本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01180035419.5的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)是2011年6月20日提交的pct國(guó)際申請(qǐng)pct/us2011/041053于2013年1月18日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2010年6月19日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/356,601的優(yōu)先權(quán)，其全部公開內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。本發(fā)明涉及脂質(zhì)體介導(dǎo)的藥劑遞送。
背景技術(shù)：
：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus，mrsa)是造成超過(guò)一半的醫(yī)院獲得性肺炎病例的細(xì)菌(1-3)。它也被稱為多藥耐藥和耐苯唑西林金黃色葡萄球菌(oxacillin-resistants.aureus，orsa)。更特別地，mrsa對(duì)一大類稱為β-內(nèi)酰胺的抗生素(包括青霉素類，頭孢菌素類和碳青霉烯類)有抗性。許多菌株還對(duì)氟喹諾酮有抗性。萬(wàn)古霉素仍是美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局(fda)批準(zhǔn)用于治療mrsa肺炎的僅有的兩種抗微生物劑之一，但其臨床失敗率超過(guò)30％(4)。療效不佳的原因包括緩慢、時(shí)間依賴性的殺菌活性；劑量不足；對(duì)肺組織和肺泡巨噬細(xì)胞的滲透弱(5-11)；以及敏感性降低(4，12，13)。金黃色葡萄球菌是細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外病原體(14，15)，其可以經(jīng)受住吞噬細(xì)胞而存活并且可以逃避免疫系統(tǒng)(16，17)。相比于標(biāo)準(zhǔn)制劑，脂質(zhì)體包封的抗微生物劑可提供更強(qiáng)的藥代動(dòng)力學(xué)，藥效學(xué)，以及更低的毒性(18，19)。感染組織中更高濃度抗微生物劑的積累可使活化的組織巨噬細(xì)胞對(duì)其的攝取增加(20，21)，從而可能提高治療效果?；诖擞^點(diǎn)，已證明將聚乙二醇(peg)分子與脂質(zhì)體表面連接有效地將化學(xué)治療藥物吉西他濱遞送至胰腺癌腫瘤細(xì)胞(coscod等，cancerchemotherapyandpharmacology，64：(5)1009-1020(2009))。然而對(duì)于在治療或預(yù)防細(xì)菌感染的制劑中使用被peg化脂質(zhì)體包封的抗微生物劑還未有描述。的確，萬(wàn)古霉素這樣的強(qiáng)效抗生素通常是對(duì)抗耐受常用抗生素之細(xì)菌(如mrsa)的最后手段。但是，萬(wàn)古霉素的療效由于對(duì)肺組織的滲透不佳而減弱。該問題在治療mrsa肺感染時(shí)經(jīng)常遇到。因此，本發(fā)明采用表面peg化的脂質(zhì)體包封，其相比于標(biāo)準(zhǔn)的萬(wàn)古霉素制劑，通過(guò)將更高濃度的萬(wàn)古霉素沉積至肺組織來(lái)更有效地實(shí)現(xiàn)針對(duì)性藥物遞送(“drug-to-bug”)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及治療個(gè)體的細(xì)菌感染(例如個(gè)體的多種組織或器官的細(xì)菌感染)的新方法。一般而言，所述治療方法涉及對(duì)個(gè)體施用藥物制劑，其包含脂質(zhì)體包封的抗微生物劑，其中聚乙二醇(peg)分子共價(jià)連接到脂質(zhì)體的表面。因此，本發(fā)明涉及包封殺菌或抑菌的藥物或藥物組合的peg化脂質(zhì)體。一般地，本發(fā)明的治療方法針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌。因此，本發(fā)明的peg化脂質(zhì)體可以例如包含殺菌或抑菌的抗微生物劑，它們針對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)、mrsa亞株以及一般地耐受β-內(nèi)酰胺抗生素(例如青霉素類(雙氯青霉素，乙氧萘青霉素，苯唑西林等)和頭孢菌素類)的其他細(xì)菌。糖肽類抗生素尤其以在治療上有效對(duì)抗mrsa而在本領(lǐng)域公知。因此，本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案涉及peg化脂質(zhì)體包封的糖肽抗生素、糖肽抗生素的組合，或其衍生物。常被臨床醫(yī)生用于治療mrsa感染的糖肽抗生素是萬(wàn)古霉素。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及peg化脂質(zhì)體包封的萬(wàn)古霉素或萬(wàn)古霉素衍生物。本發(fā)明的另一個(gè)一般目的是提供可以逃避吞噬細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)的攝取的藥物制劑。因此，本發(fā)明還涉及通過(guò)將抗微生物劑包封在peg化脂質(zhì)體中來(lái)將抗生素遞送至感染組織或器官的新方法，其因至少部分地逃避細(xì)胞清除機(jī)制的能力而具有偷襲(stealth)特性。表的簡(jiǎn)述表1包含靜脈內(nèi)施用5-mg/kg劑量的標(biāo)準(zhǔn)、常規(guī)和peg化脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素制劑后，血漿中萬(wàn)古霉素的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。表2包含靜脈內(nèi)施用5mg/kg劑量的標(biāo)準(zhǔn)、常規(guī)和peg化脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素制劑后，萬(wàn)古霉素在肝、腎、肺和脾的生物分布數(shù)據(jù)。附圖說(shuō)明圖1.對(duì)小鼠靜脈內(nèi)施用5-mg/kg劑量的標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素溶液(sv)，常規(guī)脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素(clv)和peg化脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素(plv)后，萬(wàn)古霉素的藥代動(dòng)力學(xué)。所有值都顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。圖2.靜脈內(nèi)施用5mg/kg劑量的標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素溶液(sv)，常規(guī)脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素(clv)和peg化脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素(plv)后，總?cè)f古霉素在cf-1小鼠脾中的組織分布。＊＊p＜0.0015分鐘時(shí)常規(guī)脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。++p＜0.0015分鐘時(shí)peg化脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。＊p＜0.011小時(shí)時(shí)常規(guī)脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。+p＜0.011小時(shí)時(shí)peg化脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。圖3.靜脈內(nèi)施用5-mg/kg劑量的標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素溶液(sv)，常規(guī)脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素(clv)和peg化脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素(plv)后，萬(wàn)古霉素在雄性cf-1小鼠肝中的組織分布。＊＊p＜0.0015分鐘時(shí)常規(guī)脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。++p＜0.0015分鐘時(shí)peg化脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。＊p＜0.011小時(shí)時(shí)常規(guī)脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。+p＜0.011小時(shí)時(shí)peg化脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。圖4.靜脈內(nèi)施用5-mg/kg劑量的標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素溶液(sv)，常規(guī)脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素(clv)和peg化脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素(plv)后，萬(wàn)古霉素在cf-1小鼠肺部的組織分布。＊＊p＜0.0015分鐘時(shí)常規(guī)脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。++p＜0.0015分鐘時(shí)peg化脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。＊p＜0.011小時(shí)時(shí)常規(guī)脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。+p＜0.011小時(shí)時(shí)peg化脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。圖5.靜脈內(nèi)施用5-mg/kg劑量的標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素溶液(sv)，常規(guī)脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素(clv)和peg化脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素(plv)后，萬(wàn)古霉素在cf-1小鼠腎中的組織分布。＊＊p＜0.0015分鐘時(shí)常規(guī)脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。++p＜0.0015分鐘時(shí)peg化脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。＊p＜0.011小時(shí)時(shí)常規(guī)脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。+p＜0.011小時(shí)時(shí)peg化脂質(zhì)體相比于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素。具體實(shí)施方式如上所述，本發(fā)明涉及包含抗微生物劑的藥物制劑，其中抗微生物劑由脂質(zhì)體包封，并且其中至少一個(gè)聚乙二醇(peg)分子與脂質(zhì)體的脂質(zhì)分子共價(jià)連接。關(guān)于本發(fā)明中抗微生物劑成分，它可發(fā)揮殺菌或抑菌活性。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物制劑可包含多于一種抗微生物劑，例如，所述制劑可包含抑菌抗微生物劑和殺菌抗微生物劑的組合。一般而言，發(fā)揮針對(duì)細(xì)菌的殺菌活性是指抗微生物劑的組合物具有殺死或不可逆轉(zhuǎn)地破壞對(duì)組合物的抗生素敏感的一種或更多種細(xì)菌的能力。然而，具有抑菌活性的抗微生物劑具有抑制對(duì)組合物的抗生素敏感的一種或更多種靶細(xì)菌物種的生長(zhǎng)而不將其殺死的能力。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物制劑的抗微生物劑針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(包括但不限于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa))為殺菌或抑菌的。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明藥物制劑的抗微生物劑是糖肽抗生素。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，本發(fā)明上下文中使用的術(shù)語(yǔ)“糖肽抗生素”是一種抗生素，其作用機(jī)制包括抑制細(xì)菌細(xì)胞壁生長(zhǎng)。這類糖肽抗生素中的抗生素包括但不限于萬(wàn)古霉素(vancomycin)、阿伏帕星(avoparcin)、瑞斯托菌素(ristocetin)、替考拉寧(teicoplanin)及其衍生物。例如，萬(wàn)古霉素的衍生物包括但不限于多價(jià)萬(wàn)古霉素、peg化萬(wàn)古霉素綴合物、去甲萬(wàn)古霉素、萬(wàn)古霉素二硫化物、synmonicin、單或二去氯萬(wàn)古霉素、萬(wàn)古霉素的谷氨酰胺類似物(如a51568b和m43g)、萬(wàn)古霉素的天冬氨酸類似物(如m43f和m43b)、萬(wàn)古霉素的去萬(wàn)古胺衍生物(desvancosaminederivativesofvancomycin)(如a51568a和m43a，以及相應(yīng)配基)、萬(wàn)古霉素的氯衍生物(如a82846b、a82846a(伊瑞霉素)、orienticina，a82846c)、萬(wàn)古霉素的芐氨基糖衍生物(如a82846b)、n-?；f(wàn)古霉素、n-芳基?；f(wàn)古霉素(n-aracylvancomycins)、n-烷基萬(wàn)古霉素(包括但不限于辛基芐基、辛氧基芐基、丁基芐基、丁氧基芐基和丁基衍生物)，或其混合物。在本發(fā)明的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述藥物制劑包含萬(wàn)古霉素，或萬(wàn)古霉素的衍生物或萬(wàn)古霉素衍生物的組合。關(guān)于本發(fā)明藥物制劑的脂質(zhì)體成分，術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”是指可用來(lái)遞送化合物的任何脂質(zhì)成分，其中水性體積被兩性脂質(zhì)雙層包封，或者其中脂質(zhì)包被包含抗微生物劑或抗微生物劑的組合的內(nèi)部。脂質(zhì)體可以是單層的，由單個(gè)雙層構(gòu)成，或者它們可以是多層的，由兩個(gè)或更多個(gè)同心雙層構(gòu)成。磷脂雙層由兩層磷脂分子形成。磷脂是具有兩個(gè)主要區(qū)域的分子，所述兩個(gè)區(qū)域?yàn)楹袡C(jī)分子的磷酸酯的親水性頭部區(qū)域和一個(gè)或更多個(gè)疏水性脂肪酸尾部。尤其地，天然磷脂具有由膽堿、甘油和磷酸構(gòu)成的親水性區(qū)域和由脂肪酸構(gòu)成的兩個(gè)疏水性區(qū)域。當(dāng)磷脂處于水性環(huán)境時(shí)，親水性頭部聚集成線性構(gòu)型，而它們的疏水性尾部基本彼此平行地排列。由于疏水性尾部試圖避開水性環(huán)境，第二列分子與第一列尾對(duì)尾排列。為了最大程度地避免與水性環(huán)境接觸(即在雙層邊緣)，同時(shí)使表面積與體積之比最小從而達(dá)到最小能量構(gòu)型，兩列磷脂(稱為磷脂雙層或?qū)?lamella))聚集成球，從而包封一些水性基質(zhì)和溶解或懸浮于其中的任何物質(zhì)，如本發(fā)明藥物制劑中包含的抗微生物劑。例如，在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物制劑包含包封了萬(wàn)古霉素溶液的peg化脂質(zhì)體?？捎糜谥谱鱬eg化脂質(zhì)體的磷脂為(但不限于)1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(1，2-dimyristroyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(1，2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1，2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸單鈉鹽(1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatemonosodiumsalt)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[磷-外消旋-(1-甘油)]鈉鹽(1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-[phosphor-rac-(l-glycerol)]sodiumsalt)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-[磷酸-l-絲氨酸]鈉鹽(1，2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-l-serine]sodiumsalt)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-戊二酰鈉鹽(1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-glutarylsodiumsalt)和1，1’，2，2’-四肉豆蔻酰心磷脂銨鹽(1，1′，2，2′-tetramyristoylcardiolipinammoniumsalt)或其混合物。如上所述，所述藥物制劑中包封抗微生物劑的脂質(zhì)體具有附在其表面上的peg分子。一般而言，peg指聚乙二醇，具有兩個(gè)羥基末端的乙烯peg重復(fù)單元的線性水溶性聚合物。peg按照其分子量進(jìn)行分類，例如，peg2000的平均分子量為約2000道爾頓，peg5000的平均分子量為約5000道爾頓。peg可購(gòu)自sigmachemicalco.、genzymepharmaceuticals和其他公司，并且包括例如以下：甲基聚乙二醇-1，2-二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺綴合物(mpeg-2000-dspe)、單甲氧基聚乙二醇(mpeg-oh)、單甲氧基聚乙二醇琥珀酸鹽/酯(mpeg-s)、單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺琥珀酸酯(mpeg-s-nhs)、單甲氧基聚乙二醇胺(mpeg-nh2)、單甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯(mpeg-tres)和單甲氧基聚乙二醇咪唑基羰基(mpeg-im)或其混合物。在多個(gè)實(shí)施方案中，peg是平均分子量為約550至約10000道爾頓的聚乙二醇，并且任選地被烷基、烷氧基、?；蚍蓟〈Ｔ谝粋€(gè)實(shí)施方案中，peg末端的羥基位被甲基取代。在另一實(shí)施方案中，peg平均分子量為約750至約5000道爾頓，更優(yōu)選約1000至約5000道爾頓，更優(yōu)選約1500至約3000道爾頓，甚至更優(yōu)選約2000至約750道爾頓。peg可任選地被烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，末端羥基被甲氧基或甲基取代。本發(fā)明的peg化脂質(zhì)體還可包含膽固醇、膽固醇衍生物，或者衍生物或膽固醇的組合。一般而言，peg化脂質(zhì)體的膽固醇組分為脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)提供增加的穩(wěn)定性(22)。在本發(fā)明的上下文中，磷脂與膽固醇或膽固醇衍生物與peg的摩爾比可以為0.1∶0.1∶0至30∶10∶2。例如，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，peg化脂質(zhì)體包含各自為3∶1∶0.02的dspc、膽固醇和mpeg-2000-dspe。如上所述，脂質(zhì)體可以是單層的，由單個(gè)雙層構(gòu)成；多層的，由兩個(gè)或更多個(gè)同心雙層構(gòu)成。脂質(zhì)體直徑對(duì)于小的單層囊泡(suv)來(lái)說(shuō)為約20nm-100nm，對(duì)于大的多層囊泡來(lái)說(shuō)為約100nm-5000nm，對(duì)于巨大的多層囊泡(gmv)來(lái)說(shuō)最終多至約100微米。伴隨攪拌水化干的脂質(zhì)膜/餅時(shí)自發(fā)形成lmv，干的脂質(zhì)膜/餅一般這樣形成：將脂質(zhì)溶解在有機(jī)溶劑中，用溶液涂布容器壁，并且蒸發(fā)溶劑。然后施加能量將lmv轉(zhuǎn)化成suv和luv等。能量的形式可以是但不限于超聲、高壓、升高的溫度和擠壓，以獲得更小的單層或多層囊泡。在該過(guò)程中，一些水性基質(zhì)被包封在囊泡中。脂質(zhì)體可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的任何方法制備?？捎糜谥苽浔景l(fā)明脂質(zhì)體的脂質(zhì)體制備常用方法的實(shí)例包括但不限于脫水-再水化，硫酸銨梯度和薄膜水化法。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，改進(jìn)了用于制備脂質(zhì)體的脫水-再水化方法。如上所述，本發(fā)明的藥物制劑可用于治療細(xì)菌感染。類似地，本發(fā)明的藥物制劑可用于預(yù)防性治療細(xì)菌感染。因此，本發(fā)明的范圍內(nèi)包括藥物組合物，其包含至少一種peg化脂質(zhì)體包封的抗微生物劑，配制其用于人或獸藥。因此，該組合物可與生理上可接受的載體或賦形劑一起使用，任選地與補(bǔ)充藥劑一起使用。常規(guī)載體也可與本發(fā)明的制劑一起使用。治療細(xì)菌感染的上下文中的術(shù)語(yǔ)“治療”是指對(duì)含有至少一種不是哺乳動(dòng)物正常菌群和動(dòng)物群之一部分的細(xì)菌的任何哺乳動(dòng)物組織進(jìn)行的任何治療，或者在哺乳動(dòng)物中治療具有細(xì)菌感染的哺乳動(dòng)物組織。本發(fā)明的peg化脂質(zhì)體包封的抗微生物劑可經(jīng)腸胃外或經(jīng)口施用給患者。腸胃外施用包括靜脈內(nèi)施用、肌內(nèi)施用、皮下施用、直腸施用或透皮施用。而且，本發(fā)明的peg化脂質(zhì)體包封的抗微生物劑可以根據(jù)施用途徑制成合適的劑型。這種劑型的實(shí)例包括，例如，主要例如用于靜脈內(nèi)施用和肌內(nèi)施用的注射劑；用于替代腸胃外施用的外用制劑，例如，滴眼劑，滴耳劑，滴鼻劑，眼用軟膏，皮膚粘膜吸收劑，皮膚科制劑，吸入劑或栓劑；以及口服施用制劑，例如，膠囊劑，片劑，丸劑，細(xì)粒劑，顆粒劑，粉末劑，糖漿劑，或錠劑。本文所用短語(yǔ)“治療有效量”是指對(duì)需要該治療的顯著量的對(duì)象施用藥物后提供特定藥理學(xué)應(yīng)答的藥物劑量?；衔锘蛩幬锏膶?shí)際有效量可以根據(jù)使用的具體組成、施用模式以及患者的年齡、體重和狀況而異。例如，本文所用的藥物有效量是刺激抗菌肽產(chǎn)生的量。特定個(gè)體患者的劑量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)考慮而確定(如，通過(guò)合適的常規(guī)藥理方案)。實(shí)施例實(shí)施例1：脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素制劑的制備通過(guò)三種方法之一制備脂質(zhì)體：1)薄膜水化法(23)；2)硫酸銨梯度法(24)；3)改進(jìn)的脫水-再水化法(25)。為了通過(guò)薄膜法制備脂質(zhì)體，將287mg1，2-二硬脂?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(dspc)(genzymepharmaceutical，cambridge，ma)和52mg膽固醇(sigmachemicals，st.louis，mo)溶解于7mlhplc級(jí)氯仿(emdchemicals，gibbstwon，nj)中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(buchirotavaporr-200，switzerland)中蒸發(fā)至膜。該膜在真空干燥器中在室溫下放置過(guò)夜，從而形成脂質(zhì)膜的薄層。通過(guò)將溶解于10ml磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)ph7.4(sigmachemicals，st.louis，mo)的萬(wàn)古霉素溶液(100mg萬(wàn)古霉素鹽酸鹽(sigmachemicals，st.louis，mo)加入裝有脂質(zhì)薄膜的燒瓶中，使薄脂質(zhì)膜水化，混合物通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器混合15分鐘生成脂質(zhì)體。脂質(zhì)體用探頭超聲儀超聲10分鐘(5輪，每輪2分鐘)。隨后脂質(zhì)體在高壓下用0.8μm聚碳酸酯濾器，然后用0.4μm和0.2μm的濾器進(jìn)行擠壓。將脂質(zhì)體凍干48小時(shí)，使用適量的蔗糖作為凍干保護(hù)劑。除了在dspc和膽固醇的初始混合物中使用281mgdspc和6mgmpeg-2000-dspe外，通過(guò)根據(jù)以上方法的薄膜法制備peg化脂質(zhì)體。脂質(zhì)體和peg化脂質(zhì)體的顆粒大小使用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)(nicompmodel370亞微米粒度儀，santabarbara，ca)測(cè)量。將脂質(zhì)體懸液適度稀釋，記錄顆粒大小。常規(guī)脂質(zhì)體的平均顆粒大小為254±147nm，peg化脂質(zhì)體的平均顆粒大小為245±139nm。常規(guī)脂質(zhì)體的包封率為9±2％，peg化脂質(zhì)體的為13±3％。為了從脂質(zhì)體和peg化脂質(zhì)體中分離未包封的藥物，使用了超濾技術(shù)。簡(jiǎn)言之，將0.4ml脂質(zhì)體加入管中，用beckman超速離心機(jī)以6000rpm在25℃下離心15分鐘。適度稀釋后，用分光光度法在280nm處分析濾液。常規(guī)和peg化脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素制劑都分別使用摩爾比為3∶1∶0和3∶1∶0.02的dspc、膽固醇和peg制備。脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素制劑制備的具體步驟已于最近發(fā)表。為了通過(guò)硫酸銨ph梯度法制備脂質(zhì)體，將143.5mgdspc和26mg膽固醇溶解于5ml氯仿中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將溶液蒸發(fā)至膜。該膜在真空干燥器中在室溫下放置過(guò)夜，從而形成脂質(zhì)膜的薄層。將該膜懸浮于10ml250mm硫酸銨溶液中30分鐘，隨后進(jìn)行冷凍(-80℃10分鐘)和解凍(40℃水浴)的10個(gè)循環(huán)。所得的多層囊泡用具有高壓擠壓器(northernlipidsinc.，usa)的聚碳酸酯濾器(孔徑：200，100和80nm，whatman，usa)擠壓5次。顆粒大小用前面描述的動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測(cè)量。未包封的硫酸銨通過(guò)4000rpm離心15分鐘去除。為了用萬(wàn)古霉素裝載脂質(zhì)體，將離心后得到的小單層囊泡懸浮于5ml的萬(wàn)古霉素溶液(50mg萬(wàn)古霉素溶解于5mlpbsph7.4)中，將所得溶液在室溫中放置3小時(shí)。為了分離脂質(zhì)體和未包封的萬(wàn)古霉素，之后使脂質(zhì)體通過(guò)100ml的sepharose-4b柱，收集不同級(jí)分，合并脂質(zhì)體級(jí)分。適當(dāng)稀釋后，通過(guò)分光光度法在280nm處分析級(jí)分以測(cè)量萬(wàn)古霉素的包封率。在加入適量(130mg)的蔗糖作為冷凍保護(hù)劑后對(duì)合并的脂質(zhì)體級(jí)分進(jìn)行冷凍干燥。除了在dspc和膽固醇的初始混合物中使用3mgmpeg-2000-dspe，以及萬(wàn)古霉素溶液通過(guò)添加50mg萬(wàn)古霉素至2mlpbs(而非5ml)而制備外，根據(jù)前面描述的硫酸銨ph梯度法制備peg化脂質(zhì)體。為了通過(guò)改進(jìn)的脫水-再水化法制備脂質(zhì)體，將287mgdspc和52mg膽固醇溶解于7ml氯仿中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)至膜。該膜在真空干燥器中在室溫下放置過(guò)夜，從而形成脂質(zhì)膜的薄層。該薄脂質(zhì)膜通過(guò)加入5ml高純度、去離子水孵育30分鐘進(jìn)行水化，使用探頭超聲儀超聲2分鐘。將脂質(zhì)體凍干48小時(shí)，使用140mg蔗糖作為冷凍保護(hù)劑。通過(guò)以下用萬(wàn)古霉素裝載脂質(zhì)體：將1ml萬(wàn)古霉素溶液(50mg萬(wàn)古霉素在5mlpbs，ph7.0中)加至凍干的空脂質(zhì)體，渦旋，室溫放置30分鐘。然后將生成的凝膠用4mlpbs稀釋。將形成的囊泡使用0.8，0.4和0.2μm濾器進(jìn)行擠壓。除了在dspc和膽固醇的初始混合物中使用281mgdspc和6mgmpeg-2000-dspe外，通過(guò)根據(jù)前面描述方法的脫水-再水化法制備peg化脂質(zhì)體。常規(guī)和peg化脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素制劑分別使用摩爾比為3∶1∶0和3∶1∶0.02的dspc、膽固醇和peg制備，。裝載有萬(wàn)古霉素的脂質(zhì)體在4℃存放備用。脂質(zhì)體中萬(wàn)古霉素的濃度通過(guò)uv-vis分光光度計(jì)(uv-mini，shimadzu，japan)在497nm處測(cè)量，裝載率根據(jù)下列方程計(jì)算：裝載率(％)＝ft/fi×100，其中ft是脂質(zhì)體中萬(wàn)古霉素溶解于由氯仿∶甲醇∶蒸餾水(2∶1∶0.05，體積/體積)組成的有機(jī)溶劑混合物后的濃度，fi是萬(wàn)古霉素的起始濃度。實(shí)施例2：藥代動(dòng)力學(xué)使至少52只小鼠(雄性cf-1小鼠來(lái)自于charlesriverlab，wilmington，ma)的組各接受單次劑量的5mg/kg萬(wàn)古霉素尾靜脈注射，萬(wàn)古霉素分別制備為標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素溶液，脂質(zhì)體包封的萬(wàn)古霉素的常規(guī)制劑或peg化脂質(zhì)體包封的萬(wàn)古霉素制劑。施用藥物后，各來(lái)自于不同萬(wàn)古霉素制劑(萬(wàn)古霉素溶液，常規(guī)脂質(zhì)體和peg化脂質(zhì)體)的三只小鼠在預(yù)先設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)(5、15、30和45分鐘，1、2、3、4、5、6、8、12、24和48小時(shí))吸入異氟烷(piramalhealthcare，ltd.，ap，india)而處死。收集每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死的小鼠血液。在1、4和24小時(shí)收集肝，腎，脾，肺和肌肉組織。將血液樣品置于肝素化的微型離心管中，通過(guò)離心分離血漿。通過(guò)簡(jiǎn)單的蛋白沉淀步驟將萬(wàn)古霉素從每個(gè)血漿樣品中提取出來(lái)。更具體地，將200μl血漿，250μl乙腈和250μl甲醇添加在一起?；旌衔餃u旋1分鐘，14000rpm離心10分鐘。取400μl上清液轉(zhuǎn)移至新管，用經(jīng)過(guò)濾空氣的流處理1-2小時(shí)蒸發(fā)至干。蒸發(fā)步驟中管內(nèi)形成的殘余物用200μl高純度去離子水重構(gòu)。開發(fā)和驗(yàn)證了敏感、快速和精準(zhǔn)的hplc方法，以測(cè)量每個(gè)上述重構(gòu)的組織蛋白質(zhì)制備物溶液的20μl樣品中萬(wàn)古霉素濃度。簡(jiǎn)言之，用c18柱(4.6×50mm，3μm)進(jìn)行檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm的色譜分離。將去甲萬(wàn)古霉素(10μl，100μg/μl的去甲萬(wàn)古霉素(northernchinapharmaceuticalcorp.shijiazhuang，hebei，china)加至200μl血漿中，以如樣品一樣的方式進(jìn)行制備和分析)。流動(dòng)相的構(gòu)成如下：由0.1％(v/v)tfa作為流動(dòng)相a和95∶5(v/v)乙腈/0.1％tfa作為流動(dòng)相b，梯度洗脫15分鐘，其中流動(dòng)相b在15％保持8分鐘，然后經(jīng)之后的7分鐘線性增加至100％，總流速為1ml/分鐘。該方法在0.1-20μg/ml范圍內(nèi)有良好的線性。根據(jù)在精密，準(zhǔn)確和線性方面評(píng)價(jià)分析方法的統(tǒng)一準(zhǔn)則的國(guó)際會(huì)議(internationalconferenceonharmonizationguidelinesforvalidationofanalyticalprocedureswithrespecttoprecision，accuracyandlinearity)驗(yàn)證該方法。使用經(jīng)驗(yàn)證的hplc測(cè)定進(jìn)行來(lái)自組織的樣品中萬(wàn)古霉素濃度的hplc分析以測(cè)定萬(wàn)古霉素水平。標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線在0.1-20μg/ml的濃度范圍內(nèi)呈線性，相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.995。萬(wàn)古霉素的檢測(cè)下限(llod，s/n5)為0.05μg/ml，定量的下限(lloq，s/n10)為0.1μg/ml。變異系數(shù)一日內(nèi)精密度時(shí)為1.7至9.5％，日間為6.3至9.4％。所有三種制劑的藥代動(dòng)力學(xué)譜如圖1所示。萬(wàn)古霉素血漿濃度在注射標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素制劑(t1/2-22分鐘)的開始2小時(shí)內(nèi)迅速下降，2小時(shí)后已沒有可檢測(cè)量。但是，常規(guī)和peg化脂質(zhì)體制劑注射后，萬(wàn)古霉素血漿濃度分別在4小時(shí)和12小時(shí)時(shí)保持為大于1μg/ml。48小時(shí)后，血漿中仍能檢測(cè)到萬(wàn)古霉素。使用非房室方法計(jì)算的藥代動(dòng)力學(xué)譜如表1所示。表1顯示，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)和常規(guī)脂質(zhì)體制劑，5分鐘時(shí)萬(wàn)古霉素血漿濃度峰值(cmax)分別為6.76±0.42μg/ml和9.80±1.07μg/ml；15分鐘時(shí)peg化脂質(zhì)體制劑的為15.48±1.71μg/ml。萬(wàn)古霉素血漿濃度-時(shí)間曲線下面積(auc)用線性梯形法計(jì)算。常規(guī)脂質(zhì)體的auc是標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素的4倍，peg化脂質(zhì)體的auc是常規(guī)脂質(zhì)體的1.7倍。相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素，施用脂質(zhì)體制劑時(shí)萬(wàn)古霉素的血漿半衰期延長(zhǎng)。機(jī)體總清除(cl)以劑量/auc計(jì)算。脂質(zhì)體包封的萬(wàn)古霉素使血漿中的清除降低。因?yàn)檠獫{濃度是測(cè)量來(lái)自于包含釋放的和仍包封的脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素的樣品，因此很難將數(shù)據(jù)擬合至具體的房室模型，也不能準(zhǔn)確地測(cè)量所有藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用prism軟件(lajolla，ca，usa)進(jìn)行兩因素anova隨后進(jìn)行bonferroni事后分析，以確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。p值≤0.05被認(rèn)為有顯著性。表1萬(wàn)古霉素制劑cmax(μg/ml)auc0.48(μg·h/ml)cl(ml/h)標(biāo)準(zhǔn)溶液6.76±0.426.82±0.181.83±0.25常規(guī)脂質(zhì)體9.79±1.0725.91±2.820.48±0.26peg化脂質(zhì)體15.48±1.7147.19±0.720.26±0.23實(shí)施例3：生物分布測(cè)定單劑量靜脈內(nèi)給予5-mg/kg標(biāo)準(zhǔn)、常規(guī)和peg化脂質(zhì)體萬(wàn)古霉素制劑后萬(wàn)古霉素在肝、腎、肺、脾和肌肉的生物分布。上述制劑向各組小鼠的施用以及給藥后處死步驟如實(shí)施例2所述進(jìn)行。組織的制備及分析根據(jù)如下方案。如前所述，分析了多個(gè)主要器官(肝、腎、肺、脾和肌肉)以確定靜脈內(nèi)注射后1，4和24小時(shí)萬(wàn)古霉素在這些組織中的分布，萬(wàn)古霉素分別制備為標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素溶液、脂質(zhì)體包封萬(wàn)古霉素的常規(guī)制劑或peg化脂質(zhì)體包封的萬(wàn)古霉素制劑。將組織樣品稱重、在pbs中勻漿(肝、腎、肺和肌肉0.5mg/ml，脾0.2mg/ml)。勻漿后，轉(zhuǎn)移300μl勻漿液至1.5mleppendorf微型離心管中，向其中加入250μl乙腈和250μl甲醇。然后將混合物渦旋1分鐘，14000rpm離心10分鐘。取上清液500μl轉(zhuǎn)移至試管中，用經(jīng)過(guò)濾空氣的流處理1-2小時(shí)蒸發(fā)至干。蒸發(fā)步驟中管內(nèi)形成的殘余物用200μl高純度去離子水重構(gòu)。作為內(nèi)部對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，向每管中加入10μl100μg/ml去甲萬(wàn)古霉素溶液，將混合物渦旋1分鐘，以與對(duì)樣品完全相同的方式進(jìn)行制備及分析。通過(guò)使用與以上所述相似的方法進(jìn)行來(lái)自組織的樣品的萬(wàn)古霉素濃度的hplc分析。hplc結(jié)果如下。如脾和肝組織中萬(wàn)古霉素水平的提高所證實(shí)的，脂質(zhì)體包封增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取(見圖2和圖3)。4小時(shí)和24小時(shí)時(shí)脾從peg化脂質(zhì)體中攝取的萬(wàn)古霉素較從常規(guī)脂質(zhì)體中攝取的顯著更少(p＜0.001，圖2)，1，4和24小時(shí)時(shí)肝從常規(guī)和peg化脂質(zhì)體制劑中攝取入肝組織的萬(wàn)古霉素較從標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素?cái)z取的顯著更多(p＜0.001，圖3)。不論施用哪種萬(wàn)古霉素制劑，給藥后4小時(shí)肝中萬(wàn)古霉素濃度達(dá)最高。auc，aumc和mrt值如表2所示。關(guān)于萬(wàn)古霉素在肺部的分布，與標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素溶液相比，常規(guī)或peg化脂質(zhì)體包封的萬(wàn)古霉素在肺組織有更大的分布(圖4)。而且，施用后5分鐘，1小時(shí)，4小時(shí)和24小時(shí)時(shí)，peg化脂質(zhì)體包封的萬(wàn)古霉素的分布較常規(guī)脂質(zhì)體包封的萬(wàn)古霉素的分布大。24小時(shí)時(shí)的差異具有統(tǒng)計(jì)顯著性(p＜0.001，圖4)。auc，aumc和mrt值如表2所示。關(guān)于萬(wàn)古霉素在腎的分布，與標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素溶液相比，脂質(zhì)體包封的萬(wàn)古霉素通常與較小的分布相關(guān)(圖5)。在5分鐘(p＜0.001)和1小時(shí)(p＜0.01)時(shí)，兩種脂質(zhì)體制劑和標(biāo)準(zhǔn)萬(wàn)古霉素制劑相比，萬(wàn)古霉素在腎的分布有顯著性差異。auc，aumc和mrt值如表2所示。關(guān)于萬(wàn)古霉素在肌肉的分布，不論施用哪種制劑，在任何時(shí)間點(diǎn)均未肌肉組織中檢測(cè)到顯著水平的萬(wàn)古霉素。表2參考文獻(xiàn)1.rubinsteine，kollefmh，nathwanid.pneumoniacausedbymethicillin-resistantstaphylococcusaureus.clininfectdis.[article].2008jun；46：s378-s85.2.guidelinesforthemanagement，ofadultswithhospital-acquired，ventilator-associated，andhealthcare-associatedpneumonia.amjrespircritcaremed.[review].2005feb；171(4)：388-416.3.kuehnertmj，hillha，kupronisba，tokarsji，solomonsl，jernigandb.methicillinresistant-staphylococcusaureushospitalizations，unitedstates.emerginfectdis.[article].2005jun；11(6)：868-72.4.choiey，huhjw，limcm，kohy，kimsh，choish，etal.relationshipbetweenthemicofvancomycinandclinicaloutcomeinpatientswithmrsanosocomialpneumonia.intensivecaremed.2011apr；37(4)：639-47.5.shulmanlm，pretzer-aboffi，andersonke，stevensonr，vaughancg，gruber-baldinial，etal.subjectivereportversusobjectivemeasurementofactivitiesofdailylivinginparkinson′sdisease.movdisord.2006jun；21(6)：794-9.6.kollefmh.limitationsofvancomycininthemanagementofresistantstaphylococcalinfections.clininfectdis.[article].2007sep；45：s191-s5.7.stevensdl.theroleofvancomycininthetreatmentparadigm.clininfectdis.2006jan1；42suppl1：s51-7.8.crucianim，gattig，lazzarinil，furlang，broccalig，malenam，etal.penetrationofvancomycinintohumanlungtissue.jantimicrobchemother.1996november1，1996；38(5)：865-9.9.moise-broderpa，forresta，birminghammc278，schentagjj.pharmacodynamicsofvancomycinandotherantimicrobialsinpatientswithstaphylococcusaureuslowerrespiratorytractinfections.clinpharmacokinet.[review].2004；43(13)：925-42.10.onyejico，nightingalech，marangosmn.enhancedkillingofmethicillinresistantstaphylococcusaureusinhumanmacrophagesbyliposome-entrappedvancomycinandteicoplanin.infection.1994；22(5)：338-42.11.pumerantza，muppidik，agnihotris，guerrac，venketaramanv，wangj，etal.preparationofliposomalvancomycinandintracellularkillingofmeticillin-resistantstaphylococcusaureus(mrsa).injantimicrobagents.2011feb；37(2)：140-4.12.gouldim.clinicalrelevanceofincreasingglycopeptidemicsagainststaphylococcusaureus.intjantimicrobagents.2008apr；31suppl2：1-9.13.steinkrausg，whiter，friedrichl.vancomycinmiccreepinnon-vancomycinintermediatestaphylococcusaureus(visa)，vancomycin-susceptibleclinicalmethicillinresistants.aureus(mrsa)bloodisolatesfrom2001-05.jantimicrobchemother.2007oct；60(4)：788-94.14.lowyfd.isstaphylococcusaureusanintracellularpathogen？trendsmicrobiol.[editorialmaterial].2000aug；8(8)：341-3.15.sinhab，fraunholzm.staphylococcusaureushostcellinvasionandpost-invasionevents.ihtjmedmicrobiol.[review].2010feb；300(2-3)：170-5.16.garzonic，kelleywl.staphylococcusaureus：newevidenceforintracellularpersistence.trendsmicrobiol.[review].2009feb；17(2)：59-65.17.fostertj.immuneevasionbystaphylococci.natrevmicrobiol.[review].2005dec；3(12)：948-58.18.allentm.liposomaldrugformulations.rationalefordevelopmentandwhatwecanexpectforthefuture.drugs.1998nov；56(5)：747-56.19.drulis-kawaz，dorotkiewicz-jacha.liposomesasdeliverysystemsforantibiotics.internationaljournalofpharmaceutics.387(1-2)：187-98.20.bakker-woudenbergi，schiffelersrm，stormg，beckermj，guol.long-circulatingstericallystabilizedliposomesinthetreatmentofinfections.liposomes，pte.sandiego：elsevieracademicpressinc；2005.p.228-60.21.bakker-woudenbergi.long-circulatingstericallystabilizedliposomesascarriersofagentsfortreatmentofinfectionorforimaginginfectiousfoci.intjantimicrobagents.[proceedingspaper].2002apr；19(4)：299-311.22.kirbyc，clarkej，gregoriadisg.effectofthecholesterolcontentofsmallunilamellarliposomesontheirstabilityinvivoandinvitro.biochemj.1980186：591-98.23.banghamad，standishmm，watkinsjc.diffusionofunivalentionsacrossthelamellaeofswollenphospholipids.jmolbiol.19651965；13(1)：238-52.24.jungsh，seongh，chosh，jeongks，shinbc.polyethyleneglycol-complexedcationicliposomeforenhancedcellularuptakeandanticanceractivity.internationaljournalofphar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