本發(fā)明涉及大分子藥物的藥物給藥系統(tǒng)領(lǐng)域，具體涉及一種溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球及其制備方法。

背景技術(shù)：

溶菌酶(lysozyme)又稱細(xì)胞壁溶解酶，是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，能切斷肽聚糖中位于n-乙酰胞壁酸(nam)和n-乙酰葡萄糖胺(nag)間的β-1，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，在內(nèi)部滲透壓作用下細(xì)胞破裂，引起細(xì)胞裂解。溶菌酶是一種有效的抗菌劑，該酶對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌中的枯草芽孢桿菌、普通變形菌和副溶血性弧菌具有良好的抑制作用，對(duì)革蘭氏陰性菌也有一定程度的溶解作用。此外，溶菌酶還具有抗病毒、增強(qiáng)免疫力的作用。在醫(yī)療上，溶菌酶首先適用于五官科的各種炎癥，還可以用于治療扁平疣、傳染性軟疣、異常性疣、尖銳濕疣、帶狀皰疹多種皮膚病。此外，溶菌酶還可用于小兒或乳兒哮喘性支氣管炎、呼吸道內(nèi)膜腫脹等。溶菌酶作為一種具有抗菌、消炎、抗病毒作用的天然蛋白，其在醫(yī)療方面的研發(fā)及應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越得到關(guān)注，但是其制劑臨床上主要有溶菌酶含片。

交聯(lián)葡聚糖微球(cross-linkeddextranmicrosphere)是由葡聚糖與交聯(lián)劑環(huán)氧氯丙烷經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)制得的細(xì)小微珠，又名聚糖酐(dextranomer)，經(jīng)純化滅菌后用于臨床，現(xiàn)在已收載于歐盟藥典第八版。該藥在上世紀(jì)70年代首先由瑞士生產(chǎn)及應(yīng)用，近年來(lái)歐洲一些國(guó)家及美國(guó)均采用。葡聚糖微球內(nèi)部為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有豐富的羥基，因此具有很強(qiáng)的吸水性膨脹性和生物粘附性。臨床上交聯(lián)葡聚糖微球常單獨(dú)使用，用于吸附炎癥滲出物，清潔創(chuàng)面，促進(jìn)滲出性創(chuàng)傷的愈合。但是，交聯(lián)葡聚糖微球雖然可吸附創(chuàng)面上的細(xì)菌，降低創(chuàng)面的細(xì)菌密度但其本身并不具有抗菌、消炎的藥理作用。由于傷口表面細(xì)菌的堆積，可能會(huì)引起傷口的再次感染，因此會(huì)對(duì)傷口的愈合造成不利的影響。

通過(guò)物理吸附載藥法將溶菌酶載入交聯(lián)葡聚糖微球中制備得到的溶菌酶緩釋微球，具有良好吸水性能和生物粘附性以及藥物緩釋作用，可用于粘膜和皮膚給藥，而且可用于口服給藥，增加溶菌酶在粘膜(如口腔、鼻腔、腸道、直腸和陰道)和皮膚的滯留與作用時(shí)間，更好地發(fā)揮溶菌酶局部的消炎、抗菌、抗病毒能力。該緩釋微球制備工藝簡(jiǎn)單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。目前未見(jiàn)溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球及其制備方法。

本發(fā)明溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球由溶菌酶和交聯(lián)葡聚糖微球組成。

本發(fā)明溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球中各組分質(zhì)量百分含量為：

溶菌酶2％～15％

交聯(lián)葡聚糖微球85％～98％

本發(fā)明溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球中藥物溶菌酶為雞蛋清溶菌酶或具有相似功能其他來(lái)源的溶菌酶，如鳥(niǎo)類蛋清溶菌酶，以及生物工程技術(shù)制備的溶菌酶，其中載藥量為2％～15％。

本發(fā)明溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球中交聯(lián)葡聚糖微球?yàn)槠暇厶墙?jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)反應(yīng)而制得的粒徑為100～300μm，膨脹度為2ml/g～15ml/g，輻射滅菌處理的微球。

本發(fā)明溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球采用物理吸附載藥法制備，其制備方法是：稱取一定量的溶菌酶加入到一定ph范圍的純化水中，溶解制備得到一定濃度的溶菌酶溶液，加入一定量的交聯(lián)葡聚糖微球，在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢枋刮⑶蛲耆稚⒑?，于室溫下靜置，過(guò)濾收集微球，真空冷凍干燥后得到溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球。

本發(fā)明特征在于采用物理吸附載藥法，條件溫和，工藝簡(jiǎn)單，對(duì)溶菌酶的活性不會(huì)產(chǎn)生影響，可保證溶菌酶制劑的療效。

本發(fā)明特征在于：載溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球具有較高的載藥量，且載藥量可控，載藥量在2％～15％之間，體外釋放顯示具有良好的緩釋作用，可以使得該制劑長(zhǎng)時(shí)間發(fā)揮抗菌作用。

本發(fā)明載溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球，具有強(qiáng)大的吸水性能和生物吸附能力(如吸附細(xì)菌)，以及藥物緩釋作用，可保證充分發(fā)揮溶菌酶局部的抗菌、消炎、抗病毒作用。體外抑菌試驗(yàn)表明，其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽胞桿菌具有顯著的抑制作用。

本發(fā)明還提供一種溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球的組合物，它是所述的溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球，加上醫(yī)藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的藥物組合物。

本發(fā)明提供的溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球的組合物，適用于粘膜和皮膚外用制劑以及口服制劑，發(fā)揮藥物局部治療作用。

溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

附圖說(shuō)明

圖1溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球形態(tài)圖。

圖2溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球體外釋放曲線圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球制備

處方：溶菌酶0.05g

交聯(lián)葡聚糖微球1.0g

純化水10ml

制備方法：在潔凈區(qū)內(nèi)，取處方量溶菌酶溶解在純化水中，加入處方量的交聯(lián)葡聚糖微球，室溫下攪拌至微球完全分散，靜置吸附載藥4h。過(guò)濾收集微球，真空冷凍干燥得到溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球，載藥量為2.85％。

實(shí)施例2溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球制備

處方：溶菌酶0.225g

交聯(lián)葡聚糖微球1.0g

純化水15ml

制備方法：取處方量溶菌酶溶解在純化水中，加入處方量的交聯(lián)葡聚糖微球，室溫下攪拌至微球完全分散，靜置吸附載藥12h。過(guò)濾收集微球，真空冷凍干燥得到溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球，載藥量為7.80％。

實(shí)施例3溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球制備

處方：溶菌酶0.5g

交聯(lián)葡聚糖微球2.0g

純化水20ml

制備方法：取處方量溶菌酶溶解在純化水中，加入處方量的交聯(lián)葡聚糖微球，室溫下在攪拌至微球完全分散，靜置吸附載藥24h。過(guò)濾收集微球，真空冷凍干燥得到溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球(見(jiàn)圖1)，載藥量為13.25％，平均粒徑為207um，膨脹度為8.9ml/g。

實(shí)施例4溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球制備

處方：溶菌酶0.5g

交聯(lián)葡聚糖微球2.0g

ph4.5純化水20ml

制備方法：取處方量溶菌酶溶解在ph4.5純化水中，加入處方量交聯(lián)葡聚糖微球，室溫下在攪拌至微球完全分散，靜置吸附載藥24h。過(guò)濾收集微球，真空冷凍干燥得到溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球，載藥量為12.9％。

實(shí)施例5溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球制備

處方：溶菌酶0.5g

交聯(lián)葡聚糖微球2.0g

ph6.8純化水20ml

制備方法：取處方量溶菌酶溶解在ph6.8純化水中，加入處方量交聯(lián)葡聚糖微球，室溫下在攪拌至微球完全分散，靜置吸附載藥24h。過(guò)濾收集微球，真空冷凍干燥得到溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球，載藥量為13.1％。

實(shí)施例6溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球體外釋放考察

樣品：實(shí)施例3溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球

釋放方法：在滿足漏槽條件的情況下，采用靜態(tài)釋放方法測(cè)定藥物的釋放行為。取實(shí)施例3溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球0.2g，加入10ml經(jīng)脫氣處理的37℃的純化水，置37℃恒溫水浴搖床中進(jìn)行釋放，分別在0.5h，1.0h，2.0h，4.0h，8.0h，12.0h，24h取樣1ml至10ml容量瓶中，用純化水稀釋至刻度，同時(shí)補(bǔ)加1ml新鮮介質(zhì)。測(cè)定溶菌酶釋放量。由累積釋放量-時(shí)間作圖，見(jiàn)圖2。由圖2可知，溶菌酶交聯(lián)葡聚糖微球制劑具有良好的緩釋性能。

實(shí)施例7溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球體外抑菌效果試驗(yàn)

樣品：

溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球：分別用5mg/ml，10mg/ml，15mg/ml，20mg/ml，25mg/ml的溶菌酶溶液，按實(shí)施例3的制備方法制得載藥量不同的溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球。

溶菌酶溶液：6.625mg/ml溶菌酶溶液

空白微球：空白交聯(lián)葡聚糖微球

無(wú)菌水：滅菌純化水

亞硝酸鈉溶液：0.3mg/ml亞硝酸鈉溶液

實(shí)驗(yàn)方法：

體外抑菌圈試驗(yàn)-牛津杯法：在無(wú)菌條件下，將已滅菌的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒入培養(yǎng)皿中，每碟15ml(下層)，待其凝固。另外，將融化的培養(yǎng)基冷卻到50℃左右混入濃度為10⁶cfu/ml的枯草芽胞桿菌菌液200ul，然后將混有菌液的培養(yǎng)基5ml倒入己凝固的培養(yǎng)基上(上層)，待其凝固。然后在培養(yǎng)基表面垂直放置已滅菌的牛津杯，向每個(gè)牛津杯中分別加入制備的不同載藥量的載溶菌酶葡聚糖微球制劑樣品、空白葡聚糖微球各10mg，再向每個(gè)牛津杯中加入200ul無(wú)菌水。將接好菌的平皿置于35℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌圈大小。實(shí)驗(yàn)以無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，以6.625mg/ml的溶菌酶溶液和0.3mg/ml亞硝酸鈉溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1抑菌試驗(yàn)結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知載溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球?qū)莶菅堪麠U菌具有抑制效果，隨著載藥量的增加，抑菌圈直徑也逐漸增加，載溶菌酶交聯(lián)葡聚糖緩釋微球樣品5與6.625mg/ml的溶菌酶溶液進(jìn)行比較，抑菌圈大小分別為20mm和19mm，結(jié)果表明，具有相同溶菌酶濃度的緩釋微球比溶菌酶溶液具有更好的抑菌效果，而空白葡聚糖微球、無(wú)菌水和0.3mg/ml亞硝酸鈉溶液沒(méi)有抑菌效果。另外，表1表明載藥用溶菌酶濃度增加，緩釋微球載藥量增加。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。