本發(fā)明提供一種竹節(jié)參總皂苷在制備抑制腸道衰老的疾病上的應(yīng)用。屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：隨著人類壽命的不斷提高，老齡化相關(guān)問(wèn)題日益嚴(yán)重。作為機(jī)體能量的首要來(lái)源組織--腸道在衰老中的作用逐漸引起研究者的重視，近期相關(guān)研究提示機(jī)體衰老始于腸道的衰老。在機(jī)體衰老過(guò)程中腸道的衰老可有多種表現(xiàn)，其中最重要的表現(xiàn)之一是腸道炎癥反應(yīng)。在增齡過(guò)程中，腸道炎癥反應(yīng)可引起腸道黏膜屏障功能逐漸受到損害，導(dǎo)致機(jī)體處于慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，并進(jìn)一步引發(fā)或加重其他炎癥相關(guān)疾病，加速衰老。而抑制衰老過(guò)程中的腸道炎癥反應(yīng)可減輕腸道黏膜屏障功能障礙，甚至可能是延緩機(jī)體衰老的重要措施。但目前衰老過(guò)程中腸道炎癥反應(yīng)的機(jī)制尚未完全明確，亦缺乏有效的干預(yù)手段。因此，深入探討衰老相關(guān)腸道炎癥反應(yīng)的機(jī)制，尋找有效的防治衰老過(guò)程中腸道炎癥反應(yīng)的藥物具有重要的科學(xué)意義。腸道屏障由黏膜上皮、腸道菌群、腸道內(nèi)分泌物等構(gòu)成。腸道屏障功能障礙使腸道通透性增加，細(xì)菌、內(nèi)毒素等外源性物質(zhì)即可通過(guò)緊密連接進(jìn)入體循環(huán)，觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征或多器官功能不全綜合征。而目前腸黏膜屏障功能障礙的機(jī)制尚不明確。機(jī)體衰老過(guò)程中存在腸道屏障功能障礙，其機(jī)制與腸道炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。hollanderd、katzd和maty等給不同年齡段的大鼠灌胃大、中分子探針如聚乙二醇(peg)400、peg634、甘露醇等后，發(fā)現(xiàn)衰老大鼠尿液中各分子的排泄量較青年大鼠顯著增加，提示機(jī)體衰老過(guò)程中腸道通透性增加。biagie等研究發(fā)現(xiàn)在老年人群體中存在低程度、無(wú)癥狀腸炎。在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中也存在類似的表現(xiàn)。tranl等研究發(fā)現(xiàn)，衰老的狒狒腸道存在炎癥反應(yīng)，炎癥因子il-1β、ifn-γ及il-6的表達(dá)增加，腸道黏膜屏障障礙。大量研究發(fā)現(xiàn)il-1β、tnf-α、ifn-γ等炎癥因子可參與介導(dǎo)多種疾病中的腸黏膜屏障功能障礙，破壞細(xì)胞間緊密連接；而抑制促炎因子則可降低細(xì)胞的通透性，保護(hù)腸道屏障功能。mapk/nf-κb通路是腸道炎癥反應(yīng)的重要通路。目前研究最廣泛的mapk信號(hào)通路包括p38mapk通路、jnk通路以及erk通路三條通路，三者均在炎癥中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞壁的成分lps以及宿主來(lái)源的il-1β、tnf-α都可使腸上皮細(xì)胞活化mapk通路。mapk通路活性增強(qiáng)已在多種腸道炎癥反應(yīng)模型發(fā)現(xiàn)，包括dss結(jié)腸炎，炎癥性腸病。在tnf-α誘導(dǎo)的ht-29細(xì)胞，erk信號(hào)通路活化。而p38抑制劑則可通過(guò)減少il-1β、tnf-α抑制dss誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。抑制jnk的活化可抑制il-1β誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。大量研究證實(shí)mapk可使nf-κb復(fù)合體中的tata結(jié)合蛋白發(fā)生磷酸化，從而調(diào)節(jié)nf-κb的轉(zhuǎn)錄活性，影響炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)歸。大量研究發(fā)現(xiàn)nf-κb可參與多種腸道炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，如dss誘導(dǎo)的結(jié)腸炎等多種腸道炎癥模型。nf-κb通過(guò)調(diào)節(jié)各種炎性基因轉(zhuǎn)錄的核轉(zhuǎn)錄因子，可以引發(fā)炎癥的瀑布式反應(yīng)，在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中起非常重要的作用，抑制nf-κb和mapk活性可以減輕腸道炎癥反應(yīng)，改善潰瘍性結(jié)腸炎全身炎癥狀態(tài)及免疫應(yīng)答，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)揮治療作用。調(diào)節(jié)mapk/nf-κb通路對(duì)維持腸道粘膜屏障功能具有重要作用。研究顯示p38mapk通路、jnk通路以及erk通路均可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間的緊密連接。elamine等研究志愿者參與的酒精誘導(dǎo)的腸道粘膜屏障功能障礙實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)mapk通路活化，磷酸化的mapk(包括p38、jnk以及erk)均增加，腸道通透性增加，細(xì)胞間緊密連接蛋白zo-1和occludin重排，zo-1與肌球蛋白輕鏈激酶(myosinlightchainkinase,mlck)的mrna表達(dá)減少；而進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)給予mapk抑制劑則抑制酒精引起的caco-2單層細(xì)胞粘膜屏障功能障礙模型，表明mapk通路的活化是腸道粘膜屏障功能障礙的重要因素。mihaescua等研究證實(shí)，應(yīng)用sb239063抑制p38mapk的活性可減輕放射線誘導(dǎo)結(jié)腸炎引起的腸道屏障功能障礙。costantinitw等也發(fā)現(xiàn)，p38mapk抑制劑sb203580可減輕燒傷引起的腸道屏障功能障礙。而且segawas等研究發(fā)現(xiàn)益生菌可通過(guò)抑制p38mapk通路保護(hù)腸道屏障功能。nf-κb也是維持腸道屏障功能的重要信號(hào)分子。nf-κb由iκb激酶(iκbkinase,ikk)活化。gumam等發(fā)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞特異性表達(dá)組成性活化的ikk的小鼠，其腸上皮細(xì)胞的nf-κb活化，并表達(dá)大量的炎癥因子；這種小鼠更容易受外界刺激影響，腸道屏障功能更易受損，出現(xiàn)腸道上皮細(xì)胞的凋亡和細(xì)菌的移位，而且炎癥反應(yīng)依賴于mapk通路的活化。竹節(jié)參又名竹節(jié)三七、竹節(jié)人參、白三七等，系五加科人參屬植物竹節(jié)參的干燥呈竹鞭狀根莖，是我國(guó)西南地區(qū)民間常用中草藥，被土家族、苗族居民視為“草藥之王”。竹節(jié)參味甘、微苦，性溫，歸肝、脾、肺經(jīng)，具有散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳、補(bǔ)虛強(qiáng)壯等功效，主要用于治療癆嗽咯血、跌撲損傷、咳嗽痰多、病后虛弱等癥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參對(duì)消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有廣泛的藥理作用。而且本項(xiàng)目前期研究發(fā)現(xiàn)：自然衰老大鼠腸道粘膜屏障功能障礙，腸道炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，il-1β、cox2、il-18的表達(dá)增加，nf-κb核轉(zhuǎn)位增多，而竹節(jié)參總皂苷可降低自然衰老大鼠腸道炎癥反應(yīng)，降低nf-κb核轉(zhuǎn)位水平，但竹節(jié)參總皂苷能否通過(guò)影響mapk通路活性，減少nf-κbp65向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而降低衰老過(guò)程中腸道的炎癥反應(yīng)，改善衰老大鼠腸道粘膜屏障功能障礙還有待研究。機(jī)體衰老過(guò)程中存在腸道屏障功能障礙，而且其機(jī)制主要由腸道炎癥反應(yīng)引起。調(diào)節(jié)mapk/nf-κb通路對(duì)維持腸道粘膜屏障功能具有重要作用，其活化增強(qiáng)也是引起腸道炎癥反應(yīng)的重要因素。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在腸道衰老過(guò)程中mapk/nf-κb通路活性增強(qiáng)，導(dǎo)致腸道炎癥反應(yīng)，最終引起腸道屏障功能障礙；本發(fā)明提供一種竹節(jié)參總皂苷在制備抑制腸道衰老的疾病上的應(yīng)用。具體為在制備抑制腸道炎癥的疾病上的應(yīng)用。本發(fā)明提供的竹節(jié)參總皂苷可通過(guò)降低mapk/nf-κb通路活性，減輕腸道炎癥反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)腸道粘膜屏障以延緩腸道衰老。竹節(jié)參總皂苷竹節(jié)參經(jīng)三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院鄒坤教授鑒定為五加科人參屬植物竹節(jié)參panaxjaponicusc.a.mey.的干燥根莖。取竹節(jié)參干燥根莖粗粉，加入60％乙醇加熱回流3次，合并濾液后濃縮干燥，得到竹節(jié)參總提物粉末，以人參皂苷re為對(duì)照品，采用香草醛-高氯酸比色法測(cè)定竹節(jié)參總皂苷的含量為67.66％。動(dòng)物spf級(jí)雄性sd大鼠60只，購(gòu)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：scxk(鄂)2011-0061，分為成年組(6月齡)、衰老組(24月齡)及藥物干預(yù)組(高、中、低劑量竹節(jié)參總皂苷干預(yù)24月齡大鼠)五組，每組12只大鼠。竹節(jié)參總皂苷高、中、低劑量分別為10，30，60mg.kg-1。大鼠自18月齡開(kāi)始灌胃給藥，每天一次，每周給藥6次，共給藥6個(gè)月。給藥6個(gè)月結(jié)束后，大鼠禁食24h后10％水合氯醛麻醉處死，沿腹正中線進(jìn)入腹中自回盲部取結(jié)腸新鮮組織，過(guò)液氮后放-80°低溫冰箱保存。試劑d-乳酸試劑盒購(gòu)自biovision公司，rna逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自takara公司，tnf-α、il-1β、β-actin引物序列由生工生物工程(上海)有限公司提供(表1)。p-p38、p38、p-jnk、jnk、p-erk、erk、nf-κb抗體購(gòu)自cellsignalingtechnology公司，claudin1、occludin、il-1β、β-actin抗體購(gòu)自santacruz公司，tnf-α抗體購(gòu)自abcam公司?；瘜W(xué)發(fā)光劑ecl，碧云天生物技術(shù)研究所。d-乳酸試劑盒檢測(cè)大鼠血清d-乳酸水平大鼠麻醉后腹動(dòng)脈取全血，靜置30分鐘后800r/min離心6分鐘后取血清-80°冰箱保存待用。實(shí)驗(yàn)前將-80°保存的血清取出，完全解凍后取適量體積血清按照d-乳酸試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在450處測(cè)od值，計(jì)算血清d-乳酸水平。rt-pcr檢測(cè)炎癥因子基因表達(dá)按照rna提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取組織中的總rna，用核酸測(cè)定儀檢測(cè)rna的濃度和od260/od280比值，重復(fù)測(cè)定1次，測(cè)得的od260/od280比值在1.8-2.0范圍內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄，pcr擴(kuò)增和電泳成像分析。pcr反應(yīng)體系總體積為25ul：10.5μldepc水，12.5μlpcrmastermix(2x),加入tnf-α、il-1β引物上下游各0.5μl，最后加入cdna模板1μl。使用β-actin作為內(nèi)參。擴(kuò)增條件是94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，goto2，35times，72℃5min，4℃低溫保存。產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳分析，利用凝膠成像儀拍照，測(cè)定電泳條帶吸光度值，用imagej軟件計(jì)算tnf-α、il-1β與actin吸光度比值。表1pcr引物序列引物上游下游tnf-αtcagcctcctctctgccatccaatgactccaaagtagacctgccil-1βtgcctcgtgctgtctgacggtgggtgtgccgtctttcβ-actintgaccgagcgtggctacagcagggaggaagaggatgcgwesternblot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)稱取50-100mg的結(jié)腸組織按蛋白裂解液：磷酸蛋白酶抑制劑：pmsf＝100∶1∶1的比例提取總蛋白后，bca法蛋白定量，將定量的蛋白樣品于95℃變性5-10min后分別進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，按濕轉(zhuǎn)法將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到pvdf膜，5％的脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，tbst洗3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育1h，ecl顯色，利用image-proplus6.0軟件進(jìn)行分析。免疫組織化學(xué)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)將保存的石蠟標(biāo)本，連續(xù)橫斷切片，每只大鼠取5張切片，厚4μm，制備石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟至水后，置于抗原修復(fù)液水浴煮沸30min。自然冷卻后加3％雙氧水封閉過(guò)氧化物酶10min，pbs沖洗3次每次5min，之后加bsa封閉30min，然后加入相關(guān)一抗4℃孵育，過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，dab顯色，蘇木素復(fù)染5min，鹽酸酒精分化，脫水封片。于顯微鏡下觀察，利用image-proplus7.0圖像分析系統(tǒng)拍片。附圖說(shuō)明圖1為各組大鼠血清d-乳酸表達(dá)水平，adult：青年組大鼠(6月齡)aging：自然衰老大鼠(24月齡)與6m組比較，*p﹤0.05,**p﹤0.01；與24m組比較，#p﹤0.05,##p﹤0.01。圖2為不同月齡及給予spj干預(yù)后大鼠結(jié)腸組織occludin免疫組織化學(xué)染色，a：6月齡；b：24月齡；c:spj治療組(10mg/kg/day)；d：spj治療組(30mg/kg/day)；e：spj治療組(60mg/kg/day)；與6m組比較，*p﹤0.05,**p﹤0.01；與24m組比較，#p﹤0.05,##p﹤0.01。圖3為不同月齡及給予spj干預(yù)后大鼠結(jié)腸組織occludin免疫組織光密度分析，a：6月齡；b：24月齡；c:spj治療組(10mg/kg/day)；d：spj治療組(30mg/kg/day)；e：spj治療組(60mg/kg/day)；與6m組比較，*p﹤0.05,**p﹤0.01；與24m組比較，#p﹤0.05,##p﹤0.01。圖4為不同月齡及給予spj干預(yù)后大鼠結(jié)腸組織claudin-1免疫組織化學(xué)染色，a：6月齡；b：24月齡；c:spj治療組(10mg/kg/day)；d：spj治療組(30mg/kg/day)；e：spj治療組(60mg/kg/day)；與6m組比較，*p﹤0.05,**p﹤0.01；與24m組比較，#p﹤0.05,##p﹤0.01。圖5為不同月齡及給予spj干預(yù)后大鼠結(jié)腸組織claudin-1免疫組織光密度分析，a：6月齡；b：24月齡；c:spj治療組(10mg/kg/day)；d：spj治療組(30mg/kg/day)；e：spj治療組(60mg/kg/day)；與6m組比較，*p﹤0.05,**p﹤0.01；與24m組比較，#p﹤0.05,##p﹤0.01。圖6為spj對(duì)衰老大鼠結(jié)腸炎癥因子il-1β、tnf-αmrna水平的影響，adult：6月齡；aging：24月齡；與6m組比較，*p﹤0.05,**p﹤0.01；與24m組比較，#p﹤0.05,##p﹤0.01。圖7為spj對(duì)衰老大鼠結(jié)腸組織tnf-α、il-1β的蛋白表達(dá)的影響，adult：6月齡；aging：24月齡；與6m組比較，*p﹤0.05,**p﹤0.01；與24m組比較，#p﹤0.05,##p﹤0.01。圖8為spj對(duì)衰老大鼠結(jié)腸炎癥相關(guān)蛋白cox-2蛋白表達(dá)水平的影響，adult：6月齡；aging：24月齡；與6m組比較，*p﹤0.05,**p﹤0.01；與24m組比較，#p﹤0.05,##p﹤0.01。圖9為spj對(duì)衰老大鼠結(jié)腸p-p38、p38蛋白表達(dá)的影響，adult：6月齡；aging：24月齡；與6m組比較，*p﹤0.05,**p﹤0.01；與24m組比較，#p﹤0.05,##p﹤0.01。圖10為spj對(duì)衰老大鼠結(jié)腸p-erk、erk蛋白表達(dá)的影響，adult：6月齡；aging：24月齡；與6m組比較，*p﹤0.05,**p﹤0.01；與24m組比較，#p﹤0.05,##p﹤0.01。圖11為spj對(duì)衰老大鼠結(jié)腸jnk、p-jnk蛋白表達(dá)的影響，adult：6月齡；aging：24月齡；與6m組比較，*p﹤0.05,**p﹤0.01；與24m組比較，#p﹤0.05,##p﹤0.01。圖12為spj對(duì)衰老大鼠結(jié)腸nf-κb蛋白表達(dá)的影響。具體實(shí)施方式自然衰老大鼠血清d-乳酸水平的變化及竹節(jié)參總皂苷的調(diào)節(jié)作用用d-乳酸試劑盒檢測(cè)青年組、自然衰老組、竹節(jié)參總皂苷低、中、高劑量干預(yù)組的血清d-乳酸的水平。與青年組比較，自然衰老大鼠血清d-乳酸水平顯著升高，說(shuō)明自然衰老大鼠腸粘膜屏障功能發(fā)生障礙，腸粘膜通透性增高，而給予竹節(jié)參總皂苷提前干預(yù)后，血清d-乳酸水平與自然衰老組比較，竹節(jié)參總皂苷高劑量組顯著性下降，低中劑量組有所下降，但無(wú)顯著性差異。結(jié)果見(jiàn)圖1。自然衰老大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-1的表達(dá)水平的變化及竹節(jié)參總皂苷的調(diào)節(jié)作用用免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸緊密連接蛋白o(hù)ccludin和claudin-1的表達(dá)水平，occludin和claudin-1蛋白主要分布在結(jié)腸上皮細(xì)胞漿中，其中occludin在細(xì)胞核中也有分布。與青年組比較自然衰老大鼠結(jié)腸occludin和claudin-1表達(dá)水平顯著下降，而竹節(jié)參總皂苷提前干預(yù)組occludin和claudin-1表達(dá)水平與自然衰老組比較顯著升高。結(jié)果見(jiàn)圖2-5。rt-pcr法檢測(cè)各組大鼠結(jié)腸炎癥因子il-1β、tnf-αmrna水平結(jié)果顯示自然衰老大鼠結(jié)腸炎癥因子il-1β、tnf-αmrna水平與青年組比較，顯著升高，而竹節(jié)參總皂苷提前干預(yù)組il-1β、tnf-αmrna水與自然衰老組比較顯著降低。見(jiàn)圖6。westernblot法檢測(cè)結(jié)腸炎癥因子il-1β、tnf-α和cox-2的蛋白表達(dá)水平的變化及竹節(jié)參總皂苷的調(diào)節(jié)作用結(jié)果顯示自然衰老大鼠結(jié)腸炎癥因子il-1β、tnf-α和cox-2蛋白水平與青年組比較，顯著升高，而竹節(jié)參總皂苷提前干預(yù)組子il-1β、tnf-α和cox-2蛋白水平與自然衰老組比較顯著降低。見(jiàn)圖7、圖8。westernblot法檢測(cè)結(jié)腸mapk/nf-kb通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化及竹節(jié)參總皂苷的調(diào)節(jié)作用結(jié)果顯示自然衰老大鼠mapk/nf-κb相關(guān)信號(hào)分子p-p38、p-erk、p-jnk、jnk和nf-κb蛋白水平與青年組比較，顯著升高，而竹節(jié)參總皂苷提前干預(yù)組相應(yīng)蛋白分子表達(dá)水平與自然衰老組比較顯著降低。見(jiàn)圖9、圖10、圖11、圖12。當(dāng)前第1頁(yè)12