本發(fā)明屬于腫瘤基因治療藥物領(lǐng)域，具體涉及aurora-a激酶抑制劑xy-4陽離子脂質(zhì)體，以及該脂質(zhì)體和bcl-xlsirna聯(lián)合組成組合物，以及應(yīng)用于抗腫瘤藥物、抗腫瘤輔助藥物制備方面的用途。

背景技術(shù)：

在化學(xué)治療藥物的應(yīng)用方面，藥物的水溶性差對一個藥物來說是一個很棘手的問題。近年來，有不少科研工作者為解決這一問題進行了大量的研究工作，脂質(zhì)體作為給藥載體可以有效的實現(xiàn)藥物的靶向，提高藥物的局部濃度，延長藥物作用時間，增強對腫瘤的殺傷力，減少對正常細(xì)胞的毒副作用，被用于傳遞化療藥物和診斷材料的載體，以此來增加藥物的溶解度、減小系統(tǒng)的毒性并增加藥物循環(huán)時間。而陽離子脂質(zhì)體可以解決脂質(zhì)體進入普通脂質(zhì)體進入細(xì)胞的量少的問題。

基因傳遞(genedelivery)是一種將外源性的小干擾rna(sirna)導(dǎo)入癌細(xì)胞中沉默其抗凋亡基因的表達從而促進腫瘤細(xì)胞凋亡達到治療癌癥的方法。一般來說，基因傳遞系統(tǒng)載體可以分為兩類，分別是病毒載體和非病毒載體。非病毒載體與病毒載體相比表現(xiàn)出生物可降解性、低毒性、易轉(zhuǎn)染等優(yōu)點。在所有非病毒載體中，陽離子脂質(zhì)體又被認(rèn)為是最高效的基因傳遞載體之一。

靶向藥物和基因的聯(lián)合轉(zhuǎn)運治療是一種利用載體將目的基因和藥物高效傳遞到靶細(xì)胞或把組織中適時釋放出藥物和基因以達到協(xié)同治療目標(biāo)的生物學(xué)治療方法。在同一載體系統(tǒng)中聯(lián)合轉(zhuǎn)運藥物和sirna作用于癌細(xì)胞比單獨轉(zhuǎn)運sirna或藥物進行治療更有效。目前聯(lián)合轉(zhuǎn)運的想法已被提出，在同一個輸送系統(tǒng)中聯(lián)合轉(zhuǎn)運藥物和sirna有望解決癌細(xì)胞容易產(chǎn)生的多重耐藥性的問題。目前，構(gòu)建一種安全高效的用于聯(lián)合轉(zhuǎn)運的載體已成為研究熱點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)治療藥物水溶性差、毒副作用大、容易產(chǎn)生耐藥性的不足，提供一種陽離子脂質(zhì)體。特別可以是激酶抑制劑的陽離子脂質(zhì)體。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

一種藥物陽離子脂質(zhì)體，其組成包括陽離子類脂和脂溶性藥物，其中所述陽離子類脂與脂溶性藥物的質(zhì)量比為100:1～1:1。

抗腫瘤的化學(xué)藥物單獨使用經(jīng)常會出現(xiàn)藥物的耐藥性以至于達不到想要的治療效果，本發(fā)明提供的陽離子脂質(zhì)體很好的解決了藥物的水不溶性問題，且制備簡單、方便，具有緩釋的作用，在物理學(xué)表征和體外生物學(xué)研究中針對該方法協(xié)同抗腫瘤效果的實驗已得到良好的評價效果。具體的研究表明陽離子脂質(zhì)體對藥物的具有非常高的包封率，復(fù)合載體對化合物xy-4(下述aurora-a激酶抑制劑化合物，變化xy-4)的包封率均大于80％，經(jīng)過脂質(zhì)體包封，藥物利用率提高，用量減少，耐藥性的產(chǎn)生可以得到減少/降低。

進一步，所述陽離子類脂與脂溶性藥物的質(zhì)量比為20:1～10:1，更優(yōu)選20:1。

進一步的，所述陽離子類脂為dotap，陽離子脂質(zhì)體用磷脂，cas號132172-61-3，其結(jié)構(gòu)如下：

進一步，所述脂溶性藥物為抗腫瘤藥物或抗腫瘤化合物。優(yōu)選為aurora-a激酶抑制劑。更優(yōu)選，所述抗腫瘤藥物/抗腫瘤化合物結(jié)構(gòu)式如下：

進一步，所述陽離子脂質(zhì)體的粒徑小于200nm，最小可達到100nm以下。并且，在水中呈單分散狀態(tài)，能有效提高藥物的轉(zhuǎn)運效率，是現(xiàn)代技術(shù)未能達到的效果。

本發(fā)明的另一目的是提供制備上述激酶抑制劑陽離子脂質(zhì)體的方法。

一種制備上述藥物陽離子脂質(zhì)體的方法，包括如下步驟：

(1)稱取陽離子類脂和脂溶性藥物，優(yōu)選為脂溶性抗腫瘤藥物，加入有機溶劑溶解。所述陽離子類脂優(yōu)選為dotap。所述有機溶劑優(yōu)選為氯仿。

(2)40-70℃蒸發(fā)干燥得到脂質(zhì)體膜，優(yōu)選為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。氯仿沸點為61.2℃，優(yōu)選45-61℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到脂質(zhì)體膜。最好是，55±2℃水浴真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1h得脂質(zhì)體膜，并干燥。

(3)在脂質(zhì)體膜中加入50-60℃水，旋轉(zhuǎn)水化，得到藥物陽離子脂質(zhì)體溶液。優(yōu)選加入超純水55±2℃水浴旋轉(zhuǎn)水化20-40min，優(yōu)選30min，得藥物陽離子脂質(zhì)體溶液。

上述制備過程中，按配比將陽離子脂質(zhì)體和脂溶性藥物在脂溶性有機溶劑中混合完全溶解后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)完全除去有機溶劑后，瓶壁上形成一層薄膜，再加水水化得藥物脂質(zhì)體。制備方法簡單易行，可以將脂溶性藥物包封到脂質(zhì)體中，完成藥物和脂質(zhì)體的完美復(fù)合，實現(xiàn)新的具有脂溶性易進入細(xì)胞組織的緩釋藥物。

本發(fā)明的另一目的是提供一種上述激酶抑制劑陽離子脂質(zhì)體和sirna構(gòu)成組合物。

一種組合物，包括上述藥物陽離子脂質(zhì)體和sirna；藥物陽離子脂質(zhì)體中的藥物和sirna的摩爾比為1000:1～25：1。

其中，藥物陽離子脂質(zhì)體的組成包括陽離子類脂和脂溶性藥物，所述陽離子類脂與脂溶性藥物的質(zhì)量比為100:1～1:1。

具有抗腫瘤藥物的陽離子脂質(zhì)體與sirna構(gòu)成組合物，實現(xiàn)了高效率的聯(lián)合轉(zhuǎn)運復(fù)合載體，解決了抗腫瘤化合物的水不溶的問題，使得藥物的利用率提高，且毒性低、轉(zhuǎn)染效率高，且因為在同一個系統(tǒng)中聯(lián)合轉(zhuǎn)運藥物和sirna有效克服腫瘤細(xì)胞的耐受性，包括癌細(xì)胞容易產(chǎn)生的多重耐藥性。可以在極低的藥物濃度范圍內(nèi)實現(xiàn)高效的治療效果，并兼具緩釋功效，延長藥物作用時間，增強治療效果。

上述組合物中藥物陽離子脂質(zhì)體與sirna聯(lián)合使用在制備抗癌藥物中，脂質(zhì)體和sirna聯(lián)合應(yīng)用或在輸送抗癌藥物和腫瘤治療基因藥物中，制備得到的是復(fù)方復(fù)合制劑。將具有抗癌活性的脂溶性藥物按照本發(fā)明的方法制備成陽離子脂質(zhì)體并與sirna聯(lián)合使用，用于癌癥的治療，不僅可以克服脂溶性藥物的溶解性問題，還可以使抗癌藥物與sirna達到聯(lián)合治療癌癥的效果，更有效克服腫瘤細(xì)胞的耐受性包括聯(lián)合轉(zhuǎn)運可以有效克服癌細(xì)胞容易產(chǎn)生的多重耐藥性。

優(yōu)選的，所述陽離子類脂與脂溶性藥物的質(zhì)量比為20:1～10:1，更優(yōu)選20:1。

優(yōu)選的，所述的藥物脂質(zhì)體中的藥物和sirna的摩爾比為800:1～25:1，更優(yōu)選400:1。

進一步的，所述陽離子類脂為dotap，陽離子脂質(zhì)體用磷脂，cas號132172-61-3，其結(jié)構(gòu)如下：

進一步，所述陽離子脂質(zhì)體的粒徑小于200nm，最小可達到100nm以下。并且，在水中呈單分散狀態(tài)，與sirna聯(lián)用能有效提高藥物和基因的轉(zhuǎn)運效率，能夠有效的吸附承載sirna成為復(fù)合藥物制劑，是現(xiàn)代技術(shù)未能達到的效果。

進一步，所述脂溶性藥物優(yōu)選為抗腫瘤化合物。

進一步，所選抗腫瘤藥物為自主合成aurora-a激酶抑制劑，編號xy-4。本發(fā)明的陽離子脂質(zhì)體具有對藥物的高包封率，復(fù)合載體對化合物xy-4的包封率均大于80％。

進一步，所述抗腫瘤化合物結(jié)構(gòu)式如下：

進一步，上述技術(shù)方案中，sirna為bcl-xlsirna。陽離子脂質(zhì)體的粒徑小，在水中呈單分散狀態(tài)，與sirna聯(lián)用后，借助于靜電吸附作用，能有效實現(xiàn)對于小干擾rna基因的轉(zhuǎn)運效率。

本發(fā)明的另一目的是提供制備上述組合物的方法，對于上述技術(shù)方案中所述的組合物的制備方法。

一種制備上述組合物的方法，包括如下步驟：

(1)稱取陽離子類脂和脂溶性藥物，優(yōu)選為脂溶性抗腫瘤藥物，加入有機溶劑溶解。所述陽離子類脂優(yōu)選為dotap。所述有機溶劑優(yōu)選為氯仿。

(2)40-70℃蒸發(fā)干燥得到脂質(zhì)體膜，優(yōu)選為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥。氯仿沸點為61.2℃，優(yōu)選45-61℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到脂質(zhì)體膜。最好是，55±2℃水浴真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1h得脂質(zhì)體膜，并干燥。

(3)在脂質(zhì)體膜中加入50-60℃水，旋轉(zhuǎn)水化，得到藥物陽離子脂質(zhì)體溶液。優(yōu)選加入超純水55±2℃水浴旋轉(zhuǎn)水化20-40min，優(yōu)選30min，得藥物陽離子脂質(zhì)體溶液。

(4)將上述制得的藥物陽離子脂質(zhì)體與sirna按配比混合，室溫孵育10-30min，優(yōu)選15～20min，得到聯(lián)合使用的復(fù)合載體。

單獨的抗腫瘤藥物容易產(chǎn)生耐藥性，不能很好的發(fā)揮治療作用。而采用小干擾rna(sirna)將腫瘤相關(guān)基因(抗凋亡基因)沉默的方法，能夠避免了藥物的耐藥性，但單獨使用的sirna面臨一個如何導(dǎo)入細(xì)胞的問題。本發(fā)明將藥物陽離子脂質(zhì)體與sirna聯(lián)合在一起，制成抗腫瘤的組合物(復(fù)方制劑)，既解決了抗腫瘤的化學(xué)藥物單獨使用經(jīng)常會出現(xiàn)藥物的耐藥性，sirna難以導(dǎo)入細(xì)胞的問題。通過兩者治療效果的協(xié)同配合達到理想的治療效果。

原理如下：抗腫瘤藥物的陽離子藥物被制備成表面帶正電荷的陽離子脂質(zhì)體，其表面的正電荷通過靜電作用與sirna結(jié)合形成一種復(fù)合物。這種復(fù)合物與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合進入細(xì)胞，同時釋放藥物和sirna，二者達到完美的協(xié)同抗腫瘤的作用。

本發(fā)明將有望成功開發(fā)出一種藥物和sirna聯(lián)合使用協(xié)同抗腫瘤的新的腫瘤治療方法。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種藥物陽離子脂質(zhì)體與sirna聯(lián)合使用抗腫瘤的方法?？鼓[瘤的化學(xué)藥物單獨使用經(jīng)常會出現(xiàn)藥物的耐藥性以致于達不到想要的治療效果，而采用小干擾rna(sirna)將腫瘤相關(guān)基因沉默的方法則很好地避免了藥物的耐藥性，但單獨使用的sirna面臨一個如何導(dǎo)入細(xì)胞的問題。

本發(fā)明將抗腫瘤的陽離子藥物制備成一種表面帶正電荷的陽離子脂質(zhì)體，其表面的正電荷通過靜電作用與sirna結(jié)合形成一種復(fù)合物，再與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合進入細(xì)胞，釋放藥物和sirna，二者達到協(xié)同抗腫瘤的作用。

此外，本發(fā)明提供的陽離子脂質(zhì)體很好的解決了藥物的水不溶性問題，且制備簡單、方便，具有緩釋的作用，在物理學(xué)表征和體外生物學(xué)研究中針對該方法協(xié)同抗腫瘤效果的實驗已得到良好的評價效果。

本發(fā)明將有望成功開發(fā)出一種藥物和sirna聯(lián)合使用協(xié)同抗腫瘤的新的腫瘤治療方法。

附圖說明：

圖1a為xy-4陽離子脂質(zhì)體的粒徑檢測圖；

圖1b是xy-4陽離子脂質(zhì)體的zeta電位檢測圖。

圖2為游離xy-4和xy-4陽離子脂質(zhì)體的體外釋放曲線。

圖3為游離香豆素-6、香豆素-6陽離子脂質(zhì)體和香豆素-6中性脂質(zhì)體藥物組合被b16細(xì)胞攝取的情況。

圖4為陽離子脂質(zhì)體、空白脂質(zhì)體以及游離xy-4對b16細(xì)胞的體外生長抑制曲線。

圖5為不同比例的xy-4與sirna對b16細(xì)胞的生長的抑制效果。

圖6為xy-4與sirna比例為400:1，xy-4的藥物濃度為2.5～80μmsirna的濃度為6.25～200nm對b16細(xì)胞的生長抑制效果。

圖7為xy-4與sirna聯(lián)合使用協(xié)同抗腫瘤的凋亡流式圖。

圖8為xy-4與sirna聯(lián)合使用協(xié)同抗腫瘤的周期流式圖。

具體實施方式

下面結(jié)合試驗例及具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明中未特別說明的比例一般為重量比例。

實施例1xy-4陽離子脂質(zhì)體的制備

稱取40mgdotap和2mgxy-4溶解于4ml三氯甲烷中，待充分溶解后轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，55℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1h，將溶劑完全除盡，在瓶壁形成一層薄膜。加入4ml超純水55℃水浴下水化半小時，最終超純水定容制得xy-4的陽離子脂質(zhì)體(0.5mg/ml)。

稱取40mgdotap和溶解于4ml三氯甲烷中，待充分溶解后轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，55℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1h，將溶劑完全除盡，在瓶壁形成一層薄膜。加入4ml超純水55℃水浴下水化半小時，最終超純水定容制得空白的陽離子脂質(zhì)體。

實施例2xy-4陽離子脂質(zhì)體的粒徑和zeta電位檢測

采用激光散射粒度儀(馬爾文zen-3600)在25℃，光散射角度90°條件下測定xy-4陽離子脂質(zhì)體的粒徑及zeta電位。用移液槍取20ml實施例1中制備的xy-4陽離子脂質(zhì)體用超純水稀釋100倍后分別進行粒徑和zeta電位檢測。

圖1a為xy-4陽離子脂質(zhì)體的粒徑檢測圖，圖1b為xy-4陽離子脂質(zhì)體的zeta電位檢測圖。結(jié)果顯示，本發(fā)明實施例1制備的xy-4陽離子脂質(zhì)體的平均粒徑在91.3nm，電位為38.5mv。

實施例3xy-4陽離子脂質(zhì)體體外釋放度實驗

采用透析法檢測xy-4陽離子脂質(zhì)體的釋放情況。將xy-4陽離子脂質(zhì)體和等濃度游離xy-4溶液裝入用pbs浸泡處理過的透析袋(截留分子量mn＝3kda)中并將兩端扎緊，放入30ml含0.5％吐溫-80的pbs(磷酸鹽緩沖液)透析液中。在固定的時間點(2、4、6、8、12、24、48、72h)進行取樣并及時補充等量的新鮮透析液，所取樣品進高效液相進行分析xy-4的含量。

圖2為xy-4陽離子脂質(zhì)體和游離xy-4的體外釋放曲線。結(jié)果顯示，釋放4天后，游離組和脂質(zhì)體組分別有70％和64％釋放出來，且很明顯游離組釋放更快更多，說明該xy-4陽離子脂質(zhì)體具有相較于游離xy-4溶液更加緩釋的作用。

實施例4xy-4陽離子脂質(zhì)體包封率檢測

采用高效液相色譜法檢測xy-4脂質(zhì)體包封率。

第一步，繪制xy-4標(biāo)準(zhǔn)曲線，色譜條件如下：采用phenomenexgemini5μmc18110a色譜柱子，紫外檢測波長設(shè)置為230nm，柱溫為37℃，流動相為75:25(v/v)甲醇和水。在此條件下將用色譜甲醇配置的一系列濃度梯度xy-4標(biāo)準(zhǔn)品(濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.09、0.1μg/μl)依次進樣，每個濃度重復(fù)進樣3次，記錄色譜峰并對其進行積分和分析，以峰面積(y)和質(zhì)量濃度(x)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進行線性回歸得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y＝7185.4x-11819，r²＝0.9999。

第二步，檢測xy-4陽離子脂質(zhì)體中xy-4的包封率。取500μlxy-4陽離子脂質(zhì)體加入2ml甲醇充分溶解后過濾在同上述標(biāo)準(zhǔn)曲線相同色譜條件下進樣記錄色譜峰圖并對其進行積分和分析通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算，得到脂質(zhì)體中藥物的總量；取100μl超濾離心管離心下的液體，加入甲醇400μl，過濾并按照上述條件進樣，記錄色譜圖進行積分分析并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到脂質(zhì)體中的游離xy-4量，包封率的計算方法為：包封率＝(藥物總量-游離藥量)/藥物總量×100％。實施例1中制備的xy-4陽離子脂質(zhì)體的包封率為84.6％。

實施例5體外細(xì)胞實驗

①細(xì)胞攝取實驗

稱取40mgdotap和2mg香豆素-6溶解于4ml三氯甲烷中，待充分溶解后轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，55℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1h，將溶劑完全除盡，在瓶壁形成一層薄膜。加入4ml超純水55℃水浴下水化半小時，最終超純水定容制得香豆素-6的陽離子脂質(zhì)體(0.5mg/ml)。

稱取40mg大豆卵磷脂(spc)和2mg香豆素-6溶解于4ml三氯甲烷中，待充分溶解后轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，55℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1h，將溶劑完全除盡，在瓶壁形成一層薄膜。加入4ml超純水55℃水浴下水化半小時，最終超純水定容制得香豆素-6中性脂質(zhì)體(0.5mg/ml)。

將b16細(xì)胞(小鼠黑色素瘤細(xì)胞)按照60000個每孔的密度接種于24孔板，每孔添加0.5ml含10％胎牛血清和1％雙抗的1640培養(yǎng)基。37℃、5％co2條件孵箱培養(yǎng)24h后，每孔加入相應(yīng)的游離香豆素-6及香豆素-6脂質(zhì)體處理，40min后每孔滴入hoechst染色20min，棄培養(yǎng)基加入1ml生理鹽水在熒光顯微鏡(olympusix73；olympuscorporation,tokyo,japan)下觀察并拍照。

圖3為香豆素-6的陽離子脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體與游離香豆素比較背b16細(xì)胞攝取的情況。如圖所示，b16細(xì)胞被處理后，陽離子香豆素-6脂質(zhì)體處理組的細(xì)胞中的熒光強度明顯強于同劑量下游離香豆素-6和中性香豆素-6脂質(zhì)體處理組的細(xì)胞。由此說明，腫瘤細(xì)胞對于陽離子脂質(zhì)體具有更好的攝取作用。

②毒性研究(mtt比色法)

將b16細(xì)胞按照每孔4000個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl含10％fbs(胎牛血清)和1％雙抗的rpmi1640培養(yǎng)基。24h后，將游離xy-4溶液用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度(40、20、10、5、2.5、1.25μm)的溶液加入孔中，每孔100ml每孔設(shè)置3個復(fù)孔，空白培養(yǎng)基作為陰性對照組，處理48h后每孔加入10％體積5mg/mlmtt溶液并繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育4h。吸取96孔板中的舊培養(yǎng)基，每孔加入150μl二甲基亞砜(dmso)后置于搖床上使藍(lán)紫色甲瓚充分溶解，570nm波長下測定吸光度。

基于mtt比色法的檢測原理為：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能是外源性mtt還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚(formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，二甲基亞砜(dmso)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。細(xì)胞存活的百分比率(％)的計算公式為：

細(xì)胞存活率(％)＝a實驗組/a對照×100％

a實驗組為測試孔的吸光度值，a對照為陰性對照的吸光度值。

圖4為游離xy-4對b16細(xì)胞處理后的生長曲線。結(jié)果顯示游離xy-4對b16細(xì)胞的生長具有較明顯的抑制作用。

將b16細(xì)胞按照每孔4000個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl含10％fbs和1％雙抗的rpmi1640培養(yǎng)基。24h后，將50nm的bcl-xlsirna分別與40、20、10、5、2.5、1.25μm的xy-4溶液(bcl-xlsirna與xy-4的比例為：1:800、1:400、1:200、1:100、1：50、1:25)在室溫下混勻孵育20min后加入96孔板中，每孔100μl，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。處理72h后每孔加入10％體積5mg/mlmtt溶液并繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育4h。吸取96孔板中的舊培養(yǎng)基，每孔加入150μl二甲基亞砜(dmso)后置于搖床上使藍(lán)紫色甲瓚充分溶解，570nm波長下測定吸光度，計算細(xì)胞存活率。

圖5為bcl-xlsirna與xy-4在不同比例下聯(lián)合使用對于b16細(xì)胞生長抑制作用的比較。當(dāng)聯(lián)合使用的比例為800:1和400:1時，二者對b16黑色素瘤細(xì)胞具有明顯的協(xié)同抗增殖作用。在該比例下，二者聯(lián)合使用的細(xì)胞存活率要比單獨使用xy-4或單獨使用sirna時要低。并且隨著xy-4的量的增加，所顯示的協(xié)同效應(yīng)也增加。

將b16細(xì)胞按照每孔4000個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl含10％fbs和1％雙抗的rpmi1640培養(yǎng)基。24h后，sirna的濃度為6.25～200nmxy-4的藥物濃度為2.5～80μm，二者比例為1:400，分別用bcl-xlsirna、游離xy-4、bcl-xlsirna+空白陽離子脂質(zhì)體、bcl-xlsirna+空白陽離子脂質(zhì)體+xy-4處理細(xì)胞。72h后，每孔加入10％體積5mg/mlmtt溶液并繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育4h。吸取96孔板中的舊培養(yǎng)基，每孔加入150μl二甲基亞砜(dmso)后置于搖床上使藍(lán)紫色甲瓚充分溶解，570nm波長下測定吸光度，計算細(xì)胞存活率。

圖6為bcl-xlsirna聯(lián)合xy-4抑制b16細(xì)胞的生長狀況。

③細(xì)胞周期和凋亡檢測實驗

將b16細(xì)胞(小鼠黑色素瘤細(xì)胞)種植于24孔板中，每孔加入500μl含6×10⁴個細(xì)胞的包含10％fbs和1％雙抗的rpmi1640培養(yǎng)基。細(xì)胞密度達到80-90％時，移去舊培養(yǎng)基，用等量無血清rpmi1640培養(yǎng)基清洗并替換。依次加入本發(fā)明制備的xy-4陽離子脂質(zhì)體(40μm)、游離xy-4(40μm)、xy-4陽離子脂質(zhì)體+sirna(40μm+100nm)轉(zhuǎn)染48h，以加等量培養(yǎng)基作為空白對照。收集細(xì)胞1500r/min離心5min，棄培養(yǎng)液。用pbs洗滌1次并離心去pbs后加入預(yù)冷的70％乙醇4℃固定過夜。次日1500r/min離心5min棄固定液后再用預(yù)冷pbs洗2遍。每個流式管加入200μlpi染液震蕩均勻，避光染色30min。pi用氬離子激發(fā)熒光，產(chǎn)生紅色熒光分析pi熒光強度的直方圖和前散射光對側(cè)散射光的散點圖。碘化丙啶(propidiumiodide,pi)是一種核酸染料，它不能穿透完整細(xì)胞膜，但對凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的破損細(xì)胞能夠穿透，并使細(xì)胞核染紅。用流式細(xì)胞分析儀可以定量分析細(xì)胞凋亡的情況。

圖7是用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果，具體為xy-4與sirna聯(lián)合使用協(xié)同抗腫瘤的凋亡流式圖。圖7a是熒光散射強度直方圖，顯示xy-4、sibcl-xl-clp、xy-4/sibcl-xl-clp試驗組的細(xì)胞凋亡率相對于對照組有明顯增高，特別是xy-4/sibcl-xl-clp試驗組殺死瘤細(xì)胞的比率最高。圖7b是各個試驗組的總細(xì)胞凋亡率數(shù)據(jù)對照圖表，顯示xy-4/sibcl-xl-clp試驗組瘤細(xì)胞凋亡率最高。

圖8具體為xy-4與sirna聯(lián)合使用協(xié)同抗腫瘤的周期流式圖。圖8a是瘤細(xì)胞停留在不同的細(xì)胞周期的熒光測試結(jié)果，xy-4試驗組的測試結(jié)構(gòu)熒光分析強度顯著的低于對照組的情況。圖8b是對照組和xy-4試驗組的細(xì)胞周期分布對比，顯示xy-4能夠很好的將瘤細(xì)胞分裂停留在g2-m，進而達到對于瘤細(xì)胞的凋亡殺滅作用。