本發(fā)明涉及一種活性多肽在制備離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學(xué)法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi（簡(jiǎn)寫(xiě)為spkp-xi）在制備電壓門(mén)控鈉通道工具試劑-心肌鈉通道抑制劑中的用途。

背景技術(shù)：

電壓門(mén)控鈉通道廣泛分布于神經(jīng)元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，其參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過(guò)程,同時(shí)也是治療藥物作用的重要靶標(biāo)之一。鈉通道在動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳播過(guò)程中的關(guān)鍵性作用，電壓門(mén)控鈉通道成為很多動(dòng)植物毒素的作用靶標(biāo)。鈉離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究已經(jīng)成為國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。電壓門(mén)控鈉通道很可能成為神經(jīng)性和心血管等疾病的重要治療靶點(diǎn)。自然界的動(dòng)物毒素是一類(lèi)具有很高實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景的工具試劑或藥物導(dǎo)向物質(zhì)，不僅是有毒動(dòng)物抵御天敵的有力武器，也是從事神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究、天然創(chuàng)新藥物開(kāi)發(fā)以及蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究的寶貴材料,同時(shí)也是研究離子通道的獨(dú)特“分子探針和解密器”。迄今為止，從多種動(dòng)物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動(dòng)物等）的毒液中鑒定到了很多作用于鈉通道的活性成分。它們通過(guò)與鈉通道的不同位置相結(jié)合從而引起通道的動(dòng)力學(xué)特征發(fā)生相應(yīng)的變化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過(guò)闡述這些特異性調(diào)制劑作用于鈉通道的分子機(jī)制，除了在理論上可深入推測(cè)鈉通道亞型之間的功能活動(dòng)區(qū)別和門(mén)控活動(dòng)機(jī)制外，還可以為將它們開(kāi)發(fā)成治療人類(lèi)相關(guān)疾病的新藥提供充分的理論基礎(chǔ)和廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi在制備電壓門(mén)控鈉通道工具試劑-心肌鈉通道抑制劑中的應(yīng)用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi（簡(jiǎn)寫(xiě)為spkp-xi），其氨基酸序列為：

nh2-glucysarglysmetpheglyglycysservalaspseraspcyscysalahisleuglycyslysprothrleulystyrcysalatrpaspglythrphe-nh2

其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi作為單一有效活性組份用于制備心肌鈉通道抑制劑。

所述的一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-xi在制備電壓門(mén)控鈉通道工具試劑-nav1.5型鈉通道抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述的蜘蛛抑鉀肽-xi的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，n端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

該蜘蛛抑鉀肽-xi作為單一有效活性組分用于制備心肌鈉通道抑制劑，以細(xì)胞外給藥的方式制備成心肌鈉通道工具試劑。

蜘蛛抑鉀肽-xi在制備心肌鈉通道工具試劑或抑制劑時(shí)，配制細(xì)胞外給藥的劑量為5μmol/l。

蜘蛛抑鉀肽-xi抑制心肌鈉通道的半數(shù)有效作用劑量ic50為1.28μmol/l，是一種較好的心肌鈉通道工具試劑。

附圖說(shuō)明

圖1是空白對(duì)照下的心肌鈉通道電流。

圖2是5μmol/lspkp-xi對(duì)心肌鈉通道的影響。

圖3是spkp-xi作用于心肌鈉通道的濃度-效應(yīng)關(guān)系曲線(xiàn)。

圖4是spkp-xi對(duì)心肌鈉通道電流-電壓關(guān)系的影響。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解和更充分公開(kāi)本發(fā)明，下面將通過(guò)細(xì)胞外給藥途徑，采用原代心肌細(xì)胞模型來(lái)說(shuō)明蜘蛛抑鉀肽-xi的心肌鈉通道抑制作用。

1、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1大鼠心肌細(xì)胞(cardiacmyocytes)的分離和培養(yǎng)

心肌細(xì)胞也是目前常用于電生理領(lǐng)域研究的一種細(xì)胞，特別是應(yīng)用于研究藥物對(duì)受損心臟治療效果的機(jī)制，如缺血、缺氧等。與drg細(xì)胞相比，其上分布的離子通道種類(lèi)少、簡(jiǎn)單。鈉通道主要是ttx-r型（nav1.5）。含有l(wèi)-型高閾值激活和t-型低閾值激活鈣通道，但不含n-型鈣通道。

1.1.1組織溶液

含ca²⁺臺(tái)氏液:nacl143mm；kcl5.4mm；mgcl20.5mm；hepes5mm；nah2po40.33mm；glucose10mm；cacl21.8mm；用naoh調(diào)ph=7.4；

無(wú)ca²⁺臺(tái)氏液:nacl143mm；kcl5.4mm；mgcl20.5mm；hepes5mm；na2hpo40.33mm；glucose10mm；用naoh調(diào)ph=7.4；

kb液(l-glutamicacid70mm；kcl25mm；taurine20mm；kh2po410mm；mgcl23mm；egta0.5mm；glucose10mm；hepes10mm；用koh調(diào)ph=7.3)；

酶解液:30ml無(wú)鈣臺(tái)氏液中加入膠原酶4.5mg和牛血清白蛋白9mg。

以上溶液均用0.22微米孔徑的濾膜過(guò)濾，實(shí)驗(yàn)前于37℃水浴恒溫，充以95%的o2和5%的c02混合氣體10min至飽和。

1.1.2分離程序

首先在直徑10cm培養(yǎng)皿中盛放20ml含ca²⁺臺(tái)氏液，并用臺(tái)氏液先灌滿(mǎn)langendorff灌流裝置，關(guān)閉裝置并向裝置中充氧。在其后的整個(gè)灌流過(guò)程中不停充氧，且保持心臟內(nèi)部溫度始終在37℃左右。

取體重250g左右大鼠，雌雄不拘，斷頭，打開(kāi)胸腔，夾住心尖向上提起，剪斷血管，迅速取出心臟，注意保持心臟的完整，免受損傷。將心臟放入盛有臺(tái)氏液的培養(yǎng)皿中，冼去一部分凝血，如果心臟上部附有較多的脂肪等組織，可稍修剪。找到主動(dòng)脈（血管壁粗厚，直立），將主動(dòng)脈穿入langendorff灌流裝置的下部的針尖上，用棉線(xiàn)固定，用37℃有ca²⁺臺(tái)氏液灌流，可以看到心臟復(fù)跳，且搏動(dòng)越來(lái)越強(qiáng)，血液不斷流出，心臟壁上的血絲逐漸被洗去，至流出液體無(wú)血色，透明，換用無(wú)ca²⁺臺(tái)氏液沖洗。隨著ca²⁺的稀釋?zhuān)呐K搏動(dòng)漸趨微弱，心臟變硬并擴(kuò)大，灌流至心臟完全停止跳動(dòng)，用酶解液沖洗（30ml反復(fù)利用）6min，心臟顏色逐漸呈半透明，流出液體呈拉絲狀，稍變渾濁。換用kb液沖洗，洗凈心臟中的酶液，至心臟顏色由紅變白，由硬變軟，取下心臟，剪取下部心室部分，剪碎（酶解作用好的心臟內(nèi)部已呈粘稠狀），放入盛有10mlkb液的指管中，于37℃恒溫箱中振蕩5-8min。取細(xì)胞懸液于500轉(zhuǎn)/分離心2min，取離心沉淀，用kb液分裝入35mm培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)后細(xì)胞貼壁。在顯微鏡下挑選合適細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗記錄。

1.2膜片鉗電生理活性實(shí)驗(yàn)

膜片鉗實(shí)驗(yàn)均在室溫（25±1℃）進(jìn)行，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)。挑選質(zhì)膜光滑可見(jiàn)、胞質(zhì)均勻的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。電流記錄通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)利用epc9放大器(heka公司,german)在電腦上進(jìn)行。計(jì)算機(jī)記錄和分析系統(tǒng)采用pulse+pulsefit8.0軟件。玻璃電極管為硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管（南京泉水教學(xué)實(shí)驗(yàn)器材廠）。玻璃電極兩步拉制而成，經(jīng)拋光儀(narishige,japan)拋光后電極尖端直徑約為3μm，充灌電極液后電極電阻為1-3mω。膜片鉗實(shí)驗(yàn)要在室溫條件下進(jìn)行，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度的變動(dòng)最多上下不超過(guò)2℃。采用sigmaplot9.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1spkp-xi對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的鈉通道的影響

心肌細(xì)胞上所表達(dá)的鈉離子通道以ttx-不敏感型，即nav1.5為主，盡管也有報(bào)道認(rèn)為心肌細(xì)胞含有其他類(lèi)型的鈉離子通道，但是其表達(dá)量非常低，因此，spkp-xi對(duì)心肌細(xì)胞的鈉離子通道的影響可以被看作是對(duì)nav1.5通道的影響。由圖1和2可見(jiàn)，心肌鈉通道電流在加入5mm的spkp-xi之前和之后有明顯變化，表現(xiàn)為峰值電流減小以及失活變得較為緩慢。

在全細(xì)胞記錄電壓鉗模式下，將細(xì)胞鉗制在-80mv時(shí)，分別給予一組測(cè)試電壓，其變化范圍為-80～+50mv，步幅為+10mv，持續(xù)時(shí)間為50ms，可在心室肌細(xì)胞上得到ttx不敏感型鈉通道的激活電流-電壓（i-v）關(guān)系曲線(xiàn)圖（圖4），并能揭示出通道的激活閾值、逆轉(zhuǎn)電位和最大激活峰值電流電壓大小。在空白對(duì)照條件下，ttx不敏感型鈉通道的起始激活電壓為-50mv，最大峰值電流激活電壓為-30mv左右，逆轉(zhuǎn)電位為+35mv左右。

2.2spkp-xi對(duì)心肌電壓門(mén)控鈉通道激活狀態(tài)的影響

由圖4可見(jiàn)，5mmspkp-xi能夠在-60mv到+50mv之間的測(cè)試電壓范圍內(nèi)明顯抑制電流的失活相以及峰值電流，并在-20mv左右抑制比例最大；且能使通道始激活電壓和峰值電流激活電壓向去極化方向漂移超過(guò)+10mv，但反轉(zhuǎn)電位變化不明顯，說(shuō)明毒素不影響通道對(duì)鈉離子的選擇透過(guò)性。同時(shí)，spkp-xi對(duì)鈉通道的影響具有濃度依賴(lài)性(圖3)，其抑制鈉通道電流的ic50值為1.28mm。有意思的是，spkp-xi對(duì)心肌鈉通道的失活也有影響，能明顯延緩心肌鈉通道的失活(圖4)。在圖4中，i10ms代表在去極化10ms時(shí)測(cè)得的電流幅度值，在空白情況下，這一數(shù)值應(yīng)該為0，表示鈉通道已進(jìn)入正常的失活相，而在加入5mmspkp-xi的情況下，i10ms在-20mv仍有25±4%不能正常失活。這表明spkp-xi可以延緩心肌鈉通道的失活。

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