ph值至7左右，定容至loooml。

⑦tbst緩沖液

20％tween201ml

tbs100ml

混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

⑧5％脫脂牛奶

脫脂奶粉5g

tbst100ml

溶解后4℃保存。使用時(shí)，恢復(fù)室溫、過(guò)濾后一次性使用。

wb實(shí)驗(yàn)步驟

⑴組織中總蛋白提?。?/p>

①取100mg組織塊置于1～2ml勻漿器球狀部位，用剪刀將組織盡量剪碎。

②加1000μl裂解液裂及10ulpmsf于勻漿器中，置于冰上進(jìn)行充分勻漿。

③冰上裂解1h，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管后－80℃保存。

⑵bca法測(cè)定總蛋白含

⑶sds－page電泳

配制6％或10％sds-page分離膠用于不同蛋白檢測(cè)，配置4％濃縮膠，緩慢灌注制膠，室溫下靜置凝固。將制備好的凝膠玻璃板固定于凝膠電泳儀上，電泳儀的上下兩槽分別加入電泳緩沖液。小心拔去加樣梳。計(jì)算含50μg蛋白的溶液體積為上樣量。加入5*sds上樣緩沖液至終濃度為1*，沸水浴10min使蛋白充分變性。分別加入各樣品及蛋白質(zhì)分子量marker，以1*樣品緩沖液配平上樣體積。初始為70v恒壓電泳至maker蛋白分層后改120v恒壓電泳加快電泳速度。電泳至溴酚蘭跑出凝膠。

⑷轉(zhuǎn)膜：取出膠板，切除濃縮膠。剪取同膠尺寸相同的pvdf膜，按陰極-濾紙-膠-pvdf膜-濾紙-陽(yáng)極順序放置于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移槽夾板中，以300ma恒流,電轉(zhuǎn)90min。

⑸封閉：5％脫脂牛奶封閉1h。

⑹免疫反應(yīng)：封閉結(jié)束后，用tbst洗膜10min*3次，將膜移入清潔抗體孵育盒中，加入一抗稀釋液(cd31抗體,santa，稀釋濃度1:1000；稀釋濃度1:1000；α-sma抗體,wuhanboshide,稀釋濃度1:1000；tgf-β1抗體，bioworldtechnology,稀釋濃度1:1000；gapdh抗體,bioworldtechnology，稀釋濃度1:5000)，蓋上盒蓋，膠布封口，4℃搖床孵育過(guò)夜；tbst洗膜10min*3次；再次將pvdf膜移入清潔抗體孵育盒中，加入稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔igg,bioworldtechnology，稀釋濃度1:5000—1：10000)，室溫孵育2h；tbst洗膜15min*3次；將pvdf膜置于ecl發(fā)光液中，于室溫下振蕩5min。

⑺顯影：凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)并記錄pvdf膜顯像

⑻圖像分析：

用image-proplus軟件對(duì)掃描圖象的目的條帶進(jìn)行灰度分析。

14)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用spss16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，單變量計(jì)量資料樣本均數(shù)比較用單因素方差分析(one-wayanova)，p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01為差異非常顯著。

上述實(shí)施例用來(lái)解釋說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。