本申請是申請日為2010年9月2日、申請?zhí)枮?01080039032.2、發(fā)明名稱為“免疫誘導劑”的專利申請的分案申請。

本發(fā)明涉及作為癌的治療劑和/或預防劑等有用的新的免疫誘導劑。

背景技術(shù)：

癌是占全部死亡原因的第一位的疾病，現(xiàn)在進行的治療以手術(shù)療法為主體組合了放射線療法和化學療法。盡管近年來開發(fā)了新的手術(shù)法、發(fā)現(xiàn)了新的抗癌劑，但是現(xiàn)狀是除了一部分癌以外，癌的治療成績沒有太大提高。近年來，由于分子生物學、癌免疫學的進步，鑒定出了由與癌反應的細胞毒性t細胞識別的癌抗原、編碼癌抗原的基因，對抗原特異性免疫療法的期待逐步提高。

在免疫療法中，為了減少副作用，需要被識別為其抗原的肽或蛋白在正常細胞中幾乎不存在，而在癌細胞中特異性地存在。1991年，ベルギーludwig研究所的boon等人通過使用了自體癌細胞株和癌反應性t細胞的cdna表達克隆法而分離出了由cd8陽性t細胞識別的人黑素瘤抗原mage1(非專利文獻1)。然后，報告了采用基因的表達克隆化的方法來鑒定由在癌患者的生物體內(nèi)與自體癌反應而產(chǎn)生的抗體識別的腫瘤抗原的serex(重組體表達克隆抗原的血清學鑒定，serologicalidentificationsofantigensbyrecombinantexpressioncloning)法(專利文獻1、非專利文獻2)，通過該方法，若干癌抗原被分離。進而以其一部分為靶標開始了癌免疫療法的臨床試驗。

另一方面，與人同樣地，在狗、貓中也已知乳腺腫瘤、扁平上皮癌等多種腫瘤，在狗、貓的疾病統(tǒng)計中也被列為上位。然而，對狗、貓的癌有效的治療藥、預防藥和診斷藥現(xiàn)在還不存在。基本上大部分的狗、貓的腫瘤是在發(fā)展而腫瘤變大之后飼養(yǎng)者才覺察到，大多即使入院通過外科手術(shù)切除、施用人體藥(抗癌劑等)也已經(jīng)錯過時間而處置后不久就死亡。在這樣的現(xiàn)狀中，如果能夠獲得對狗、貓有效的癌的治療藥和預防藥，則可期待開辟對狗的癌的用途。

報告了pds5a(pds5,regulatorofcohesionmaintenance,homologa)是也被稱為別名ssc-112的蛋白質(zhì)，被鑒定為參與染色體的分配時的細胞周期控制因子，與正常組織相比，在鼻咽癌、腎癌、肝癌、乳癌細胞的1種中表達高(專利文獻2、非專利文獻3～5)。而且報告了，通過使用與針對pds5a基因的反義核酸、核酶、sirna或pds5a蛋白質(zhì)特異性結(jié)合的抗體來抑制癌細胞中的pds5a的表達，可以抑制癌細胞的增殖，此外，通過施用pds5a全長蛋白質(zhì)或pds5a蛋白質(zhì)的部分肽，可以誘導癌細胞凋亡(專利文獻3)。此外，專利文獻3確認了癌細胞中pds5a蛋白質(zhì)的mrna量的增加。然而還沒有報告pds5a蛋白質(zhì)和該蛋白質(zhì)的部分肽具有對癌細胞的免疫誘導活性，從而該蛋白質(zhì)和該蛋白質(zhì)的部分肽在癌的治療、預防中是有用的，對pds5a蛋白質(zhì)是否具有作為能夠用于癌的診斷的標志物的功能還未被確認。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1:美國專利第5698396號

專利文獻2:wo2006/109943

專利文獻3:wo2002/081641

非專利文獻

非專利文獻1:science，254：1643-1647(1991)

非專利文獻2:proc.natl.acad.sci.usa，92：11810-11813(1995)

非專利文獻3:gene.17；328：187-96(2004)

非專利文獻4:j.cell.sci.15；118(pt10)：2133-41(2005)

非專利文獻5:j.cancerres.clin.oncol.：134(4)：453-62(2008)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的課題

本發(fā)明的目的是，發(fā)現(xiàn)癌的治療劑和/或預防劑、或?qū)Π┑臋z測有用的新的多肽，提供該多肽的免疫誘導劑或?qū)Π┑臋z測的應用。

用于解決課題的手段

本申請發(fā)明者們深入研究的結(jié)果是，通過使用了來源于狗乳癌的cdna文庫和荷瘤狗的血清的serex法，取得編碼與來源于荷瘤生物體的血清中存在的抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)的cdna，以該cdna為基礎，制作具有序列號2所示的氨基酸序列的狗pds5,regulatorofcohesionmaintenance,homologa(以下，記為pds5a)蛋白。此外，以取得的基因的人和小鼠同源基因為基礎，制作具有序列號4或44所示的氨基酸的人pds5a(另外，序列號4相當于序列號44的部分序列。)和具有序列號6所示的氨基酸序列的小鼠pds5a。然后發(fā)現(xiàn)這些pds5a在乳癌、腦腫瘤、食道癌、肺癌、腎癌、大腸癌、肛周腺癌、神經(jīng)母細胞瘤和白血病的組織或細胞中特異性表達。此外還發(fā)現(xiàn)，通過對生物體施用這些pds5a，可以在生物體內(nèi)誘導針對pds5a的免疫細胞，以及可以使表達pds5a的生物體內(nèi)的腫瘤萎縮。此外還發(fā)現(xiàn)，能夠表達編碼pds5a的全長蛋白質(zhì)或其片段的多核苷酸的重組載體對表達pds5a的癌在生物體內(nèi)誘導抗腫瘤效果。

此外還發(fā)現(xiàn)，pds5a的部分肽通過抗原呈遞細胞被呈遞，具有使對該肽特異性的細胞毒性t細胞活化和增殖的能力(免疫誘導活性)，因此，該肽對癌的治療和/或預防是有用的，而且，與該肽接觸的抗原呈遞細胞、與該抗原呈遞細胞接觸的t細胞對癌的治療和/或預防是有用的，從而完成了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明具有以下的特征。

(1).一種免疫誘導劑，其中，作為有效成分，含有選自以下(a)～(c)的任一多肽類、并且具有免疫誘導活性的至少1種多肽，或者含有包含編碼該多肽的多核苷酸、并能夠在生物體內(nèi)表達該多肽的重組載體，

(a)由序列表的序列號2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的連續(xù)7個以上氨基酸組成的多肽，

(b)與所述(a)的多肽具有90％以上的序列同一性、并且由7個以上氨基酸組成的多肽，

(c)包含所述(a)或(b)的多肽作為部分序列的多肽。

(2).根據(jù)(1)所述的免疫誘導劑，所述(b)的多肽是與所述(a)的多肽具有95％以上的序列同一性的多肽。

(3).根據(jù)(1)所述的免疫誘導劑，所述具有免疫誘導活性的多肽是：由序列號2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的連續(xù)7個以上氨基酸組成的多肽、或包含該多肽作為部分序列的多肽；或者在由序列號2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的連續(xù)7個以上氨基酸組成的多肽中缺失、取代或添加了1個～數(shù)個氨基酸的多肽、或包含該多肽作為部分序列的多肽。

(4).根據(jù)(3)所述的免疫誘導劑，所述具有免疫誘導活性的多肽是具有序列表的序列號2、4、6、8、10、12或44的氨基酸序列的多肽。

(5).根據(jù)(3)所述的免疫誘導劑，所述具有免疫誘導活性的多肽是：由序列表的序列號2、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的aa111～140、aa211～240、aa248～278、aa327～357、aa459～522、aa909～972、aa959～1022、aa994～1057或aa1018～1080的區(qū)域內(nèi)的連續(xù)7個以上氨基酸組成的多肽、或包含該多肽作為部分序列的多肽；或者在由序列表的序列號2、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的aa111～140、aa211～240、aa248～278、aa327～357、aa459～522、aa909～972、aa959～1022、aa994～1057或aa1018～1080的區(qū)域內(nèi)的連續(xù)7個以上氨基酸組成的多肽中缺失、取代或添加了1個～數(shù)個氨基酸的多肽、或包含該多肽作為部分序列的多肽。

(6).根據(jù)(5)所述的免疫誘導劑，所述具有免疫誘導活性的多肽是：由序列表的序列號27～35所示的氨基酸序列組成的多肽、或包含該多肽作為部分序列并且氨基酸殘基數(shù)為10～12的多肽；或者在由序列表的序列號27～35所示的氨基酸序列組成的多肽中缺失、取代或添加了1個～數(shù)個氨基酸的多肽、或包含該多肽作為部分序列并且氨基酸殘基數(shù)為10～12的多肽。

(7).根據(jù)(1)～(6)的任一項所述的免疫誘導劑，其用于預防動物的癌。

(8).根據(jù)(5)或(6)所述的免疫誘導劑，其用于治療動物的癌。

(9).根據(jù)(7)或(8)所述的免疫誘導劑，所述癌是表達pds5a的癌。

(10).根據(jù)(7)～(9)的任一項所述的免疫誘導劑，所述癌是乳癌、腦腫瘤、食道癌、肺癌、腎癌、大腸癌、肛周腺癌、神經(jīng)母細胞瘤或白血病。

(11).根據(jù)(1)～(10)的任一項所述的免疫誘導劑，其還包含免疫增強劑。

(12).一種分離的抗原呈遞細胞，其包含所述具有免疫誘導活性的多肽與mhc分子的復合體。

(13).一種分離的t細胞，其選擇性結(jié)合所述具有免疫誘導活性的多肽與mhc分子的復合體。

(14).一種具有免疫誘導活性的多肽，該多肽是：由序列表的序列號27～35所示的氨基酸序列組成的多肽、或包含該多肽作為部分序列并且氨基酸殘基數(shù)為10～12的多肽；或者在由序列表的序列號27～35所示的氨基酸序列組成的多肽中缺失、取代或添加了1個～數(shù)個氨基酸的多肽、或包含該多肽作為部分序列并且氨基酸殘基數(shù)為10～12的多肽。

(15).一種癌的檢測方法，其包括下述步驟：針對從生物體分離出的試樣，測定由序列表的序列號2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列組成的多肽、或與該多肽具有90％以上的序列同一性的多肽的表達。

(16).一種免疫誘導方法，其包括下述步驟：向個體施用選自以下(a)～(c)的多肽類、并且具有免疫誘導活性的至少1種多肽，或者施用包含編碼該多肽的多核苷酸、并能夠在生物體內(nèi)表達該多肽的重組載體，

(a)由序列表的序列號2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的連續(xù)7個以上氨基酸組成的多肽，

(b)與所述(a)的多肽具有90％以上的序列同一性、并且由7個以上氨基酸組成的多肽，

(c)包含所述(a)或(b)的多肽作為部分序列的多肽。

發(fā)明的效果

根據(jù)本發(fā)明，提供對癌的治療和/或預防等有用的新的免疫誘導劑。如后述的實施例中具體所示，如果對生物體施用本發(fā)明中使用的多肽，則可以在生物體內(nèi)誘導免疫細胞，而且可以使已經(jīng)產(chǎn)生的癌縮小或萎縮。因此，該多肽對癌的治療、預防是有用的。

附圖說明

圖1是顯示鑒定出的pds5a基因的、在狗正常組織和腫瘤組織或癌細胞株中的表達模式的圖。參照編號1：狗pds5a基因在狗的各組織和細胞株中的表達模式，參照編號2：狗gapdh基因在狗的各組織和細胞株中的表達模式。

圖2是顯示鑒定出的pds5a基因的、在人正常組織和腫瘤組織或癌細胞株中的表達模式的圖。參照編號3：人pds5a基因在人的各組織和細胞株中的表達模式，參照編號4：人gapdh基因在人的各組織和細胞株中的表達模式。

圖3是顯示鑒定出的pds5a基因的、在小鼠正常組織和腫瘤組織或癌細胞株中的表達模式的圖。參照編號5：表示小鼠pds5a基因在小鼠的各組織和細胞株中的表達模式，參照編號6：表示小鼠gapdh基因在小鼠的各組織和細胞株中的表達模式。

圖4是顯示通過pds5a施用而確認了抗腫瘤效果(治療模型-神經(jīng)母細胞瘤細胞株)的圖。使用基因槍免疫僅載體、或編碼pds5a的質(zhì)粒，以癌部的面積、生存小鼠的比例來評價。此外，各組使用了10只小鼠。對小鼠1周進行2次觀察。數(shù)據(jù)以平均值±sd表示。參照編號7：表示載體的質(zhì)粒的施用組，參照編號8：表示編碼pds5a的質(zhì)粒的施用組。

圖5是顯示通過pds5a施用而確認了抗腫瘤效果(預防模型-神經(jīng)母細胞瘤細胞株)的圖。使用基因槍免疫僅載體、或編碼pds5a的質(zhì)粒，以癌部的面積、生存小鼠的比例來評價。此外，各組使用了10只小鼠。對小鼠1周進行2次觀察。數(shù)據(jù)以平均值±sd表示。參照編號9：表示載體的質(zhì)粒的施用組，參照編號10：表示編碼pds5a的質(zhì)粒的施用組。

圖6顯示圖4的實驗中的小鼠的生存的比例。參照編號11：表示載體的質(zhì)粒的施用組，參照編號12：表示編碼pds5a的質(zhì)粒的施用組。

圖7顯示圖5的實驗中的小鼠的生存的比例。參照編號13：表示載體的質(zhì)粒的施用組，參照編號14：表示編碼pds5a的質(zhì)粒的施用組。

圖8是顯示通過pds5a施用而確認了抗腫瘤效果(治療模型-大腸癌細胞株)的圖。使用基因槍免疫僅載體、或編碼pds5a的質(zhì)粒，以癌部的面積、生存小鼠的比例來評價。此外，各組使用了10只小鼠。對小鼠1周進行2次觀察。數(shù)據(jù)以平均值±sd表示。參照編號15：表示載體的質(zhì)粒的施用組，參照編號16：表示編碼pds5a的質(zhì)粒的施用組。

圖9是顯示通過pds5a施用而確認了抗腫瘤效果(預防模型-大腸癌細胞株)的圖。使用基因槍免疫僅載體、或編碼pds5a的質(zhì)粒，以癌部的面積、生存小鼠的比例來評價。此外，各組使用了10只小鼠。對小鼠1周進行2次觀察。數(shù)據(jù)以平均值±sd表示。參照編號17：表示載體的質(zhì)粒的施用組，參照編號18：表示編碼pds5a的質(zhì)粒的施用組。

圖10顯示圖8的實驗中的小鼠的生存的比例。參照編號19：表示載體的質(zhì)粒的施用組，參照編號20：表示編碼pds5a的質(zhì)粒的施用組。

圖11顯示圖9的實驗中的小鼠的生存的比例。參照編號21：表示載體的質(zhì)粒的施用組，參照編號22：表示編碼pds5a的質(zhì)粒的施用組。

圖12是顯示對具有序列表的序列號27～35所示的氨基酸序列的各多肽特異性的cd8陽性t細胞識別該多肽與hla-a0201的復合體而產(chǎn)生ifn-γ的圖。圖12中，橫軸的參照編號25～33分別表示使用序列號27～35的肽刺激t2細胞而得的hla-a0201陽性的cd8陽性t細胞的ifn-γ產(chǎn)生能力。參照編號23顯示未添加多肽而進行上述處理的情況的結(jié)果，參照編號24顯示添加序列號36所示的本發(fā)明的范圍外的多肽進行上述處理的結(jié)果。

圖13是顯示對具有序列表的序列號27～35所示的氨基酸序列的各肽特異性的cd8陽性t細胞的、對癌細胞的細胞毒活性的圖。圖13中，橫軸的參照編號36～44分別顯示使用序列號27～35的肽進行刺激而得的hla-a0201陽性的cd8陽性t細胞對t98g細胞的細胞毒活性。參照編號34顯示未添加多肽而進行了誘導的cd8陽性t細胞的細胞毒活性，參照編號35顯示使用陰性對照的肽(序列號36)進行了誘導的cd8陽性t細胞的細胞毒活性。

具體實施方式

作為在本發(fā)明的免疫誘導劑中作為有效成分而被包含的多肽，可列舉以下多肽。另外，在本發(fā)明中，“多肽”是指多個氨基酸通過肽鍵而形成的分子，不僅包含構(gòu)成的氨基酸數(shù)多的多肽分子，而且包含氨基酸數(shù)少的低分子量的分子(寡肽)、全長蛋白質(zhì)，本發(fā)明中也包含具有序列號2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列的pds5a的全長蛋白質(zhì)。

(a)：由具有序列表的序列號2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列的多肽中的連續(xù)7個以上氨基酸組成，并具有免疫誘導活性的多肽，

(b)：與(a)的多肽具有90％以上的序列同一性，由7個以上氨基酸組成，并具有免疫誘導活性的多肽，

(c)：包含(a)或(b)的多肽作為部分序列，并具有免疫誘導活性的多肽。

另外，在本發(fā)明中，“具有氨基酸序列”是指氨基酸殘基以這樣的順序排列。因此，例如，“具有序列號2所示的氨基酸序列的多肽”意味著，具有序列號2所示的metaspphethr……(中間省略)……aspleuglnarg的氨基酸序列的、大小為1337氨基酸殘基的多肽。此外，例如，有時將“具有序列號2所示的氨基酸序列的多肽”簡寫為“序列號2的多肽”。關(guān)于“具有堿基序列”這樣的表達也是同樣的。該情況下，“具有”這樣的用語可以以“由……組成”這樣的表達替換。

這里，“免疫誘導活性”意味著在生物體內(nèi)誘導能分泌干擾素等細胞因子的免疫細胞的能力。

上述多肽是否具有免疫誘導活性可以使用例如公知的酶聯(lián)免疫斑點(elispot)測定法等來確認。具體而言，例如后述的實施例中記載的那樣，從施用了要評價免疫誘導活性的多肽的生物體獲得外周血單核細胞等細胞，將該細胞與該多肽共培養(yǎng)，使用特異性抗體測定由該細胞產(chǎn)生的細胞因子產(chǎn)生量，從而可以測定該細胞中的免疫細胞數(shù)，由此可以評價免疫誘導活性。

此外，如后述的實施例中所記載的那樣，如果對荷瘤生物體施用上述(a)～(c)的重組多肽，則也可以通過其免疫誘導活性使腫瘤萎縮。因此，上述免疫誘導活性也可以作為抑制癌細胞增殖或使癌組織(腫瘤)縮小或消失的能力(以下，稱為“抗腫瘤活性”)來評價。多肽的抗腫瘤活性例如后述的實施例中具體記載的那樣，可以通過實際上對荷瘤生物體施用該多肽來研究腫瘤是否縮小等從而確認。

或者，通過研究用該多肽刺激的t細胞(即，與呈遞該多肽的抗原呈遞細胞接觸的t細胞)是否在生物體外對腫瘤細胞顯示細胞毒活性，也可以評價多肽的抗腫瘤活性。t細胞與抗原呈遞細胞的接觸如后述那樣，可以通過將兩者在液體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)來進行。細胞毒活性的測定可以通過例如int.j.cancer,58:p317,1994中記載的被稱為⁵¹cr釋放測定法的公知方法來進行。在將上述多肽用于癌的治療和/或預防用途的情況下，沒有特別的限制，但優(yōu)選以抗腫瘤活性作為指標來評價免疫誘導活性。

本發(fā)明公開的序列表的序列號2、4、6、8、10、12或44中分別顯示的氨基酸序列是通過使用了來源于狗精巢的cdna文庫和荷瘤狗的血清的serex法，作為來源于荷瘤狗的血清中特異性存在的抗體結(jié)合的多肽和該多肽的人(序列號4和44)、小鼠(序列號6)、牛(序列號8)、馬(序列號10)和雞(序列號12)同源因子而被分離出的pds5a蛋白質(zhì)的氨基酸序列(參照實施例1)。另外，對于作為狗pds5a的人同源因子的人pds5a，序列同一性為堿基序列94％、氨基酸序列99％，對于作為小鼠同源因子的小鼠pds5a，序列同一性為堿基序列91％、氨基酸序列99％，對于作為牛同源因子的牛pds5a，序列同一性為堿基序列95％、氨基酸序列99％，對于作為馬同源因子的馬pds5a，序列同一性為堿基序列96％、氨基酸序列99％，對于作為雞同源因子的雞pds5a，序列同一性為堿基序列83％、氨基酸序列98％。

上述(a)的多肽為由具有序列號2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列的多肽中的連續(xù)7個以上、優(yōu)選為連續(xù)8、9或10個以上氨基酸組成的多肽，其具有免疫誘導活性。特別優(yōu)選該多肽具有序列號2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列。另外，如本領(lǐng)域中公知的那樣，只要是約7個氨基酸殘基以上的多肽就能夠發(fā)揮抗原性和免疫原性。因此，只要是序列號2、4、6、8、10、12或44的氨基酸序列中的連續(xù)7個氨基酸殘基以上的多肽，就能夠具有免疫誘導活性，因此可以用于本發(fā)明的免疫誘導劑的調(diào)制。

此外，作為通過施用癌抗原多肽進行的免疫誘導的原理，已知多肽被抗原呈遞細胞攝取，然后在該細胞內(nèi)受到通過被肽酶分解而變成更小的片段，被呈遞至該細胞的表面上，細胞毒性t細胞等識別該片段，選擇性殺死呈遞該抗原的細胞。被呈遞至抗原呈遞細胞的表面上的多肽的尺寸比較小，以氨基酸數(shù)計為7～30左右。因此，從呈遞至抗原呈遞細胞上這樣的觀點出發(fā)，作為上述(a)的多肽，優(yōu)選形態(tài)之一為序列號2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的連續(xù)7～30左右，更優(yōu)選只要是由8～30或9～30左右的氨基酸組成的多肽即是充分的。這些比較小的尺寸的多肽也有時不攝取至抗原呈遞細胞內(nèi)，而直接被呈遞至抗原呈遞細胞上的細胞表面。

此外，被攝取到抗原呈遞細胞的多肽通過該細胞內(nèi)的肽酶而在任意位置被切割，產(chǎn)生各種多肽片段，這些多肽片段被呈遞至抗原呈遞細胞表面上，因此如果施用序列號2、4、6、8、10、12或44的全長區(qū)域那樣的大尺寸的多肽，則由于在抗原呈遞細胞內(nèi)的分解而在介由抗原呈遞細胞的免疫誘導中必然產(chǎn)生有效的多肽片段。因此，對于介由抗原呈遞細胞的免疫誘導而言，可以優(yōu)選使用尺寸大的多肽，氨基酸數(shù)可以為30以上，更優(yōu)選為100以上，進一步優(yōu)選為200以上，進一步優(yōu)選為250以上，進一步優(yōu)選為序列號2、4、6、8、10、12或44的全長區(qū)域的多肽。

此外，本發(fā)明的多肽可以通過能夠檢索由具有hla的各型結(jié)合基序的8～12個、優(yōu)選為9～10個氨基酸組成的表位肽的比對媒介例如bioinformatics&molecularanalysisselection(bimas)的hlapeptidebindingpredictions(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html)來比對，從而篩選能夠成為表位肽的肽。具體而言，優(yōu)選由序列號2、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的氨基酸殘基編號aa111～140、aa211～240、aa248～278、aa327～357、aa459～522、aa909～972、aa959～1022、aa994～1057或aa1018～1080的區(qū)域內(nèi)的連續(xù)7個以上氨基酸組成的多肽，此外更優(yōu)選在序列號4或44的多肽中序列號27～35所示的多肽，或者包含由序列號27～35所示的氨基酸序列組成的多肽作為部分序列、且氨基酸殘基數(shù)為10～12的多肽。

上述(b)的多肽是在上述(a)的多肽中取代、缺失和/或插入了少數(shù)(優(yōu)選為1個或數(shù)個)氨基酸殘基，與原序列具有90％以上、優(yōu)選為95％以上、更優(yōu)選為98％以上、進一步優(yōu)選為99％以上或99.5％以上的序列同一性，并且具有免疫誘導活性的多肽。一般而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在蛋白質(zhì)抗原中，有時即使在該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中取代、缺失或插入了少數(shù)氨基酸殘基，也與原蛋白質(zhì)具有幾乎相同的抗原性。因此，上述(b)的多肽也能夠發(fā)揮免疫誘導活性，因此可以用于本發(fā)明的免疫誘導劑的調(diào)制。此外，上述(b)的多肽也優(yōu)選為在序列號2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中取代、缺失和/或插入了1個～數(shù)個氨基酸殘基的多肽。本說明書中的“數(shù)個”表示2～10的整數(shù)，優(yōu)選為2～6的整數(shù)，更優(yōu)選為2～4的整數(shù)。

這里，氨基酸序列或堿基序列的“序列同一性”是指，以要比較的2個氨基酸序列(或堿基序列)的氨基酸殘基(或堿基)盡量多地一致的方式使兩氨基酸序列(或堿基序列)排列，將一致的氨基酸殘基數(shù)(或一致的堿基數(shù))除以全部氨基酸殘基數(shù)(或全部堿基數(shù))而得的結(jié)果以百比率表示的數(shù)值。在上述排列時，根據(jù)需要，在進行比較的2個序列的一者或雙者中插入適當缺口。這樣的序列的排列化可以使用例如blast、fasta、clustalw等公知的程序來進行。在插入了缺口的情況下，上述全部氨基酸殘基數(shù)為將1個缺口算作1個氨基酸殘基后的殘基數(shù)。這樣算出的全部氨基酸殘基數(shù)在進行比較的2個序列之間不同的情況下，序列同一性(％)是將一致的氨基酸殘基數(shù)除以較長序列的全氨基酸殘基數(shù)而算出的。

另外已知，構(gòu)成天然的蛋白質(zhì)的20種氨基酸可以如下分組成具有類似性質(zhì)的氨基酸：具有低極性側(cè)鏈的中性氨基酸(gly、ile、val、leu、ala、met、pro)、具有親水性側(cè)鏈的中性氨基酸(asn、gln、thr、ser、tyr、cys)、酸性氨基酸(asp、glu)、堿性氨基酸(arg、lys、his)、芳香族氨基酸(phe、tyr、trp)，如果在它們之間進行取代，則一般多肽的性質(zhì)無變化。因此，在取代本發(fā)明的上述(a)的多肽中的氨基酸殘基的情況下，通過在這些各組之間取代，可以維持免疫誘導活性的可能性較高，因此是優(yōu)選的。

另外，作為成為上述的表位肽的上述(b)的多肽，優(yōu)選為在由序列號2、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的aa111～140、aa211～240、aa248～278、aa327～357、aa459～522、aa909～972、aa959～1022、aa994～1057或aa1018～1080的區(qū)域內(nèi)的連續(xù)7個以上氨基酸組成的多肽中缺失、取代或添加了1個～數(shù)個氨基酸、并且具有免疫誘導活性的多肽，或者包含該多肽作為部分序列、并且具有免疫誘導活性的多肽，更優(yōu)選為在序列號4或44的多肽中或者由序列號27～35所示的氨基酸序列組成的多肽中缺失、取代或添加了1個～數(shù)個氨基酸、并且具有免疫誘導活性的多肽，或者包含該多肽作為部分序列、并且氨基酸殘基數(shù)為10～12的多肽。

上述(c)的多肽是包含上述(a)或(b)的多肽作為部分序列，并具有免疫誘導活性的多肽。即，是在(a)或(b)的多肽的一端或兩端添加了其它氨基酸或多肽，并具有免疫誘導活性的多肽。這樣的多肽也可以用于本發(fā)明的免疫誘導劑的調(diào)制。

另外，作為成為上述的表位肽的上述(c)的多肽，優(yōu)選為包含由序列號2、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列中的aa111～140、aa211～240、aa248～278、aa327～357、aa459～522、aa909～972、aa959～1022、aa994～1057或aa1018～1080的區(qū)域內(nèi)的連續(xù)7個以上氨基酸組成的多肽作為部分序列的多肽，更優(yōu)選為在序列號4或44的多肽中由序列號27～35所示的氨基酸序列組成的多肽中缺失、取代或添加了1個～數(shù)個氨基酸的多肽，或者包含該多肽作為部分序列、并包含氨基酸殘基數(shù)為10～12的多肽作為部分序列的多肽。

上述的多肽可以按照例如fmoc法(芴基甲氧羰基法)、tboc法(叔丁氧羰基法)等化學合成法來合成。此外，也可以利用各種市售的肽合成儀通過常規(guī)方法來合成。此外，可以通過使用公知的基因工程方法，制備編碼上述多肽的多核苷酸，將該多核苷酸整合到表達載體中并導入宿主細胞中，通過在該宿主細胞中生產(chǎn)多肽，從而獲得作為目標的多肽。

編碼上述多肽的多核苷酸可以通過公知的基因工程方法和/或使用市售的核酸合成儀的常規(guī)方法來容易地制備。例如，通過使用狗染色體dna或cdna文庫作為模板，使用以可以擴增序列號1中記載的堿基序列的方式設計的一對引物進行pcr，從而可以制備具有序列號1的堿基序列的dna。如果是具有序列號3或43的堿基序列的dna，可以通過使用人染色體dna或cdna文庫作為上述模板來同樣地制備。pcr的反應條件可以適當設定，可以列舉例如，將由在94℃經(jīng)30秒(變性)、在55℃經(jīng)30秒～1分鐘(退火)、在72℃經(jīng)2分鐘(伸長)構(gòu)成的反應歷程作為1循環(huán)，進行例如30循環(huán)后，在72℃反應7分鐘的條件等，但不限于此。此外，基于本說明書中的序列表的序列號1、3、5、7、9、11或43所示的堿基序列和氨基酸序列的信息，來制備適當?shù)奶结槨⒁铮褂盟鼈儊砗Y選狗、人等的cdna文庫，從而可以分離所需的dna。cdna文庫優(yōu)選由表達序列號2、4、6、8、10、12或44的蛋白質(zhì)的細胞、器官或組織來制作。上述的探針或引物的制備、cdna文庫的構(gòu)建、cdna文庫的篩選以及目標基因的克隆化等操作對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的，例如，可以按照例如モレキュラークロニング(分子克隆實驗指南)第2版，カレント·プロトコールズ·イン·モレキュラバイオロジー等中記載的方法來進行?？梢杂蛇@樣獲得的dna來獲得編碼上述(a)的多肽的dna。此外，編碼各氨基酸的密碼子是公知的，因此可以容易地特定編碼特定氨基酸序列的多核苷酸的堿基序列。因此，也可以容易地特定編碼上述(b)或(c)的多肽的多核苷酸的堿基序列，因此這樣的多核苷酸也可以使用市售的核酸合成儀通過常規(guī)方法來容易地合成。

作為上述宿主細胞，只要是能夠表達上述多肽的細胞即可，作為原核細胞的例子，可列舉大腸桿菌等，作為真核細胞的例子，可列舉猴腎細胞cos1、中國倉鼠卵巢細胞cho等哺乳動物培養(yǎng)細胞、芽殖酵母、裂殖酵母、蠶細胞、爪蟾卵細胞等，但不限于此。

在使用原核細胞作為宿主細胞的情況下，作為表達載體，使用具有能夠在原核細胞中復制的復制起點、啟動子、核糖體結(jié)合部位、dna克隆化部位、終止子等的表達載體。作為大腸桿菌用表達載體，可以例示puc系、pbluescriptii、pet表達系統(tǒng)、pgex表達系統(tǒng)等。如果將編碼上述多肽的dna整合到這樣的表達載體中，用該載體轉(zhuǎn)化原核宿主細胞，然后培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，則可以使由上述dna所編碼的多肽在原核宿主細胞中表達。此時，也可以使該多肽以與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的形式表達。

在使用真核細胞作為宿主細胞的情況下，作為表達載體，使用具有啟動子、剪接區(qū)域、多(a)添加部位等的真核細胞用表達載體。作為那樣的表達載體，可以例示pka1、pcdm8、psvk3、pmsg、psvl、pbk-cmv、pbk-rsv、ebv載體、prs、pcdna3、pmsg、pyes2等。與上述同樣地，如果將編碼上述多肽的dna整合到這樣的表達載體中，用該載體轉(zhuǎn)化真核宿主細胞，然后培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，則可以使由上述dna所編碼的多肽在真核宿主細胞中表達。在使用pind/v5-his、pflag-cmv-2、pegfp-n1、pegfp-c1等作為表達載體的情況下，可以作為添加了his標簽、flag標簽、myc標簽、ha標簽、gfp等各種標簽的融合蛋白質(zhì)來表達上述多肽。

表達載體向宿主細胞的導入可以使用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、deae葡聚糖法等公知的方法。

為了從宿主細胞中分離純化目的多肽，可以組合公知的分離操作來進行?？闪信e例如通過尿素等變性劑和/或表面活性劑進行的處理、超聲波處理、酶消化、鹽析和/或溶劑分級沉淀法、透析、離心分離、超濾、凝膠過濾、sds-page、等電點電泳、離子交換色譜法、疏水色譜法、親和色譜法、反相色譜法等，但不限于此。

通過以上的方法而獲得的多肽中如上所述也包含處于與其它任意的蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的形態(tài)的多肽。例如，可以例示與谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)和/或his標簽的融合蛋白質(zhì)等。這樣的融合蛋白質(zhì)形態(tài)的多肽也作為上述(c)的多肽而包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，有時在轉(zhuǎn)化細胞中被表達的多肽在被翻譯之后在細胞內(nèi)受到各種修飾。這樣的經(jīng)翻譯后修飾的多肽只要具有免疫誘導活性也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。作為這樣的翻譯后修飾，可以例示n末端蛋氨酸的脫離、n末端乙酰化、附加糖鏈、通過細胞內(nèi)蛋白酶進行的限制性分解、肉豆蔻?；?、異戊二烯基化、磷酸化等。

如后述的實施例中具體記載的那樣，如果對荷瘤生物體施用包含上述具有免疫誘導活性的多肽或編碼該多肽的基因的表達載體，則可以使已經(jīng)產(chǎn)生的腫瘤萎縮。此外，通過對癌發(fā)作前的生物體施用上述的具有免疫誘導活性的多肽或編碼多肽的基因，可以預防腫瘤的發(fā)生。因此，本發(fā)明的免疫誘導劑可以作為癌的治療劑和/或預防劑使用。此外，上述的具有免疫誘導活性的多肽可以用于通過免疫誘導進行的癌的治療和/或預防方法。

這里，“腫瘤”和“癌”這樣的用語意味著惡性贅生物，可互換使用。

在該情況下，作為對象的癌只要是表達pds5a的癌即可，則沒有特別的限制，但優(yōu)選為乳癌、腦腫瘤、食道癌、肺癌、腎癌、大腸癌、肛周腺癌、神經(jīng)母細胞瘤或白血病。

此外，作為對象的動物優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為包含靈長類、寵物、家畜類、競技用動物等的哺乳動物，特別優(yōu)選為人、狗或貓。

本發(fā)明的免疫誘導劑對生物體的施用途徑可以為經(jīng)口施用也可以為非經(jīng)口施用，但優(yōu)選為肌肉內(nèi)施用、皮下施用、靜脈內(nèi)施用、動脈內(nèi)施用等非經(jīng)口施用。在為了癌的治療而使用該免疫誘導劑的情況下，為了提高抗癌作用，如后述的實施例中記載的那樣，也可以施用于作為治療對象的腫瘤的附近的所屬淋巴結(jié)。施用量只要是對免疫誘導有效的量即可，例如如果是用于癌的治療和/或預防，則只要是對癌的治療和/或預防有效的量即可。對癌的治療和/或預防有效的量根據(jù)腫瘤的大小和/或癥狀等來適當選擇，通常作為相對于對象動物每1天的有效量為0.0001～1000μg，優(yōu)選為0.001～1000μg，可以1次施用或分成數(shù)次施用。優(yōu)選分成數(shù)次，每隔數(shù)日～數(shù)月地施用。如后述的實施例中具體所示那樣，本發(fā)明的免疫誘導劑可以使已經(jīng)形成的腫瘤萎縮。因此，對發(fā)生初期的少數(shù)癌細胞也能夠發(fā)揮抗癌作用，因而如果在癌的發(fā)作前、癌的治療后使用，則可以防止癌的發(fā)作、復發(fā)。即，本發(fā)明的免疫誘導劑對癌的治療和預防兩者均有用。

本發(fā)明的免疫誘導劑可以僅由多肽構(gòu)成，也可以適當混合適合各施用方式的藥理學上容許的載體、稀釋劑、賦形劑等添加劑來制劑。制劑方法和能夠使用的添加劑在藥物制劑的領(lǐng)域是公知的，可以使用任一方法和添加劑。作為添加劑的具體例，可列舉生理緩沖液那樣的稀釋劑；砂糖、乳糖、玉米淀粉、磷酸鈣、山梨糖醇、甘氨酸等那樣的賦形劑；糖漿、明膠、阿拉伯樹膠、山梨糖醇、聚氯乙烯、黃蓍膠等那樣的粘合劑；硬脂酸鎂、聚乙二醇、滑石、二氧化硅等潤滑劑等，但不限于這些。作為制劑形態(tài)，可以列舉片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、糖漿劑等經(jīng)口施用劑、吸入劑、注射劑、栓劑、可溶液體制劑等非經(jīng)口施用劑等。這些制劑可以通過一般已知的制法來制作。

本發(fā)明的免疫誘導劑可以與能夠強化生物體內(nèi)的免疫應答的免疫增強劑組合使用。免疫增強劑可以包含在本發(fā)明的免疫誘導劑中，也可以作為另一個組合物而與本發(fā)明的免疫誘導劑合并對患者施用。

作為上述免疫增強劑，可以列舉例如佐劑。佐劑通過提供抗原的儲存所(細胞外或巨噬細胞內(nèi))，活化巨噬細胞，并且刺激特定組的淋巴細胞，從而能夠強化免疫應答，因此可以提高抗癌作用。因此，特別是在將本發(fā)明的免疫誘導劑用于癌的治療和/或預防的情況下，免疫誘導劑優(yōu)選除了作為有效成分的上述多肽以外還包含佐劑。多種佐劑在本領(lǐng)域中是公知的，可以使用任一佐劑。作為佐劑的具體例，可列舉mpl(smithklinebeecham)、沙門氏菌屬的明尼蘇達沙門氏菌(salmonellaminnesota)re595脂多糖類的純化和酸水解后得到的同類物；從qs21(smithklinebeecham)、皂樹(quilljasaponaria)提取物中純化的純qa-21皂苷；pct申請wo96/33739(smithklinebeecham)中記載的dqs21；qs-7、qs-17、qs-18和qs-l1(so及其其他10人，“moleculesandcells”，1997年，第7卷，第178-186頁)；弗氏不完全佐劑；弗氏完全佐劑；維生素e；montanide；明礬；cpg寡核苷酸(例如參照kreig以及其他7人，“nature”，第374卷，第546-549頁)；由多聚ic及其衍生物(多聚iclc等)以及鯊烯和/或生育酚那樣的生物降解性油調(diào)制的各種油包水乳液。其中，優(yōu)選弗氏不完全佐劑、montanide、多聚ic及其衍生物以及cpg寡核苷酸。上述佐劑與多肽的混合比典型地為約1:10～10:1，優(yōu)選為約1:5～5:1，更優(yōu)選為約1:1。然而，佐劑不限于上述例示，本領(lǐng)域公知的除了上述佐劑以外的佐劑也能夠在施用本發(fā)明的免疫誘導劑時使用(例如，參照goding著,“monoclonalantibodies：principlesandpractice”，第2版，1986年)。多肽和佐劑的混合物或乳液的調(diào)制方法對于預防接種領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的。

此外，作為上述免疫增強劑，除了上述佐劑以外，也可以使用刺激對象的免疫應答的因子。例如，可以將具有刺激淋巴細胞、抗原呈遞細胞的特性的各種細胞因子作為免疫增強劑與本發(fā)明的免疫誘導劑組合使用。這樣的能夠增強免疫應答的多數(shù)細胞因子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，作為其例子，可列舉顯示強化疫苗的防御作用的白介素-12(il-12)、gm-csf、il-18、干擾素α、干擾素β、干擾素ω、干擾素γ和flt3配體，但不限于這些。這樣的因子也可以作為上述免疫增強劑使用，可以包含在本發(fā)明的免疫誘導劑中或作為另一個組合物與本發(fā)明的免疫誘導劑合并對患者施用。

此外，通過使上述多肽與抗原呈遞細胞在體外接觸，可以將該多肽呈遞至抗原呈遞細胞。即，上述(a)～(c)的多肽可以作為抗原呈遞細胞的處理劑來利用。這里，作為抗原呈遞細胞，可以優(yōu)選使用帶有mhc類i分子的樹突細胞或b細胞。已鑒定出各種mhci類分子，是公知的。人中的mhc分子稱為hla。作為hlai類分子，可以列舉hla-a、hla-b、hla-c，更具體而言，可以列舉hla-a1、hla-a0201、hla-a0204、hla-a0205、hla-a0206、hla-a0207、hla-a11、hla-a24、hla-a31、hla-a6801、hla-b7、hla-b8、hla-b2705、hla-b37、hla-cw0401、hla-cw0602等。

帶有mhci類分子的樹突細胞或b細胞可以通過公知的方法從外周血調(diào)制。例如，可以從骨髓、臍帶血或患者外周血，使用粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)和il-3(或il-4)來誘導樹突細胞，在其培養(yǎng)體系中加入腫瘤相關(guān)肽，可以誘導腫瘤特異性樹突細胞。

通過施用有效量的該樹突細胞，可以誘導癌的治療所期望的應答。所使用的細胞可以使用由健常人提供的骨髓和/或臍帶血、患者本人的骨髓和/或外周血等，但在使用患者本來的自體細胞的情況下，還可以期待安全性高、避免嚴重的副作用。外周血或骨髓可以為新鮮試樣、低溫保存試樣和冷凍保存試樣的任一種。關(guān)于外周血，可以培養(yǎng)全血，也可以僅分離出白血球成分來培養(yǎng)，但后者在效率方面是優(yōu)選的。此外在白血球成分中也可以分離出單核細胞。此外，在以骨髓、臍帶血為起源的情況下，可以培養(yǎng)構(gòu)成骨髓的整個細胞，也可以從其中分離出單核細胞來培養(yǎng)。外周血和/或其白血球成分、骨髓細胞中包含作為樹突細胞的起源的單核細胞、造血干細胞或未成熟樹突細胞、cd4陽性細胞等。所使用的細胞因子只要是確認了安全性和生理活性的特性細胞因子即可，可以為天然型或基因重組型等，與其生產(chǎn)方法無關(guān)，優(yōu)選以必要最低量使用確保了醫(yī)療用品質(zhì)的標品。添加的細胞因子的濃度只要是可誘導樹突細胞的濃度即可，沒有特別限定，通常以細胞因子的合計濃度計優(yōu)選為10～1000ng/ml左右，更優(yōu)選為20～500ng/ml左右。培養(yǎng)可以使用白血球的培養(yǎng)中通常使用的公知的培養(yǎng)基來進行。培養(yǎng)溫度只要能夠?qū)崿F(xiàn)白血球的增殖即可，沒有特別的限制，但最優(yōu)選為人的體溫37℃左右。此外，培養(yǎng)中的氣體環(huán)境只要能夠?qū)崿F(xiàn)白血球的增殖即可，沒有特別的限制，優(yōu)選通氣5％co2。此外，培養(yǎng)時間只要是誘導必要數(shù)目的細胞的時間即可，沒有特別的限制，通常進行3天～2周時間。供于細胞的分離、培養(yǎng)的設備可以使用適當?shù)脑O備，但優(yōu)選確認了醫(yī)療用安全性并且操作穩(wěn)定且簡便的設備。特別是關(guān)于細胞培養(yǎng)裝置，不限于培養(yǎng)皿、燒瓶、瓶等一般容器，也可以使用疊層型容器、多級式容器、滾瓶、轉(zhuǎn)瓶、袋式培養(yǎng)器、中空絲柱等。

使上述多肽與抗原呈遞細胞在體外接觸的方法本身可以通過公知的方法來進行。例如，可以通過將抗原呈遞細胞在包含上述多肽的培養(yǎng)液中培養(yǎng)來進行。對培養(yǎng)基中的肽濃度沒有特別的限制，但通常為1～100μg/ml左右，優(yōu)選為5～20μg/ml左右。對培養(yǎng)時的細胞密度沒有特別的限制，通常為10³～10⁷個細胞/ml左右，優(yōu)選為5×10⁴～5×10⁶個細胞/ml左右。培養(yǎng)優(yōu)選按照常規(guī)方法，在37℃、5％co2氣氛中進行。另外，抗原呈遞細胞可以呈遞至表面上的肽的長度通常最大為30氨基酸殘基左右。因此，雖然沒有特別的限制，但使抗原呈遞細胞與多肽在體外接觸的情況下，可以將該多肽調(diào)制成約30氨基酸殘基以下的長度。

通過在上述的多肽共存下培養(yǎng)抗原呈遞細胞，肽被抗原呈遞細胞的mhc分子攝取，呈遞至抗原呈遞細胞的表面。因此，可以使用上述多肽來調(diào)制包含該多肽與mhc分子的復合體的分離的抗原呈遞細胞。這樣的抗原呈遞細胞可以在生物體內(nèi)或體外對t細胞呈遞該多肽，誘導對該多肽特異性細胞毒性t細胞，使其增殖。

通過使以上述方式調(diào)制的包含上述多肽與mhc分子的復合體的抗原呈遞細胞與t細胞在體外接觸，可以誘導對該多肽特異性的細胞毒性t細胞，使其增殖。這可以通過將上述抗原呈遞細胞與t細胞在液體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)來進行。例如，可以如下進行：將抗原呈遞細胞懸浮在液體培養(yǎng)基中，放入微孔板的孔等容器中，在其中添加t細胞進行培養(yǎng)。對共培養(yǎng)時的抗原呈遞細胞與t細胞的混合比率沒有特別的限制，但通常以細胞數(shù)的比率計為1:1～1:100左右，優(yōu)選為1:5～1:20左右。此外，對懸浮在液體培養(yǎng)基中的抗原呈遞細胞的密度沒有特別的限制，但通常為100～1000萬個細胞/ml左右，優(yōu)選為10000～100萬個細胞/ml左右。共培養(yǎng)優(yōu)選按照常規(guī)方法在37℃、5％co2氣氛中進行。對培養(yǎng)時間沒有特別的限制，但通常為2天～3周，優(yōu)選為4天～2周左右。此外，共培養(yǎng)優(yōu)選在il-2、il-6、il-7和il-12那樣的白介素1種或多種的存在下進行。在該情況下，il-2和il-7的濃度通常為5～20u/ml左右，il-6的濃度通常為500～2000u/ml左右，il-12的濃度通常為5～20ng/ml左右，但不限于此。上述的共培養(yǎng)可以補加新鮮的抗原呈遞細胞重復進行1次～數(shù)次。例如，可以將舍棄共培養(yǎng)后的培養(yǎng)上清液，添加新鮮的抗原呈遞細胞的懸浮液再進行共培養(yǎng)這樣的操作重復1次～數(shù)次。各共培養(yǎng)的條件與上述同樣即可。

通過上述的共培養(yǎng)，可誘導并增殖對該多肽特異性的細胞毒性t細胞。因此，可以使用上述多肽來調(diào)制選擇性結(jié)合該多肽與mhc分子的復合體的分離的t細胞。

如后述的實施例中記載的那樣，編碼pds5a的基因分別在乳癌細胞、乳癌組織、腦腫瘤細胞、腦腫瘤組織、食道癌細胞、食道癌組織、肺癌細胞、肺癌組織、腎癌細胞、腎癌組織、大腸癌細胞、大腸癌組織、肛周腺癌組織、肛周腺癌細胞、神經(jīng)母細胞瘤細胞和白血病細胞中特異性表達。因此認為，在這些癌種類中，與正常細胞相比，pds5a顯著多地存在。癌細胞內(nèi)存在的pds5a的一部分被呈遞至癌細胞表面上的mhc分子，如果在生物體內(nèi)施用以上述方式調(diào)制的細胞毒性t細胞，則細胞毒性t細胞可以將該呈遞有pds5a的一部分的mhc分子作為標記來抑制癌細胞。此外，呈遞上述多肽的抗原呈遞細胞也可以在生物體內(nèi)誘導對該多肽特異性的細胞毒性t細胞，使其增殖，因此也可以通過將該抗原呈遞細胞施用于生物體內(nèi)來抑制癌細胞。即，使用上述多肽而調(diào)制的上述細胞毒性t細胞、上述抗原呈遞細胞也與本發(fā)明的免疫誘導劑同樣地作為癌的治療劑和/或預防劑是有用的。

在將上述的分離的抗原呈遞細胞、分離的t細胞施用于生物體的情況下，為了避免將這些細胞作為異物而攻擊的生物體內(nèi)的免疫應答，優(yōu)選如上所述使用上述(a)～(c)的多肽調(diào)制從接受治療的患者采集的抗原呈遞細胞或t細胞。

包含抗原呈遞細胞或分離的t細胞作為有效成分的癌的治療劑和/或預防劑的施用途徑優(yōu)選為靜脈內(nèi)施用、動脈內(nèi)施用那樣的非經(jīng)口施用。此外，施用量可根據(jù)癥狀、施用目的等來適當選擇，但通常為1個～10兆個，優(yōu)選為100萬個～10億個，優(yōu)選數(shù)天～數(shù)月施用1次。制劑可以為例如將細胞懸浮于生理緩沖鹽水中而得的制劑等，也可以與其它抗癌劑、細胞因子等合并使用。此外，也可以添加制劑領(lǐng)域中公知的1種或2種以上添加劑。

此外，也可以通過使編碼上述(a)～(c)的多肽的多核苷酸在對象動物的體內(nèi)表達，來在該生物體內(nèi)進行抗體生產(chǎn)、誘導細胞毒性t細胞，獲得與施用多肽同等的效果。即，本發(fā)明的免疫誘導劑可以是包含編碼上述的(a)～(c)的多肽的多核苷酸、并包含能夠在生物體內(nèi)表達該多肽的重組載體作為有效成分的免疫誘導劑。如后述的實施例所示那樣，能夠表達這樣的抗原多肽的重組載體被稱為基因疫苗。

用于制造基因疫苗的載體只要是能夠在對象動物細胞內(nèi)(優(yōu)選為哺乳動物細胞內(nèi))表達的載體即可，沒有特別的限定，可以是質(zhì)粒載體也可以是病毒載體，可以使用在基因疫苗領(lǐng)域公知的任何載體。另外，編碼上述多肽的dna、rna等多核苷酸，如上所述，可以通過常規(guī)方法容易地調(diào)制。此外，該多核苷酸向載體的整合可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來進行。

基因疫苗的施用途徑優(yōu)選為肌肉內(nèi)施用、皮下施用、靜脈內(nèi)施用、動脈內(nèi)施用等非經(jīng)口施用途徑，施用量可以根據(jù)抗原的種類等來適當選擇，但通常為每1kg體重，以基因疫苗的重量計為0.1μg～100mg左右，優(yōu)選為1μg～10mg左右。

作為利用病毒載體的方法，可列舉例如在反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、辛德畢斯病毒等rna病毒或dna病毒中整合編碼上述多肽的多核苷酸，使對象動物感染該病毒的方法。其中，特別優(yōu)選使用反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、牛痘病毒等的方法。

作為其它方法，可列舉直接在肌肉內(nèi)施用表達質(zhì)粒的方法(dna疫苗法)、脂質(zhì)體法、lipofectin法、顯微注射法、磷酸鈣法、電穿孔法等，特別優(yōu)選dna疫苗法、脂質(zhì)體法。

使編碼本發(fā)明中使用的上述多肽的基因?qū)嶋H上作為藥物起作用時，有將基因直接導入體內(nèi)的體內(nèi)(invivo)方法和從對象動物采集某種細胞在體外將基因?qū)朐摷毎⒃摷毎突伢w內(nèi)的體外(exvivo)方法(日経サイエンス，1994年4月，20-45頁，月刊藥事，1994年，第36卷，第1號，23-48頁，實驗醫(yī)學增刊，1994年，第12卷，第15號，及其引用文獻等)。更優(yōu)選invivo方法。

在通過invivo方法來施用的情況下，可根據(jù)治療目標的疾病、癥狀等通過適當施用途徑來施用。例如，可以施用于靜脈、動脈、皮下、肌肉內(nèi)等。在通過invivo方法來施用的情況下，例如可采用可溶液體制劑等制劑形態(tài)，一般而言，采用含有編碼作為有效成分的本發(fā)明的上述肽的dna的注射劑等，根據(jù)需要可以加入慣用的載體。此外，在含有該dna的脂質(zhì)體或膜融合脂質(zhì)體(仙臺病毒(hvj)-脂質(zhì)體等)中，可以為懸浮劑、冷凍劑、離心分離濃縮冷凍劑等脂質(zhì)體制劑的形態(tài)。

另外，在本發(fā)明中，所說的“序列號1所示的堿基序列”，除了序列號1中實際所示的堿基序列以外，也包含與其互補的序列。因此，所說的“具有序列號1所示的堿基序列的多核苷酸”，包含具有序列號1實際所示的堿基序列的單鏈多核苷酸、具有其互補的堿基序列的單鏈多核苷酸和由它們構(gòu)成的雙鏈多核苷酸。在調(diào)制編碼本發(fā)明中使用的多肽的多核苷酸的情況下，適當選擇任一堿基序列，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就可以容易地進行該選擇。

此外，本發(fā)明中使用的多肽為癌特異性表達，因此僅與荷瘤生物體中的血清特異性反應，因而本發(fā)明的多肽也可用于癌的檢測。

作為檢測上述癌的方法，使用從生物體分離出的試樣，測定由序列號2、4、6、8、10、12或44所示的氨基酸序列組成的多肽的表達，或者作為其同源因子的與該多肽具有90％以上、優(yōu)選為95％以上、更優(yōu)選為98％以上、進一步優(yōu)選為99％以上或99.5％以上的序列同一性的多肽的表達。作為使用上述試樣測定多肽的表達的方法，可列舉對試樣中所含的針對該多肽的抗體進行免疫測定的方法(第1方法)、對試樣中所含的該多肽本身進行免疫測定的方法(第2方法)和對試樣中所含的編碼該多肽的mrna進行測定的方法(第3方法)。本發(fā)明的方法可以以這些方法中的任一方法來測定多肽的表達。另外，在本發(fā)明中，“測定”這樣的用語包含檢測、定量和半定量的任一種。

這里，pds5a是通過使用來源于狗乳癌的cdna文庫和同一患狗的血清的serex法，作為與來源于荷瘤狗的血清中特異性存在的抗體(癌特異性抗體)結(jié)合的多肽而被鑒定出的(參照實施例1)。即，荷瘤狗生物體中，針對pds5a的抗體被特異性誘導出來。因此，通過測定荷瘤生物體內(nèi)的針對pds5a的抗體，也可以檢測表達pds5a的癌。此外，也可以通過上述第2方法來測定作為抗原的pds5a，從而檢測狗的癌。此外，如后述的實施例中記載的那樣，編碼該抗原多肽的mrna在癌細胞或癌組織、特別是乳癌細胞、乳癌組織、腦腫瘤細胞、腦腫瘤組織、食道癌細胞、食道癌組織、肺癌細胞、肺癌組織、腎癌細胞、腎癌組織、大腸癌細胞、大腸癌組織、肛周腺癌細胞、肛周腺癌組織、神經(jīng)母細胞瘤細胞和白血病細胞中與正常組織相比顯著地高表達(參照實施例1)，因此也可以通過測定該mrna來檢測狗的癌。

在上述第1方法中，能夠在試樣中存在的上述癌特異性抗體的測定可以通過使用與該抗體進行抗原抗體反應的抗原物質(zhì)的免疫測定來容易地進行。免疫測定法本身如下文所詳述的那樣為公知的常規(guī)方法。作為免疫測定的抗原物質(zhì)，可以使用上述(a)～(c)的多肽。此外，抗體存在交叉反應性，即使是實際上成為免疫原的抗原物質(zhì)以外的分子，如果分子上存在與免疫原的表位類似的結(jié)構(gòu)，則該分子也能夠通過抗原抗體反應而與被免疫原誘導的抗體結(jié)合。例如，氨基酸序列的序列同一性高的多肽彼此之間表位的結(jié)構(gòu)也多類似，在該情況下，兩者能夠顯示同一抗原性。如后述的實施例中具體記載的那樣，序列號4或44的來源于人的多肽與在荷瘤狗體內(nèi)誘導的上述抗體進行抗原抗體反應。因此，在本發(fā)明的第1方法中，作為免疫測定的抗原，也可以使用來源于任一哺乳動物的同源因子。

通常，在蛋白質(zhì)等那樣的具有復雜結(jié)構(gòu)的分子量大的抗原物質(zhì)的情況下，分子上存在結(jié)構(gòu)不同的多個部位。因此，在生物體內(nèi)，針對這樣的抗原物質(zhì)產(chǎn)生分別識別多個部位而結(jié)合的多種抗體。即，在生物體內(nèi)針對蛋白質(zhì)等抗原物質(zhì)而產(chǎn)生的抗體是作為多種抗體的混合物的多克隆抗體。另外，在本發(fā)明中所謂的“多克隆抗體”，是指來源于體內(nèi)包含抗原物質(zhì)的生物體的血清中存在的抗體，是針對該抗原物質(zhì)在該生物體內(nèi)誘導出的抗體。

試樣中的抗體的測定可以通過使用了上述多肽作為抗原的免疫測定來容易地進行。免疫測定本身在本領(lǐng)域中是公知的，如果以反應方式分類，則有夾心法、競爭法、凝集法、蛋白質(zhì)印跡法等。此外，如果以標記分類，則有放射免疫測定、熒光免疫測定、酶免疫測定、生物素免疫測定等，使用任一方法都可以進行上述抗體的免疫測定。沒有特別的限制，但夾層elisa、凝集法由于操作簡便且不需要大規(guī)模的裝置等，因此可以優(yōu)選用作本發(fā)明的方法中的上述抗體的免疫測定方法。在使用酶作為抗體的標記的情況下，作為酶，只要是滿足周轉(zhuǎn)數(shù)大、即使與抗體結(jié)合也穩(wěn)定、使底物特異性著色等條件的酶即可，沒有特別的制限，也可以使用通常的用于酶免疫測定法酶，例如，過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等。此外，也可以使用酶抑制物質(zhì)、輔酶等。這些酶與抗體的結(jié)合可以通過使用馬來酰亞胺化合物等交聯(lián)劑的公知的方法來進行。作為底物，可以根據(jù)所使用的酶的種類來使用公知的物質(zhì)。在例如使用過氧化物酶作為酶的情況下，可以使用3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺，此外在使用堿性磷酸酶作為酶的情況下，可以使用對硝基苯酚等。作為放射性同位素，可以使用¹²⁵i、³h等通常在放射免疫測定法中使用的物質(zhì)。作為熒光色素，可以使用異硫氰酸熒光素(fitc)、四甲基若丹明異硫氰酸酯(tritc)等通常在熒光抗體法中使用的物質(zhì)。

另外，這些免疫測定法本身是公知的，沒必要在本說明書中說明，但進行簡單地記載，例如，在夾心法中，將作為抗原使用的上述多肽固定化于固相，使其與血清等試樣反應，洗滌后，與適當?shù)亩狗磻?，洗滌后，測定與固相結(jié)合的二抗。通過將抗原多肽固定化于固相，可以容易地除去未結(jié)合的二抗，因此優(yōu)選作為本發(fā)明的癌的檢測方法的方式。作為二抗，例如試樣如果是來源于狗，則可以使用抗狗igg抗體。通過預先將二抗用上述例示的標記物質(zhì)標記，可以測定與固相結(jié)合的二抗。這樣測定的二抗量相當于血清試樣中的上述抗體量。在使用酶作為標記物質(zhì)情況下，加入通過酶作用而分解顯色的底物，在光學上測定底物的分解量，從而可以測定抗體量。在使用放射性同位素作為標記物質(zhì)的情況下，可以通過閃爍計數(shù)器來測定由放射性同位素所放射的放射線量。

在本發(fā)明的第2方法中，測定能夠在由生物體獲得的試樣中包含的、序列號2、4、6、8、10、12或44的多肽或其同源因子。如上所述，在癌患者中，與序列號2、4、6、8、10、12或44的多肽或其同源因子進行抗原抗體反應的癌特異性抗體的量顯著多，這顯示在癌患者體內(nèi)，作為該癌特異性抗體的抗原的這些多肽或其同源因子的產(chǎn)生量顯著多。因此，也可以通過測定序列號2、4、6、8、10、12或44的多肽或其同源因子，與上述第1方法同樣地，檢測生物體內(nèi)的癌。

試樣中的多肽的測定可以通過公知的免疫測定法來容易地進行。具體而言，例如，制作與序列號2、4、6、8、10、12或44所示的多肽或其同源因子進行抗原抗體反應的抗體或其抗原結(jié)合性片段，使用其進行免疫測定，從而可以測定能夠在試樣中存在的由序列號2、4、6、8、10、12或44所示的序列組成的多肽或其同源因子。免疫測定方法本身是如上所述的公知的常規(guī)方法。

這里，“抗原結(jié)合性片段”意味著抗體分子中所含的fab片段、f(ab’)2片段那樣的、具有與抗原的結(jié)合能力的抗體片段?？贵w可以是多克隆抗體也可以是單克隆抗體，但為了免疫測定等，優(yōu)選再現(xiàn)性高的單克隆抗體。以多肽為免疫原的多克隆抗體和單克隆抗體的制備方法是公知的，可以通過常規(guī)方法來容易地進行。例如，通過將使多肽與鑰孔血藍蛋白(klh)、酪蛋白等載體蛋白質(zhì)結(jié)合成的物質(zhì)作為免疫原，與佐劑一起對動物免疫，從而可以誘導針對該多肽的抗體?？梢允箯拿庖吆蟮膭游锊杉钠⒓毎⒘馨图毎菢拥目贵w產(chǎn)生細胞與骨髓瘤細胞融合來制作雜交瘤細胞，選擇產(chǎn)生與序列號2、4、6、8、10、12或44所示的多肽或其同源因子結(jié)合的抗體的雜交瘤細胞，使其增殖，從培養(yǎng)上清液得到以上述蛋白質(zhì)為對應抗原的單克隆抗體。另外，上述的方法是公知的常規(guī)方法。

本發(fā)明的第3方法測定能夠在從生物體獲得的試樣中包含的、編碼pds5a的mrna。如后述的實施例中具體所示那樣，編碼pds5a的mrna在癌、乳癌、腦腫瘤、食道癌、肺癌、腎癌、大腸癌、肛周腺癌、神經(jīng)母細胞瘤和白血病的組織或細胞中顯著高表達。因此，也可以通過測定試樣中的該mrna來檢測生物體內(nèi)的癌。

本發(fā)明的檢測方法基于如上所述測定的多肽的表達量來判斷對象生物體是否為癌等。癌的檢測也能夠僅測定對象生物體中的多肽的表達，但是從提高檢測精度的觀點出發(fā)，優(yōu)選研究1～多名健常人試樣中的多肽的表達量(抗體量、多肽量或mrna量)來取得健常人基準值，將對象生物體的測定值與該健常人基準值進行比較。此外在想要提高檢測精度的情況下，也可以對從已知罹患癌的多名患者得到的試樣研究多肽表達量來取得癌患者基準值，將對象生物體的測定值與健常人基準值和癌患者基準值兩者進行比較。上述基準值可以通過例如將各試樣中的多肽表達量數(shù)值化，算出其平均值來確定。另外，健常人基準值與癌患者基準值可以預先對多名健常人和癌患者研究多肽表達量來確定好。因此，在采用本發(fā)明的方法進行與基準值的比較的情況下，可以使用預先確定的基準值。

本發(fā)明的檢測方法中可以組合使用通過其它癌抗原、癌標記進行的檢測。由此，可以進一步提高癌的檢測精度。

根據(jù)本發(fā)明的檢測方法，可以檢測生物體內(nèi)的癌。根據(jù)本發(fā)明的方法，連眼睛看不見的小尺寸的腫瘤、體內(nèi)深部的腫瘤也可以檢測，因此對癌的早期發(fā)現(xiàn)是有用的。此外，如果對癌的治療后隨訪中的患者應用本發(fā)明的檢測方法，則可以在有癌的復發(fā)的情況下早期檢測到該癌。

此外，在荷瘤生物體中，如果表達本發(fā)明中作為測定對象的上述規(guī)定的多肽的癌細胞的數(shù)目增加，則相應地該生物體內(nèi)的該多肽及其mrna的蓄積量增大，血清中大量產(chǎn)生針對上述多肽的抗體。另一方面，如果癌細胞的數(shù)目減少，則相應地生物體內(nèi)的該多肽及其mrna的蓄積量減少，血清中的針對上述多肽的抗體減少。因此，在上述規(guī)定的多肽的表達量多的情況下，可以判斷為發(fā)生腫瘤的增大、癌的轉(zhuǎn)移，即癌的進行度進展。

此外，如后述的實施例所示那樣，在同一種類的腫瘤中，惡性型與良性型相比上述抗體量顯著多。因此，在上述規(guī)定的多肽的表達量多的情況下，可以判斷為癌的惡性度更高。即，根據(jù)本發(fā)明的方法，也可以檢測癌的惡性度。

此外，也可以將上述規(guī)定的多肽的表達量的增減作為指標來監(jiān)測癌的治療效果。因此，關(guān)于癌的治療中、治療后的個體，通過觀察上述多肽的表達量，可獲得抗癌劑的治療效果、腫瘤摘出后的殘存腫瘤有無、進而即使在隨訪中也可迅速獲知轉(zhuǎn)移、復發(fā)的線索。在進行了適當治療的情況下，多肽的表達量與治療前的荷瘤狀態(tài)相比降低，因此可以判斷為對該生物體進行的(正進行的)治療的效果良好。在多肽表達量上升或維持的情況下，或在觀察到暫時降低后再上升的情況下，可以判斷為治療效果不充分，成為向其它治療方法變更、抗癌劑施用量變更等治療方法選擇的有用判斷材料。

作為本發(fā)明的癌的檢測方法的對象的癌，是表達pds5a的癌，可列舉乳癌、腦腫瘤、食道癌、肺癌、腎癌、大腸癌、肛周腺癌、神經(jīng)母細胞瘤或白血病作為優(yōu)選例。此外，作為本發(fā)明的方法的對象的生物體優(yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人、狗、貓。

作為供于本發(fā)明的方法的試樣，可列舉血液、血清、血漿、腹水、胸水等體液、組織、細胞。特別是在上述第1方法和第2方法中，可以優(yōu)選使用血清、血漿、腹水和胸水，此外，在測定mrna的上述第3方法中，優(yōu)選組織試樣和細胞試樣。

第1方法中作為免疫測定的抗原使用的上述多肽可以作為癌檢測試劑提供。該試劑可以僅由上述多肽構(gòu)成，此外也可以包含對該多肽的穩(wěn)定化等有用的各種添加劑等。此外，該試劑也可以以固定化于板、膜等固相的狀態(tài)提供。

第2方法中對序列號2、4、6、8、10、12或44所示的多肽或其同源因子進行免疫測定時使用的、與該多肽或其同源因子進行抗原抗體反應的抗體或其抗原結(jié)合性片段也可以作為癌檢測試劑提供。該情況下的癌檢測試劑也可以僅由上述抗體或抗原結(jié)合性片段構(gòu)成，此外也可以包含對該抗體或抗原結(jié)合性片段的穩(wěn)定化等有用的各種添加劑等。此外，該抗體或抗原結(jié)合性片段可以結(jié)合有錳、鐵等金屬。如果將那樣的金屬結(jié)合抗體或抗原結(jié)合性片段施用于體內(nèi)，則在抗原蛋白質(zhì)更多存在的部位更多地集聚該抗體或抗原結(jié)合性片段，因此如果通過mri等來測定金屬，則可以檢測產(chǎn)生抗原蛋白質(zhì)的癌細胞的存在。

此外，第3方法中用于mrna的測定的上述癌檢測用多核苷酸也可以作為癌檢測試劑來提供。在該情況下，癌檢測用試劑也可以僅由該多核苷酸構(gòu)成，此外也可以包含對該多核苷酸的穩(wěn)定化等有用的各種添加劑等。該試劑中所含的該癌檢測用多核苷酸優(yōu)選為引物或探針。

實施例

以下，基于實施例更具體地說明本發(fā)明。

實施例1：通過serex法獲得新的癌抗原蛋白

(1)cdna文庫的制作

從荷瘤狗的乳癌組織通過酸-胍鹽-酚-氯仿法(acidguanidium-phenol-chloroform法)提取總rna，使用oligotex-dt30mrnapurificationkit(寶酒造社制)按照試劑盒所附的實驗方法純化多聚arna。

使用該獲得的mrna(5μg)來合成cdna噬菌體文庫。cdna噬菌體文庫的制作中使用cdnasynthesiskit、zap-cdnasynthesiskit、zap-cdnagigapackiiigoldcloningkit(stratagene社制)，按照試劑盒所附的實驗方法來制作文庫。制作的cdna噬菌體文庫的大小為1×10⁶pfu/ml。

(2)利用血清來篩選cdna文庫

使用上述制作的cdna噬菌體文庫進行免疫篩選。具體而言，使其以在φ90×15mm的nzy瓊脂糖板上為2340克隆的方式感染宿主大腸桿菌(xl1-bluemrf’)，在42℃培養(yǎng)3～4小時，制作噬斑(plaque)，用浸透了iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)的硝基纖維素膜(hybondcextra:gehealthecarebio-sciece社制)在37℃覆蓋板4小時，從而使蛋白質(zhì)誘導、表達，在膜上轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)。然后回收膜并浸泡在包含0.5％脫脂奶粉的tbs(10mmtris-hcl，150mmnacl(ph值7.5))中在4℃振蕩一晚，從而抑制非特異性反應。使該膜與500倍稀釋后的患狗血清在室溫反應2～3小時。

作為上述患狗血清，使用了從肛門附近腫瘤的患狗采集的血清。這些血清在-80℃保存，在即將使用前進行了前處理。血清的前處理方法采用以下的方法。即，使宿主大腸桿菌(xl1-bluemrf’)感染未插入外源基因的λzapexpress噬菌體后，在nzy板培養(yǎng)基上在37℃培養(yǎng)一晚。然后在板上加入包含0.5mnacl的0.2mnahco3(ph值8.3)的緩沖液，在4℃靜置15小時后，回收上清液作為大腸桿菌/噬菌體提取液。接下來，將回收的大腸桿菌/噬菌體提取液通入nhs-柱(gehealthecarebio-science社制)，將來源于大腸桿菌、噬菌體的蛋白質(zhì)固定化。使患狗血清通入該蛋白固定化柱并反應，從血清中除去吸附于大腸桿菌和噬菌體的抗體。經(jīng)過了柱的血清組分用包含0.5％脫脂奶粉的tbs進行500倍稀釋，將其作為免疫篩選材料。

將印跡有上述處理血清和上述融合蛋白質(zhì)的膜用tbs-t(0.05％tween20/tbs)進行洗滌4次后，使作為二抗的用包含0.5％脫脂奶粉的tbs進行了5000倍稀釋的山羊抗狗igg(goatantidogigg-h+ihrpconjugated：bethyllaboratories社制)在室溫反應1小時，通過使用了nbt/bcip反應液(roche社制)的酶顯色反應進行檢測，從φ90×15mm的nzy瓊脂糖板上采集與顯色反應陽性部位一致的菌落，使其溶解在sm緩沖液(100mmnacl，10mmmgclso4，50mmtris-hcl，0.01％明膠(ph值7.5))500μl中。采用與上述同樣的方法重復進行二次、三次篩選直到顯色反應陽性菌落單一化，對與血清中的igg進行反應的30940個噬菌體克隆進行篩選，分離出1個陽性克隆。

(3)分離的抗原基因的序列同一性檢索

為了將通過上述方法分離出的1個陽性克隆供于堿基序列分析，進行從噬菌體載體轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒載體的操作。具體而言，將以使吸光度od600為1.0的方式調(diào)制宿主大腸桿菌(xl1-bluemrf’)而得的溶液200μl與純化后的噬菌體溶液100μl以及exassisthelperphage(stratagene社制)1μl混合后，在37℃反應15分鐘后，添加3mllb培養(yǎng)基并在37℃進行培養(yǎng)2.5～3小時，立即在70℃的水浴中保溫20分鐘后，在4℃以1000×g離心15分鐘，回收上清液作為噬粒(phagemid)溶液。接著將以使吸光度od600為1.0的方式調(diào)制噬粒宿主大腸桿菌(solr)而得的溶液200μl與純化后的噬菌體溶液10μl混合，然后在37℃反應15分鐘，接種在50μl的含有氨芐青霉素(終濃度50μg/ml)的lb瓊脂培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)一晚。采集轉(zhuǎn)化后的solr的單菌落，在含有氨芐青霉素(終濃度50μg/ml)的lb培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)后，使用qiagenplasmidminiprepkit(キアゲン社制)純化具有目標插入片段的質(zhì)粒dna。

純化后的質(zhì)粒使用序列號13中記載的t3引物和序列號14中記載的t7引物，通過引物步移法進行插入片段全長序列的分析。通過該序列分析來獲得序列號1中記載的基因序列。使用該基因的堿基序列和氨基酸序列，進行序列同一性檢索程序blast搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)并進行與已知基因的序列同一性檢索，結(jié)果表明，所得的基因為pds5a基因。在作為狗pds5a的人同源因子的人pds5a中，序列同一性為堿基序列94％、氨基酸序列99％，在作為小鼠同源因子的小鼠pds5a中，序列同一性為堿基序列91％、氨基酸序列99％，在作為牛同源因子的牛pds5a中，序列同一性為堿基序列95％、氨基酸序列99％，在作為馬同源因子的馬pds5a中，序列同一性為堿基序列96％、氨基酸序列99％，在作為雞同源因子的雞pds5a中，序列同一性為堿基序列83％、氨基酸序列98％。將人pds5a的堿基序列示于序列號3和43，氨基酸序列示于序列號4和44，將小鼠pds5a的堿基序列示于序列號5，氨基酸序列示于序列號6，將牛pds5a的堿基序列示于序列號7，氨基酸序列示于序列號8，將馬pds5a的堿基序列示于序列號9，氨基酸序列示于序列號10，將雞pds5a的堿基序列示于序列號11，氨基酸序列示于序列號12。

(4)各組織中的表達分析

通過rt-pcr(reversetranscription-pcr)法來研究通過上述方法而獲得的基因在狗、人和小鼠的正常組織和各種細胞株中的表達。反轉(zhuǎn)錄反應如下進行。即，使用trizol試劑(invitrogen社制)按照所附的實驗方法從各組織50～100mg和各細胞株5～10×10⁶個細胞中提取總rna。使用該總rna通過superscriptfirst-strandsynthesissystemforrt-pcr(invitrogen社制)按照所附的實驗方法合成cdna。人正常組織(腦、海馬、精巢、結(jié)腸、胎盤)的cdna使用了基因庫cdna(invitrogen社制)、quick-clonecdna(クロンテック社制)和large-insertcdnalibrary(クロンテク社制)。pcr反應使用所取得的基因特異性的引物(狗引物在序列號15和16記載，人引物在序列號17和18記載，小鼠引物在序列號19和20記載)如下進行。即，按照通過反轉(zhuǎn)錄反應而調(diào)制的樣品0.25μl、上述引物各2μm、0.2mm的各dntp、0.65u的extaq聚合酶(寶酒造社制)的方式加入各試劑和所附緩沖液，使總量為25μl，使用thermalcycler(biorad社制)，將94℃-30秒，55℃-30秒，72℃-1分鐘的循環(huán)重復進行30次。為了進行比較對照，也同時使用了gapdh特異性的引物(狗和人gapdh引物在序列號21和22記載，小鼠gapdh引物在序列號23和24記載)。其結(jié)果是，如圖1所示，狗pds5a基因在健常的狗組織中在大部分組織中未觀察到表達，另一方面，在狗腫瘤組織中觀察到強的表達。人和小鼠pds5a基因的表達也與狗pds5a基因同樣，在人和小鼠正常組織中幾乎不能發(fā)現(xiàn)表達，在癌細胞中在大部分的細胞株中檢測到表達(圖2，3)。

實施例2：pds5a在生物體內(nèi)的癌抗原性的分析和藥效評價

(1)在生物體內(nèi)表達pds5a的重組載體的制作

以序列號5的堿基序列為基礎，采用以下的方法制作在生物體內(nèi)表達pds5a的重組載體。pcr通過在實施例1中觀察到表達的小鼠癌細胞株n2a(從atcc購入)來調(diào)制。如下進行：按照cdna1μl、包含noti和xhoi限制性酶切序列的2種引物(在序列號25和26記載)各0.4μm、0.2mmdntp、1.25u的primestarhs聚合酶(寶酒造社制)的方式加入各試劑和所附緩沖液，使總量為50μl，使用thermalcycler(biorad社制)，將98℃-10秒，55℃-15秒，72℃-4分鐘的循環(huán)重復進行30次。另外，上述2種引物是擴增編碼序列號5的氨基酸序列全長的區(qū)域的引物。pcr后，將擴增的dna用1％瓊脂糖凝膠進行電泳，使用qiaquickgelextractionkit(qiagen社制)純化約4000bp的dna片段。

將純化的dna片段與克隆載體pcr-blunt(invitrogen社制)連接。將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后回收質(zhì)粒，由測序確認了擴增后的基因片段與目標序列一致。將與目標序列一致的質(zhì)粒用noti和xhoi限制性酶處理，用qiaquickgelextractionkit純化后，將目標基因序列插入到用noti、xhoi限制性酶進行了處理的哺乳類表達載體pcdna3.1(invitrogen社制)中。通過使用該載體在哺乳類的細胞內(nèi)產(chǎn)生pds5a蛋白。

在由上述制作的質(zhì)粒dna100μg中添加50μg的金粒子(biorad社制)、亞精胺100μl(sigma社制)、1mcacl2100μl(sigma社制)，通過渦旋混合器進行攪拌，在室溫靜置10分鐘(以后記載為金-dna粒子)。以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘后，舍棄上清液，用100％乙醇(wako社制)洗滌3次。在金-dna粒子中加入100％乙醇6ml，通過渦旋混合器充分地攪拌后，將金-dna粒子注入tefzeltubing(biorad社制)中，使其在壁面沉淀。將附著有金-dna粒子的tefzeltubing的乙醇風干，切割成適合基因槍的長度。

(2)通過dna疫苗法制成的pds5a的抗腫瘤效果

在10只a/j小鼠(7周齡，雄，從日本slc社購入)和balb/c小鼠(7周齡，雄，從日本slc社購入)的皮下分別移植1×10⁶個小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞株n2a、大腸癌細胞株ct26后，將由上述制作的管固定于基因槍，使用純氦氣以400psi的壓力對剃毛后的小鼠的腹腔每隔7天透皮施用dna疫苗共計3次(質(zhì)粒dna接種量為2μg/只)，評價抗腫瘤效果(治療模型)。此外，同樣地操作，每隔7天對10只a/j小鼠和balb/c小鼠透皮施用dna疫苗共計3次后，移植n2a細胞、ct26細胞來評價抗腫瘤效果(預防模型)。另外，作為對照，將未插入pds5a基因的質(zhì)粒dna在各模型各施用10只。

抗腫瘤效果以腫瘤的大小(長徑×短徑²/2)和生存小鼠的比例來評價。將結(jié)果示于圖4～11中。本研究的結(jié)果是，在使用了神經(jīng)母細胞瘤細胞株的治療模型中，41天后，對照組和pds5a質(zhì)粒施用組中分別為569mm³、109mm³，pds5a質(zhì)粒施用組中觀察到了顯著的腫瘤的縮小(圖4)。同樣地在使用了神經(jīng)母細胞瘤細胞株的預防模型中，43日后，也在對照組和pds5a質(zhì)粒施用組中分別為476mm³、0mm³，pds5a質(zhì)粒施用組中觀察到了腫瘤的完全萎縮(圖5)。此外，在使用了大腸癌細胞株的治療模型中，41日后，對照組和pds5a質(zhì)粒施用組中分別為589mm³、189mm³，pds5a質(zhì)粒施用組中觀察到了顯著的腫瘤縮小(圖8)。同樣地在使用了大腸癌細胞株的預防模型中，43日后，也在對照組和pds5a質(zhì)粒施用組中分別為397mm³、43mm³，pds5a質(zhì)粒施用組中觀察到了顯著的腫瘤的縮小(圖9)。此外，觀察了使用了神經(jīng)母細胞瘤細胞株的兩模型中的生存的經(jīng)過，結(jié)果是，在治療模型中，對照組中施用后在84天全例死亡，與此相對，pds5a質(zhì)粒施用組中，60％的小鼠生存(圖6)。此外，在預防模型中，對照組中施用后在90天全例死亡，與此相對，施用了pds5a質(zhì)粒的組中，全部的小鼠生存(圖7)。此外，觀察了使用了大腸癌細胞株的兩模型中的生存的經(jīng)過，結(jié)果是，在治療模型中，對照組中在施用后84天全例死亡，與此相對，pds5a質(zhì)粒施用組中，40％的小鼠生存(圖10)。此外，在預防模型中，對照組中在施用后90天全例死亡，與此相對，施用了pds5a質(zhì)粒的組中，80％的小鼠生存(圖11)。

由以上的結(jié)果可知，pds5a質(zhì)粒施用組與對照組相比確認了顯著的抗腫瘤效果，因此表明了，pds5a為具有強的癌抗原性的癌抗原，對癌的治療和預防是有效的。

實施例3：肽表位反應性cd8陽性t細胞的誘導

為了預測人pds5a蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的hla-a0201結(jié)合基序，使用了公知的bimas軟件(可在(http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/)利用)的計算機預測程序來分析序列號4和44的氨基酸序列，選擇預想能夠與hlai類分子結(jié)合的、序列號27～35的多肽。

從hla-a0201陽性的健常人分離出外周血，疊層在lymphocyteseparationmedium(organonpteknika，durham，nc)上以1,500轉(zhuǎn)/分鐘在室溫離心分離20分鐘?；厥蘸型庵苎獑魏思毎?pbmc)的組分，在冷磷酸鹽緩沖液中洗滌3次(或3次以上)，得到了pbmc。將所得的pbmc懸浮在aim-v培養(yǎng)基(lifetechnololgies，inc.，美國紐約州grandisland)20ml中，在培養(yǎng)瓶(falcon)中在37℃、5％co2的條件下使其附著2小時。非附著細胞用于調(diào)制t細胞，附著細胞用于調(diào)制樹突細胞。

另一方面，將附著細胞在aim-v培養(yǎng)基中在il-4(1000u/ml)和gm-csf(1000u/ml)的存在下培養(yǎng)。6天后更換成添加了il-4(1000u/ml)、gm-csf(1000u/ml)、il-6(1000u/ml，genzyme，cambridge，ma)、il-1β(10ng/ml，genzyme，cambridge，ma)和tnf-α(10ng/ml，genzyme，cambridge，ma)的aim-v培養(yǎng)基，再培養(yǎng)2天后，使用所得的非附著細胞群作為樹突細胞。

將調(diào)制的樹突細胞在aim-v培養(yǎng)基中以1×10⁶個細胞/ml的細胞密度懸浮，分別以10μg/ml的濃度添加所選擇的多肽，使用96孔板在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，進行x射線照射(3000rad)，用aim-v培養(yǎng)基洗滌，在含有10％人ab血清(nabi，miami，fl)、il-6(1000u/ml)和il-12(10ng/ml，genzyme，cambridge，ma)的aim-v培養(yǎng)基中懸浮，在24孔板每1孔中分別添加1×10⁵個細胞。然后，分別以每1孔為1×10⁶個細胞添加調(diào)制的t細胞群，在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)。7天后，舍棄各培養(yǎng)上清液，與上述同樣地操作，將用所得的各多肽處理后進行了x射線照射的樹突細胞在含有10％人ab血清(nabi，miami,fl)、il-7(10u/ml，genzyme，cambridge，ma)和il-2(10u/ml，genzyme，cambridge，ma)的aim-v培養(yǎng)基中懸浮(細胞密度：1×10⁵個細胞/ml)，在24孔板每1孔中分別添加1×10⁵個細胞，再進行培養(yǎng)。每隔7天將同樣的操作重復4～6次后，回收被刺激的t細胞，通過流式細胞儀確認誘導了cd8陽性t細胞的誘導。

實施例4：刺激hla-a0201陽性cd8陽性t細胞的pds5a中的細胞毒性t細胞抗原表位的確定

通過顯微鏡下的細胞數(shù)計測確認了在上述誘導后的各孔的t細胞內(nèi)，被序列號27～35的各多肽刺激了的t細胞增殖了。對于觀察到了增殖的各t細胞，為了研究針對用于刺激的各多肽的特異性，對5×10⁴個被多肽刺激后的、表達hla-a0201分子的t2細胞(salterrdetal.，immunogenetics，21：235-246(1985)，從atcc購入)(以10μg/ml的濃度在aim-v培養(yǎng)基中添加各多肽，在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)4小時)添加5×10³個t細胞，采用96孔板在包含10％人ab血清的aim-v培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。取培養(yǎng)后的上清液，通過elisa法測定ifn-γ的產(chǎn)生量。其結(jié)果是，與使用了未進行多肽刺激的t2細胞的孔的培養(yǎng)上清液相比，在使用進行了序列號27～35的各多肽刺激的t2細胞的孔的培養(yǎng)上清液中，確認了ifn-γ產(chǎn)生(圖12)。因此表明了，序列號27～35的各多肽是具有特異性地刺激hla-a0201陽性cd8陽性t細胞增殖、誘導ifn-γ產(chǎn)生的能力的t細胞表位肽。另一方面，在添加具有序列號36所示的氨基酸序列的本發(fā)明的范圍外的多肽來進行上述處理的情況下，未發(fā)現(xiàn)ifn-γ產(chǎn)生(圖12)。

接下來研究了，作為本發(fā)明中使用的多肽的序列號27～35的各多肽是否是被呈遞至hla-a0201陽性且表達pds5a的腫瘤細胞上的hla-a0201分子上的多肽，以及被本多肽刺激了的cd8陽性t細胞是否能夠抑制hla-a0201陽性且表達pds5a的腫瘤細胞。

在10⁵個50ml容量的離心管中收集確認了pds5a的表達的惡性腦腫瘤細胞株、t98g(steinghetal.，j.cellphysiol.，99：43-54(1979)，從atcc購入)，加入100μci的鉻51，在37℃溫育2小時。然后用包含10％人ab血清的aim-v培養(yǎng)基洗滌3次，在96孔v底板每1孔中各添加10³個，然后在其中分別添加被懸浮在包含10％人ab血清的aim-v培養(yǎng)基中的10⁵、5×10⁴、2.5×10⁴和1.25×10⁴個被序列號27～35的各多肽刺激后的hla-a0201陽性的cd8陽性t細胞，在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)4小時。培養(yǎng)后，測定從受到抑制的腫瘤細胞釋放的培養(yǎng)上清液中的鉻51的量，從而算出被序列號27～35的各多肽刺激后的cd8陽性t細胞的細胞毒活性。

其結(jié)果表明了，被序列號27～35的各多肽刺激了的hla-a0201陽性的cd8陽性t細胞具有對t98g的細胞毒活性(圖13)。因此明確了，作為本發(fā)明中使用的多肽的序列號27～35的各多肽被呈遞至hla-a0201陽性且表達pds5a的腫瘤細胞上的hla-a0201分子上，而且這些多肽具有誘導能夠抑制這樣的腫瘤細胞的cd8陽性細胞毒性t細胞的能力。另一方面，在添加具有序列號36所示的氨基酸序列的本發(fā)明的范圍外的多肽來進行上述處理的情況下，未見細胞毒活性(圖13)。

另外，關(guān)于細胞毒活性，是顯示將上述那樣地用本發(fā)明中使用的各多肽刺激誘導后的cd8陽性t細胞10⁵個和攝取了鉻51的10³個惡性腦腫瘤細胞株t98g混合并培養(yǎng)4小時，培養(yǎng)后測定在培養(yǎng)基中釋放的鉻51的量，通過以下計算式＊算出的cd8陽性t細胞對t98g的細胞毒活性的結(jié)果。

＊式：細胞毒活性(％)＝加入了cd8陽性t細胞時從t98g游離的鉻51游離量÷從加入了1n鹽酸的靶細胞游離的鉻51游離量×100。

實施例5：重組pds5a蛋白質(zhì)的制作、藥效評價和癌的檢測和癌診斷

(1)重組pds5a蛋白質(zhì)的制作

以實施例1中取得的序列號1的基因為基礎，采用以下方法制作重組蛋白質(zhì)。pcr如下進行：按照由實施例1中獲得的噬粒溶液調(diào)制并供于序列分析的載體1μl、包含noti和xhoi限制性酶切序列的2種引物(在序列號37和38中記載)各0.4μm、0.2mmdntp、1.25u的primestarhs聚合酶(寶酒造社制)的方式加入各試劑和所附緩沖液，使總量為50μl，使用thermalcycler(biorad社制)，將98℃-10秒，55℃-15秒，72℃-4分鐘的循環(huán)重復進行30次。另外，上述2種引物是擴增編碼序列號2的氨基酸序列全長的區(qū)域的引物。pcr后，將被擴增的dna用1％瓊脂糖凝膠進行電泳，使用qiaquickgelextractionkit(qiagen社制)純化約4000bp的dna片段。

將純化后的dna片段與克隆載體pcr-blunt(invitrogen社制)連接。將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后回收質(zhì)粒，由測序確認了被擴增的基因片段與目標序列一致。將與目標序列一致的質(zhì)粒用noti和xhoi限制性酶處理，用qiaquickgelextractionkit純化后，將目標基因序列插入到用noti、xhoi限制性酶處理后的大腸桿菌用表達載體pet30a(novagen社制)中。通過該載體的使用可以產(chǎn)生his標簽融合型的重組蛋白質(zhì)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達用大腸桿菌bl21(de3)，通過1mmiptg進行表達誘導來使目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌內(nèi)表達。

此外，以序列號43的基因為基礎，采用以下的方法制作人pds5a的重組蛋白質(zhì)。pcr如下進行：按照由實施例1制作的各種組織和/或細胞cdna通過rt-pcr法確認了表達的cdna1μl、包含noti和xhoi限制性酶切序列的2種引物(在序列號39和40記載)各0.4μm、0.2mmdntp、1.25u的primestarhs聚合酶(寶酒造社制)的方式加入各試劑和所附緩沖液，使總量為50μl，使用thermalcycler(biorad社制)，將98℃-10秒，55℃-15秒，72℃-4分鐘的循環(huán)重復進行30次。另外，上述2種引物是擴增編碼序列號44的氨基酸序列全長的區(qū)域的引物。pcr后，將擴增的dna用1％瓊脂糖凝膠進行電泳，使用qiaquickgelextractionkit(qiagen社制)純化約4000bp的dna片段。

將純化后的dna片段與克隆載體pcr-blunt(invitrogen社制)連接。將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后回收質(zhì)粒，由測序確認了擴增的基因片段與目標序列一致。將與目標序列一致的質(zhì)粒用noti和xhoi限制性酶處理，用qiaquickgelextractionkit純化后，將目標基因序列插入到用noti、xhoi限制性酶處理后的大腸桿菌用表達載體pet30a(novagen社制)中。通過使用該載體可以產(chǎn)生his標簽融合型的重組蛋白質(zhì)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達用大腸桿菌bl21(de3)，通過1mmiptg進行表達誘導來使目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌內(nèi)表達。

此外，以序列號5的基因為基礎，用以下的方法制作小鼠pds5a的重組蛋白質(zhì)。pcr如下進行，按照由實施例1制作的各種組織和/或細胞cdna通過rt-pcr法確認了表達的cdna1μl、包含noti和xhoi限制性酶切序列的2種引物(在序列號41和42記載)各0.4μm、0.2mmdntp、1.25u的primestarhs聚合酶(寶酒造社制)的方式加入各試劑和所附緩沖液，使總量為50μl，使用thermalcycler(biorad社制)，將98℃-10秒，55℃-15秒，72℃-4分鐘的循環(huán)重復30次。另外，上述2種引物是擴增編碼序列號6的氨基酸序列全長的區(qū)域的引物。pcr后，將擴增的dna用1％瓊脂糖凝膠進行電泳，使用qiaquickgelextractionkit(qiagen社制)純化約4000bp的dna片段。

將純化后的dna片段與克隆載體pcr-blunt(invitrogen社制)連接。將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后回收質(zhì)粒，由測序確認了被擴增了的基因片段與目標序列一致。將與目標序列一致的質(zhì)粒用noti和xhoi限制性酶處理，用qiaquickgelextractionkit純化后，將目標基因序列插入到用noti、xhoi限制性酶處理后的大腸桿菌用表達載體pet30a(novagen社制)中。通過使用該載體可以產(chǎn)生his標簽融合型的重組蛋白質(zhì)。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達用大腸桿菌bl21(de3)，通過1mmiptg進行表達誘導來使目標蛋白質(zhì)在大腸桿菌內(nèi)表達。

(2)重組pds5a蛋白質(zhì)的純化

將由上述獲得的表達序列號2、序列號44或序列號6的各個重組大腸桿菌在含有100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)直到600nm的吸光度為0.7左右，然后添加異丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷使終濃度為1mm，再在37℃培養(yǎng)4小時。然后以4800轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘并收集菌體。將該菌體顆粒懸浮在磷酸緩沖化生理鹽水中，再以4800轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘并進行菌體的洗滌。

將該菌體懸浮在50mmtris-鹽酸緩沖液(ph值8.0)中，在冰上進行超聲波破碎。將大腸桿菌超聲波破碎液以6000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離20分鐘，將所得的上清液作為可溶性級分，將沉淀物作為不溶性級分。

將不溶性級分在50mmtris-鹽酸緩沖液(ph8.0)中懸浮，以6000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。將本操作重復2次，進行脫蛋白酶操作。

將該殘渣懸浮在含有6m鹽酸胍、0.15m氯化鈉的50mmtris-鹽酸緩沖液(ph值8.0)中，在4℃靜置20小時使蛋白質(zhì)變性。該變性操作后，將以6000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘而得的可溶性級分添加至按照常規(guī)方法調(diào)制的鎳螯合柱(載體：chelateingsepharose(商標)fastflow(gehealthcare社)，柱容量5ml，平衡化緩沖液：含有6m鹽酸胍、0.15m氯化鈉50mmtris-鹽酸緩沖液(ph值8.0))中，再在4℃靜置一晚并進行對鎳螯合化后的載體的吸附。將該柱載體以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘來回收上清液，對于柱載體，在磷酸緩沖化生理鹽水中懸浮后，再填充于柱中。

將柱未吸附級分用柱容量的10倍量的含有0.5m氯化鈉的0.1m乙酸緩沖液(ph值4.0)進行洗滌操作后，立即用含有0.5m氯化鈉的0.1m乙酸緩沖液(ph值3.0)進行溶出而作為純化級分，以后將該純化級分作為施用試驗用的材料。另外，各溶出組分中的目標蛋白質(zhì)通過按照常規(guī)方法進行的考馬斯染色確認。

將通過上述方法而獲得的純化標品置換到反應用緩沖液(50mmtris-hcl，100mmnacl，5mmcacl2(ph值8.0))中后，使用factorxacleavagecapturekit(novagen社制)按照所附實驗方法通過factorxa蛋白酶進行his標簽的切割和目標蛋白質(zhì)的純化。接下來，將通過上述方法而獲得的純化標品12ml使用超濾nanosep10komega(pall社制)進行生理用磷酸緩沖液(日水制藥社制)置換后，用htタフリンアクロディスク0.22μm(pall社制)進行無菌過濾，將其用于實驗。

(3)重組小鼠pds5a蛋白質(zhì)對荷瘤小鼠的抗腫瘤效果

在a/j小鼠(7周齡，雄，從日本slc社購入)的皮下移植1×10⁶個小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞株n2a，在腫瘤達到平均50～100mm³的時刻(典型地為腫瘤接種后7天)，將小鼠以1組10只的方式隨機分組，進行重組小鼠pds5a蛋白質(zhì)的抗腫瘤效果的評價(治療模型)。在如上所述純化后的重組小鼠pds5a蛋白質(zhì)100μg(0.5ml)中混合50μg的多聚ic來調(diào)制癌治療劑，將其對荷瘤小鼠每一周向皮下施用共計3次。其結(jié)果是，從癌治療劑施用起31天后，腫瘤完全萎縮。另一方面，pbs(-)施用陰性對照組和多聚ic單獨施用組(50μg)中，施用后31天后，腫瘤分別為平均1657mm³、平均932mm³。

此外，調(diào)制混合有重組小鼠pds5a蛋白質(zhì)100μg(0.5ml)和50μg的多聚ic的癌治療劑，將其對a/j小鼠每一周向皮下施用共計3次后，移植1×10⁶個n2a細胞來評價抗腫瘤效果(預防模型)。另外，1組為10只，作為比較對照，分成pbs(-)施用陰性對照組和多聚ic單獨施用組(50μg)。其結(jié)果是，施用了癌治療劑的組中，施用癌治療劑在40天后也觀察不到腫瘤發(fā)生。另一方面，pbs(-)施用陰性對照組和多聚ic單獨施用組(50μg)中，施用后40天后分別為平均1989mm³、平均1843mm³。

用大腸癌模型進行同樣的實驗。對balb/c小鼠(7周齡，雄，從日本slc社購入)的皮下移植1×10⁶個大腸癌細胞株ct26，在腫瘤達到平均50～100mm³的時刻(典型地為腫瘤接種后7天)，將小鼠以1組10只的方式隨機分組，進行重組小鼠pds5a蛋白質(zhì)的抗腫瘤效果的評價(治療模型)。在如上所述純化后的重組小鼠pds5a蛋白質(zhì)100μg(0.5ml)中混合50μg的多聚ic來調(diào)制癌治療劑，將其對荷瘤小鼠每一周向皮下施用共計3次。其結(jié)果是，從癌治療劑施用起24天后，腫瘤完全萎縮。另一方面，pbs(-)施用陰性對照組和多聚ic單獨施用組(50μg)中，施用后24天后，腫瘤分別為平均1449mm³、平均835mm³。

此外，調(diào)制混合有重組小鼠pds5a蛋白質(zhì)100μg(0.5ml)和50μg的多聚ic的癌治療劑，將其對balb/c小鼠每一周向皮下施用共計3次后，移植1×10⁶個ct26細胞來評價抗腫瘤效果(預防模型)。另外，1組為10只，作為比較對照，分成pbs(-)施用陰性對照組和多聚ic單獨施用組(50μg)。其結(jié)果是，施用了癌治療劑的組中，施用癌治療劑31天后也觀察不到腫瘤發(fā)生。另一方面，pbs(-)施用陰性對照組和多聚ic單獨施用組(50μg)中，施用后31天后分別為平均1781mm³、平均1675mm³。

由以上的結(jié)果明確了重組pds5a蛋白質(zhì)對癌的治療和預防是有效的。

(4)重組pds5a蛋白質(zhì)對荷瘤患狗的抗腫瘤效果

對表皮具有腫瘤的荷瘤患狗3只(乳腺腫瘤3只)，進行后述的實施例5中記載的重組蛋白質(zhì)的抗腫瘤效果的評價。進行施用前，首先，通過后述的實施例5(3)中記載的方法，測定針對各患狗的血清中的重組蛋白質(zhì)的抗體效價，結(jié)果是檢測到了高于健常狗的抗體效價。因此暗示出，這些荷瘤患狗的生物體中的腫瘤組織中，具有序列號2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)作為癌抗原表達。

在如上所述純化后的重組pds5a蛋白質(zhì)(來源于狗和來源于人)各500μg(2.5ml)中混合等量的不完全弗氏佐劑(和光純藥社制)來調(diào)制2種癌治療劑，將其每一周向腫瘤附近的所屬淋巴結(jié)施用共計3次。其結(jié)果是，在癌治療劑施用時大小分別為約500mm³和1000mm³的腫瘤，在從癌治療劑施用起分別13天后和21天后完全萎縮。另一方面，pbs(-)施用陰性對照組中，在pbs施用時刻為約800mm³的腫瘤在施用后21天后變?yōu)?625mm³。

此外，對肛門周圍發(fā)生的腺癌和表皮處發(fā)生的扁平上皮癌的患狗各1只，在如后述的實施例5那樣在純化后的重組狗pds5a蛋白質(zhì)500μg(2.5ml)中混合等量的不完全弗氏佐劑(和光純藥社制)而作為癌治療劑，將其每一周向腫瘤附近的皮下施用共計4次。其結(jié)果是，在癌治療劑施用時刻癌的大小分別為約370mm³和280mm³的腫瘤，在從癌治療劑施用起分別35天后和42天后完全萎縮。

(5)使用了重組pds5a蛋白質(zhì)的癌的檢測

采集被確認了惡性腫瘤的患狗112只和健常狗30只的血液，分離出血清。使用由上述(2)制作的狗pds5a蛋白質(zhì)(序列號2)采用elisa法測定與該蛋白質(zhì)特異性反應的血清中的抗體效價。制作的蛋白質(zhì)的固相化如下進行：將用磷酸緩沖化生理鹽水稀釋成5μg/ml的重組蛋白質(zhì)溶液以100μl/孔添加至96孔イモビライザー氨基酶標板(ヌンク社制)，在4℃進行靜置一晚。封閉如下進行：以100μl/孔加入含有3％bsa(bovineserumalbumin(牛血清白蛋白)，シグマアルドリッチジャパン社制)的50mm碳酸氫鈉緩沖溶液(ph值8.4)(以下稱為封閉溶液)，在室溫振蕩1小時。以100μl/孔添加使用封閉溶液進行了稀釋的1000倍稀釋血清，在室溫振蕩3小時使其反應。用含有0.05％tween20(和光純藥工業(yè)社制)的磷酸緩沖化生理鹽水(以下稱為pbs-t)洗滌3次，以100μl/孔加入采用封閉溶液稀釋至3000倍的hrp修飾抗狗igg抗體(goatantidogigg-h+ihrpconjugated：bethyllaboratories社制)，在室溫振蕩1小時使其反應。用pbs-t洗滌3次，以100μl/孔添加hrp底物tmb(1-stepturbotmb(四甲基聯(lián)苯胺)，pierce社)，在室溫使酶底物反應30分鐘。然后，以100μl/孔加入0.5m硫酸溶液(シグマアルドリッチジャパン社制)來停止反應后，采用酶標儀測定450nm的吸光度。作為對照，將未對制作的重組蛋白質(zhì)固相化的物質(zhì)、未使荷瘤狗血清反應的物質(zhì)與上述同樣地進行并比較。

對于用于上述癌診斷的共112個樣本，使用摘出的腫瘤組織的病理診斷的結(jié)果全部確診為惡性。

具體為受到了下述癌診斷的樣本，所述癌是惡性黑素瘤、惡性混合腫瘤、肝細胞癌、基底細胞癌、口腔內(nèi)腫瘤、肛周腺癌、肛門囊腫瘤、肛門囊頂質(zhì)分泌腺癌、睪丸支持細胞瘤、陰道前庭癌、皮脂腺癌、皮脂腺上皮瘤、皮脂腺腺瘤、汗腺癌、鼻腔內(nèi)腺癌、鼻腺癌、甲狀腺癌、大腸癌、支氣管腺癌、腺癌、腺管癌、乳腺癌、復合型乳腺癌、乳腺惡性混合腫瘤、乳管內(nèi)乳頭狀腺癌、纖維肉瘤、血管周皮瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、軟組織肉瘤、組織細胞肉瘤、粘液肉瘤、未分化肉瘤、肺癌、肥大細胞瘤、皮膚平滑肌瘤、腹腔內(nèi)平滑肌瘤、平滑肌瘤、扁平上皮癌、慢性型淋巴細胞性白血病、淋巴瘤、消化道型淋巴瘤、消化器型淋巴瘤、小～中細胞型淋巴瘤、腎上腺髓質(zhì)腫瘤、顆粒細胞瘤、嗜鉻細胞瘤等。

來源于這些荷瘤狗生物體的血清與來源于健常狗的血清相比顯示對重組蛋白質(zhì)的高抗體效價。已知由本診斷法得到的惡性判斷為健常狗平均值的2倍以上的情況為94個樣本，可以以83.9％診斷惡性癌。該94個樣本的癌的種類如下。另外，根據(jù)樣本不同也有罹患多種癌的樣本，以下所示的數(shù)值是每種癌的累計值。

惡性黑素瘤5例，淋巴瘤10例，顆粒細胞瘤1例，肝細胞癌3例，惡性精巢腫瘤3例，口腔內(nèi)腫瘤3例，肛周腺癌5例，肉瘤9例，乳腺癌35例，肺癌1例，腺管癌4例，皮脂腺癌2例，肥大細胞瘤5例，平滑肌肉瘤1例，扁平上皮癌4例，惡性混合腫瘤2例，血管周皮瘤1例。

此外，使用由上述(2)制作的人pds5a蛋白質(zhì)(序列號44)與上述同樣地操作進行癌診斷，結(jié)果得到了同樣的結(jié)果。

由此表明了，通過使用pds5a蛋白質(zhì)測定與該蛋白質(zhì)特異性反應的血清中的抗體效價，可以進行癌的檢測和診斷。

產(chǎn)業(yè)可利用性

本發(fā)明的包含對各種癌發(fā)揮抗腫瘤活性的多肽的免疫誘導劑對癌的治療和/或預防或癌的檢測是有用的。

序列表

<110>東麗株式會社

<120>免疫誘導劑

<130>10057

<160>44

<170>patentin版本3.1

<210>1

<211>4396

<212>dna

<213>狗（canisfamiliaris）

<220>

<221>cds

<222>(116)..(4129)

<223>

<400>1

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<212>prt

<213>小鼠（musmusculus）

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535540545

acatcagaagcaaacagtgctgccatgtttgggaagctgatgaccata1916

thrserglualaasnseralaalametpheglylysleumetthrile

550555560

gcaaaaaaccttccagatcctggaaaagcacaagattttgtgaagaaa1964

alalysasnleuproaspproglylysalaglnaspphevallyslys

565570575

ttcaatcaggttctaggcgatgatgaaaagcttcggtcccagcttgaa2012

pheasnglnvalleuglyaspaspglulysleuargserglnleuglu

580585590

ctgttaattagccctacgtgttcttgtaaacaggcagatgtctgtgtg2060

leuleuileserprothrcyssercyslysglnalaaspvalcysval

595600605610

agagagatagcccggaaacttgcaaatcctaagcagccaacaaatcct2108

arggluilealaarglysleualaasnprolysglnprothrasnpro

615620625

tttctggaaatggtcaaatttcttttggaaagaattgctcctgtacat2156

pheleuglumetvallyspheleuleugluargilealaprovalhis

630635640

attgactcagaagccattagtgcactagtaaaattgatgaataaatca2204

ileaspserglualaileseralaleuvallysleumetasnlysser

645650655

atagaggggacagctgatgatgaagaggagggtgtaagtcctgatact2252

ilegluglythralaaspaspgluglugluglyvalserproaspthr

660665670

gcaattcgtgcaggacttgaacttctcaaggttctgtcctttacacat2300

alaileargalaglyleugluleuleulysvalleuserphethrhis

675680685690

cctacctcgtttcactctgcggagacctatgagtctctgctgcagtgc2348

prothrserphehisseralagluthrtyrgluserleuleuglncys

695700705

ctcaggatggaagatgataaggtagctgaggcagccatacagattttc2396

leuargmetgluaspasplysvalalaglualaalaileglnilephe

710715720

agaaacacgggtcacaaaatagaaacagacctgccacagataagatca2444

argasnthrglyhislysilegluthraspleuproglnileargser

725730735

acattaattccaattttgcatcagaaagcaaaaagaggcactccccat2492

thrleuileproileleuhisglnlysalalysargglythrprohis

740745750

caggcaaaacaagccgttcactgtatacatgccatattttcaaataaa2540

glnalalysglnalavalhiscysilehisalailepheserasnlys

755760765770

gaagtgcaacttgctcagatctttgagcctcttagtagaagtttgaat2588

gluvalglnleualaglnilephegluproleuserargserleuasn

775780785

gctgatgtaccagaacaactgataactccattagtctcactgggtcac2636

alaaspvalprogluglnleuilethrproleuvalserleuglyhis

790795800

atttctatgttggctccagaccagtttgcttctccaatgaaatctgtt2684

ilesermetleualaproaspglnphealaserprometlysserval

805810815

gttgcaaatttcgttgtaaaagatcttctaatgaatgacaggtcaaca2732

valalaasnphevalvallysaspleuleumetasnaspargserthr

820825830

ggtgagaaaaatggaaagttgtggtctccagatgaagaggtgtctcca2780

glyglulysasnglylysleutrpserproaspglugluvalserpro

835840845850

gaagtactagcaaaggtgcaagcaattaaacttttggtacgctggctg2828

gluvalleualalysvalglnalailelysleuleuvalargtrpleu

855860865

ctgggtatgaaaaacaaccagtcaaaatctgcaaattccacactccga2876

leuglymetlysasnasnglnserlysseralaasnserthrleuarg

870875880

ttgttatcagctatgcttgtcagtgaaggagacttgacagaacagaag2924

leuleuseralametleuvalsergluglyaspleuthrgluglnlys

885890895

cgaatcagtaaatccgatatgtctcgactacgattagctgctggcagt2972

argileserlysseraspmetserargleuargleualaalaglyser

900905910

gcaataatgaagcttgcacaggaaccatgttaccatgaaataattacc3020

alailemetlysleualaglngluprocystyrhisgluileilethr

915920925930

ccagaacagttccaactctgtgcgctcgtcattaatgatgagtgctac3068

progluglnpheglnleucysalaleuvalileasnaspglucystyr

935940945

caagtgaggcagatatttgcccagaaactgcataaagcacttgtgaaa3116

glnvalargglnilephealaglnlysleuhislysalaleuvallys

950955960

ttactgctccctttggaatatatggcaatctttgctttgtgtgccaaa3164

leuleuleuproleuglutyrmetalailephealaleucysalalys

965970975

gatcctgtgaaagagagaagagcacatgccagacagtgcttgcttaaa3212

aspprovallysgluargargalahisalaargglncysleuleulys

980985990

aacatcagtatacgaagagagtatattaagcagaatcctatggct3257

asnileserileargargglutyrilelysglnasnprometala

99510001005

aacgaaaaattgctgtccttgctgcctgaatatgtggtaccatat3302

asnglulysleuleuserleuleuproglutyrvalvalprotyr

101010151020

atgattcatttactggcacatgatccagatttcacaaaacctcag3347

metilehisleuleualahisaspproaspphethrlysprogln

102510301035

gatgttgatcagcttcgtgatgtcaaagagtgcctgtggttcatg3392

aspvalaspglnleuargaspvallysglucysleutrpphemet

104010451050

cttgaagttttaatgacaaagaatgagaacaatagccatgccttc3437

leugluvalleumetthrlysasngluasnasnserhisalaphe

105510601065

atgaaaaagatggcagaaaacatcaagcttacacgagatgcccag3482

metlyslysmetalagluasnilelysleuthrargaspalagln

107010751080

tctcctgatgagccaaaggccaatgagaaactttatacagtatgt3527

serproaspgluprolysalaasnglulysleutyrthrvalcys

108510901095

gatgtagcactgtgtgtaatcaacagcaaaagtgctttatgcaat3572

aspvalalaleucysvalileasnserlysseralaleucysasn

110011051110

gcagattcaccaaaggaccctgtattgccaaccaaattttttaca3617

alaaspserprolysaspprovalleuprothrlysphephethr

111511201125

caacctgaaaaggatttttccaatgaccggaattacatttcagaa3662

glnproglulysasppheserasnaspargasntyrileserglu

113011351140

gagacaagagttcttcttttgacaggaaagccaaaaccaactggt3707

gluthrargvalleuleuleuthrglylysprolysprothrgly

114511501155

gtgttagatacagtaaacaagccattgtctgcaactggaaggaga3752

valleuaspthrvalasnlysproleuseralathrglyargarg

116011651170

ccgtatattagaactacaggatcagagactggaagcaatatcagt3797

protyrileargthrthrglysergluthrglyserasnileser

117511801185

gtaaactctgagctgagctcttctgcaggaaacagatcaagggaa3842

valasnsergluleuserserseralaglyasnargserargglu

119011951200

caaagttcagatatatcagaaactggtgtcagtgaaaacgatgaa3887

glnserseraspilesergluthrglyvalsergluasnaspglu

120512101215

aaccctgtgcgaattatttcagtcacaccagcaaagacagaacct3932

asnprovalargileileservalthrproalalysthrglupro

122012251230

gtgaaaaataaggaaattaattctgaccaggctacgcaaggaaac3977

vallysasnlysgluileasnseraspglnalathrglnglyasn

123512401245

agtactgaacgtgggaaaaaaagaacagcaacagcatctggaact4022

serthrgluargglylyslysargthralathralaserglythr

125012551260

gagaatattcatcagaaagcagaagaaaacaatgcagatgaaaca4067

gluasnilehisglnlysalaglugluasnasnalaaspgluthr

126512701275

ggaccatcgcttgcagcaaaaaccaggagagggcgtccacccaaa4112

glyproserleualaalalysthrargargglyargproprolys

128012851290

cctgaacctcagggtaccactgcaaaaaatgaggaaacaaataag4157

progluproglnglythrthralalysasnglugluthrasnlys

129513001305

ccacctgtcaggggaagaaaaagggcagcagccagtcaagaaagt4202

proprovalargglyarglysargalaalaalaserglngluser

131013151320

ccagggagtttagaggcaggtaacgccaaagcaccaaaacagcaa4247

proglyserleuglualaglyasnalalysalaprolysglngln

132513301335

gacacagcaaaaaagccagcagcagcacagagacagatcgatcta4292

aspthralalyslysproalaalaalaglnargglnileaspleu

134013451350

caaaggtaaaaagaaaactcactcgaaaagggaggaaatgaaggccaaa4341

glnarg

1355

taaaggcatgctccaagcttctgcaaaaactaggattcagaaatttcctgtacaggaact4401

gaaattgcttcaaaacacacagctttcagctctgaaaacagaaggaaaactatgcttccc4461

tttcacgtgaaattaatccttctcaatggaaatgtaaagcagaaactcttgagaaagagg4521

ctaaaagcatctgtacttatttccccagagactttttttatgaaaagtcaataattaagc4581

aaattgcttaacacttggttccagttcctgcattctggagtttaaaagtgtatttacacc4641

attaattttcatgctgcattttctttttttttttaaaggaagtcagagggaggtccttac4701

actgacactgaaaattcgcgatcctagagccaggtattcccatgttccacagaaaaagta4761

gaagtctactgaatggattttaaataagactagaaaaaaaaaaaaaaa4809

<210>12

<211>1356

<212>prt

<213>雞（gallusgallus）

<400>12

metleuhisleuprogluleuarggluargprovalgluaspcysala

151015

gluglylyspheleuserserglythrargmetasppheproalaala

202530

glnprolysproalaalaaspglylysileiletyrtyrproprogly

354045

vallysgluthrthrasplysilethrasnaspgluvalvallysarg

505560

leulysmetvalvallysthrphemetaspmetaspglnaspserglu

65707580

aspglulysglnglntyrleuproleualaleuhisleualaserglu

859095

phepheleuargasnproasnlysaspvalargleuleuvalalacys

100105110

cysleualaaspilepheargiletyralaproglualaprotyrthr

115120125

serhisasplysleulysaspilepheleupheilethrargglnleu

130135140

lysglyleugluaspthrlysserproglnpheasnargtyrphetyr

145150155160

leuleugluasnleualatrpvallyssertyrasnilecyspheglu

165170175

leugluaspcysasngluilepheileglnleupheargthrleuphe

180185190

servalileasnasnserhisasnglnlysvalglnmethismetleu

195200205

aspleumetserserileilemetgluglyaspglyvalthrglnglu

210215220

leuleuaspserileleuileasnleuileproalahislysasnleu

225230235240

asnlysglnalapheaspleualalysvalleuleulysargthrval

245250255

glnthrilegluprocysilealaasnphepheasnglnvalleuval

260265270

leuglylysserservalseraspleusergluhisvalpheaspleu

275280285

ileleugluleuphealaileaspprohisleuleuleuservalmet

290295300

proglnleugluphelysleulysserasnaspglyglugluargleu

305310315320

alavalvalargleuleualalysleupheglyserlysaspserasp

325330335

leualathrglnasnargproleutrpglncyspheleuglyargphe

340345350

asnaspilehisvalprovalargleugluservallysphealaser

355360365

hiscysleumetasnhisproaspleualalysaspleuthrglutyr

370375380

leulysvalargserhisaspprogluglualailearghisaspval

385390395400

ilevalthrileilethralaglylysargaspleuserleuvalasn

405410415

aspglnleuleuglyphevalarggluargthrleuasplysargtrp

420425430

argvalarglysglualametmetglyleualaglnleutyrlyslys

435440445

tyrcysleuhisalaglualaglylysaspalaalaglulysvalser

450455460

trpilelysasplysleuleuhisiletyrtyrglnasnserileasp

465470475480

asplysleuleuvalglulysilephealaglntyrleuvalprohis

485490495

asnleugluthrglugluargmetlyscysleutyrtyrleutyrala

500505510

serleuaspproasnalavallysalaleuasnglumettrplyscys

515520525

glnasnmetleuargserhisvalarggluleuleuaspleuhislys

530535540

glnprothrserglualaasnseralaalametpheglylysleumet

545550555560

thrilealalysasnleuproaspproglylysalaglnasppheval

565570575

lyslyspheasnglnvalleuglyaspaspglulysleuargsergln

580585590

leugluleuleuileserprothrcyssercyslysglnalaaspval

595600605

cysvalarggluilealaarglysleualaasnprolysglnprothr

610615620

asnpropheleuglumetvallyspheleuleugluargilealapro

625630635640

valhisileaspserglualaileseralaleuvallysleumetasn

645650655

lysserilegluglythralaaspaspgluglugluglyvalserpro

660665670

aspthralaileargalaglyleugluleuleulysvalleuserphe

675680685

thrhisprothrserphehisseralagluthrtyrgluserleuleu

690695700

glncysleuargmetgluaspasplysvalalaglualaalailegln

705710715720

ilepheargasnthrglyhislysilegluthraspleuproglnile

725730735

argserthrleuileproileleuhisglnlysalalysargglythr

740745750

prohisglnalalysglnalavalhiscysilehisalailepheser

755760765

asnlysgluvalglnleualaglnilephegluproleuserargser

770775780

leuasnalaaspvalprogluglnleuilethrproleuvalserleu

785790795800

glyhisilesermetleualaproaspglnphealaserprometlys

805810815

servalvalalaasnphevalvallysaspleuleumetasnasparg

820825830

serthrglyglulysasnglylysleutrpserproaspglugluval

835840845

serprogluvalleualalysvalglnalailelysleuleuvalarg

850855860

trpleuleuglymetlysasnasnglnserlysseralaasnserthr

865870875880

leuargleuleuseralametleuvalsergluglyaspleuthrglu

885890895

glnlysargileserlysseraspmetserargleuargleualaala

900905910

glyseralailemetlysleualaglngluprocystyrhisgluile

915920925

ilethrprogluglnpheglnleucysalaleuvalileasnaspglu

930935940

cystyrglnvalargglnilephealaglnlysleuhislysalaleu

945950955960

vallysleuleuleuproleuglutyrmetalailephealaleucys

965970975

alalysaspprovallysgluargargalahisalaargglncysleu

980985990

leulysasnileserileargargglutyrilelysglnasnpromet

99510001005

alaasnglulysleuleuserleuleuproglutyrvalvalpro

101010151020

tyrmetilehisleuleualahisaspproaspphethrlyspro

102510301035

glnaspvalaspglnleuargaspvallysglucysleutrpphe

104010451050

metleugluvalleumetthrlysasngluasnasnserhisala

105510601065

phemetlyslysmetalagluasnilelysleuthrargaspala

107010751080

glnserproaspgluprolysalaasnglulysleutyrthrval

108510901095

cysaspvalalaleucysvalileasnserlysseralaleucys

110011051110

asnalaaspserprolysaspprovalleuprothrlysphephe

111511201125

thrglnproglulysasppheserasnaspargasntyrileser

113011351140

glugluthrargvalleuleuleuthrglylysprolysprothr

114511501155

glyvalleuaspthrvalasnlysproleuseralathrglyarg

116011651170

argprotyrileargthrthrglysergluthrglyserasnile

117511801185

servalasnsergluleuserserseralaglyasnargserarg

119011951200

gluglnserseraspilesergluthrglyvalsergluasnasp

120512101215

gluasnprovalargileileservalthrproalalysthrglu

122012251230

provallysasnlysgluileasnseraspglnalathrglngly

123512401245

asnserthrgluargglylyslysargthralathralasergly

125012551260

thrgluasnilehisglnlysalaglugluasnasnalaaspglu

126512701275

thrglyproserleualaalalysthrargargglyargpropro

128012851290

lysprogluproglnglythrthralalysasnglugluthrasn

129513001305

lysproprovalargglyarglysargalaalaalaserglnglu

131013151320

serproglyserleuglualaglyasnalalysalaprolysgln

132513301335

glnaspthralalyslysproalaalaalaglnargglnileasp

134013451350

leuglnarg

1355

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t3引物

<400>13

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<210>14

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>t7引物

<400>14

taatacgactcactatagg19

<210>15

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>15

aatagcatcgatgacaaactgttgg25

<210>16

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>16

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<210>17

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>17

gtaaggtggctgttgggtatg21

<210>18

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>18

ggctagcaggtgaatcatgtatgg24

<210>19

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>19

acttctggtaaggtggctgttgg23

<210>20

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>20

gggctaggaggtgaatcatgtatgg25

<210>21

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gapdh引物

<400>21

gggctgcttttaactctg18

<210>22

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gapdh引物

<400>22

ccaggaaatgagcttgac18

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gapdh引物

<400>23

cttcaccaccatggagaagg20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gapdh引物

<400>24

tgaagtcgcaggagacaacc20

<210>25

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>25

atggacttcacgcagccgaagcctgccactgcc33

<210>26

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>26

ttacctttgtaaatcaatttgtctctctgctggaactgcc40

<210>27

<211>9

<212>prt

<213>人（homosapiens）

<400>27

asnleuileproalahislysasnleu

15

<210>28

<211>10

<212>prt

<213>人（homosapiens）

<400>28

lysglucysleutrpphemetleugluval

1510

<210>29

<211>10

<212>prt

<213>人（homosapiens）

<400>29

pheleuglyargpheasnaspilehisval

1510

<210>30

<211>10

<212>prt

<213>人（homosapiens）

<400>30

leuleuleuproleuglutyrmetalaile

1510

<210>31

<211>10

<212>prt

<213>人（homosapiens）

<400>31

serleuaspproasnalavallysalaleu

1510

<210>32

<211>9

<212>prt

<213>人（homosapiens）

<400>32

lysleulysaspilepheleupheile

15

<210>33

<211>10

<212>prt

<213>人（homosapiens）

<400>33

leuleuserleuleuproglutyrvalval

1510

<210>34

<211>9

<212>prt

<213>人（homosapiens）

<400>34

lysmetalagluasnilelysleuthr

15

<210>35

<211>10

<212>prt

<213>人（homosapiens）

<400>35

glnvalleuvalleuglyargserserval

1510

<210>36

<211>9

<212>prt

<213>人（homosapiens）

<400>36

leuglncyscysseralatyrlysleu

15

<210>37

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>37

gcggccgcatggacttcaccgcgcagcccaagcc34

<210>38

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

<400>38

ctcgagttacctttgtaagtcaatctgtctctctgctggtactgc45

<210>39

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

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<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物

<400>41

gcggccgcatggacttcacgcagccgaagcc31

<210>42

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物

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<213>人（homosapiens）

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<221>cds

<222>(541)..(4554)

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ileleuileasnleuileproalahislysasnleuasnlysglnser

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metgluaspasplysvalalaglualaalaileglnilepheargasn

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valprogluglnleuilethrproleuvalserleuglyhisileser

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metleualaproaspglnphealaserprometlysservalvalala

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leualalysvalglnalailelysleuleuvalargtrpleuleugly

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metlysasnasnglnserlysseralaasnserthrleuargleuleu

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<212>prt

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