技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明提供一種富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑制造方法，同時(shí)還公開(kāi)了富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑的醫(yī)用用途，屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景：

以動(dòng)脈粥樣硬化為病理基礎(chǔ)的心腦血管病在許多國(guó)家是死亡率最高的疾病。上個(gè)世紀(jì)70年代以來(lái)，生物化學(xué)領(lǐng)域?qū)Ω呙芏戎鞍着c動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性研究日趨活躍。多方研究證實(shí)，高密度脂蛋白與動(dòng)脈硬化呈負(fù)相關(guān)，且低密度脂蛋白與高密度脂蛋白的比值，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展更具決定意義。

目前，有望獲得高密度脂蛋白制劑的其它制備工藝是：從低溫乙醇法的fⅳ（組分4）繼續(xù)用酒精沉淀獲取高密度脂蛋白制劑，但未見(jiàn)獲得制品的具體技術(shù)方法和制品活性檢測(cè)的報(bào)道。

不言自明的是，乙醇對(duì)脂蛋白的損傷會(huì)比陽(yáng)離子沉淀劑利凡諾要大得多。此為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的基本出發(fā)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明提供一種富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑的制造方法，制劑的收率比較高，生物活性強(qiáng)。

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑的醫(yī)用用途，預(yù)示能夠清除老年人（或其它原因引發(fā)的）動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，避免或減緩心肌梗塞和腦梗塞等嚴(yán)重疾病的發(fā)生。

本發(fā)明所述的一種富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑制造方法，包括以下步驟：

1.1將低溫乙醇法生產(chǎn)人血白蛋白和丙種球蛋白工藝中廢棄的fⅳ加入不銹鋼反應(yīng)罐，以碳酸鈉溶液調(diào)ph8.2~8.8，加入等體積2.4%~3.2%利凡諾溶液，充分?jǐn)嚢韬蟪恋盱o止8~16小時(shí)，將上清和沉淀分離；

1.2分離出上清液的粘稠沉淀在反應(yīng)罐中解離，將下部混懸液泵入藍(lán)氏離心機(jī)離心，甩干沉淀加入無(wú)熱原蒸餾水稀釋溶解，泵入壓濾器中澄清；

1.3澄清液以sartocon-超濾器超濾脫鹽，濃縮。濃縮液在2~6℃溫度下靜止6小時(shí)以上，除菌過(guò)濾，60℃10小時(shí)病毒滅火后，以生理鹽水調(diào)至12毫克/毫升蛋白濃度分裝，即得成品。3批收得率77.38%－－81.02%，平均收得率為79.20%.

本發(fā)明制備的富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑，經(jīng)動(dòng)物（兔）試驗(yàn)證實(shí)，可以顯著降低總膽固醇，甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇，且能夠去除動(dòng)脈硬化斑塊72%以上。上述試驗(yàn)預(yù)示，該制劑可以清除老年人（或其它原因引發(fā)的）動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，避免或減緩心肌梗塞和腦梗塞等嚴(yán)重疾病的發(fā)生，對(duì)于延長(zhǎng)人類壽命具有重大意義。本發(fā)明對(duì)脂肪肝亦有明顯療效。

本發(fā)明的積極效果在于：

建立了富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑制造方法，工藝流程可重復(fù)性好，穩(wěn)定性強(qiáng)；

建立了以某物質(zhì)為特定保護(hù)劑的富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑的病毒滅活方法，即60°10小時(shí)的巴斯德加熱法；

建立了富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和鑒定規(guī)程；

完成了富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑的保存方法和穩(wěn)定性試驗(yàn)，保存期在12個(gè)月以上；

完成了富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑去除兔實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化療效研究，效果十分可觀（去除面積達(dá)72%以上），此作用和效果為現(xiàn)有其它藥物所不具備。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明試驗(yàn)例主動(dòng)脈壁直觀圖片；

圖2為本發(fā)明試驗(yàn)例主動(dòng)脈病理圖片；

圖3為本發(fā)明試驗(yàn)例肝臟病理圖片。

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

1.1將低溫乙醇法生產(chǎn)人血白蛋白和丙種球蛋白工藝中廢棄的fⅳ加入不銹鋼反應(yīng)罐，以碳酸鈉溶液調(diào)ph8.5，加入等體積2.8%利凡諾溶液，充分?jǐn)嚢韬蟪恋盱o止12小時(shí)，將上清和沉淀分離；

1.2分離出上清液的粘稠沉淀在反應(yīng)罐中解離，將下部混懸液泵入藍(lán)氏離心機(jī)離心，甩干沉淀加入無(wú)熱原蒸餾水稀釋溶解，泵入壓濾器中澄清；

1.3澄清液以sartocon-超濾器超濾脫鹽，濃縮。濃縮液在2~6℃溫度下靜止6小時(shí)以上，除菌過(guò)濾，60℃10小時(shí)病毒滅火后，以生理鹽水調(diào)至12毫克/毫升蛋白濃度分裝，即得成品。收得率為77.38%.

實(shí)施例2

1.1將低溫乙醇法生產(chǎn)人血白蛋白和丙種球蛋白工藝中廢棄的fⅳ加入不銹鋼反應(yīng)罐，以碳酸鈉溶液調(diào)ph8.8，加入等體積3.2%利凡諾溶液，充分?jǐn)嚢韬蟪恋盱o止16小時(shí)，將上清和沉淀分離；

1.2分離出上清液的粘稠沉淀在反應(yīng)罐中解離，將下部混懸液泵入藍(lán)氏離心機(jī)離心，甩干沉淀加入無(wú)熱原蒸餾水稀釋溶解，泵入壓濾器中澄清；

1.3澄清液以sartocon-超濾器超濾脫鹽，濃縮。濃縮液在2~6℃溫度下靜止6小時(shí)以上，除菌過(guò)濾，60℃10小時(shí)病毒滅火后，以生理鹽水調(diào)至12毫克/毫升蛋白濃度分裝，即得成品。收得率為81.02%.

實(shí)施例3

1.1將低溫乙醇法生產(chǎn)人血白蛋白和丙種球蛋白工藝中廢棄的fⅳ加入不銹鋼反應(yīng)罐，以碳酸鈉溶液調(diào)ph8.2，加入等體積2.4%利凡諾溶液，充分?jǐn)嚢韬蟪恋盱o止8小時(shí)，將上清和沉淀分離；

1.2分離出上清液的粘稠沉淀在反應(yīng)罐中解離，將下部混懸液泵入藍(lán)氏離心機(jī)離心，甩干沉淀加入無(wú)熱原蒸餾水稀釋溶解，泵入壓濾器中澄清；

1.3澄清液以sartocon-超濾器超濾脫鹽，濃縮。濃縮液在2~6℃溫度下靜止6小時(shí)以上，除菌過(guò)濾，60℃10小時(shí)病毒滅火后，以生理鹽水調(diào)至12毫克/毫升蛋白濃度分裝，即得成品。收得率為79.20%.

通過(guò)以下試驗(yàn)證明本發(fā)明的醫(yī)用用途：

測(cè)試?yán)?

以上實(shí)施例1-3收率和收量十分接近，按以下測(cè)試?yán)?的檢測(cè)方法檢測(cè)，其生物活性完全相同，說(shuō)明該發(fā)明工藝的可重復(fù)性好，制品的生物活性十分穩(wěn)定性。

不同制備方法的收得率比較。以上述利凡諾沉淀fⅳ制備富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑（以下簡(jiǎn)稱：“人血hdl”）6批次，人血hdl的平均收得率為79.20%。而以低溫乙醇法制備人血hdl3批次，平均收得率為60.46%。收得率相差30.99%，可謂顯著。

測(cè)試?yán)?

不同制備方法的生物活性比較。采用以人單核細(xì)胞株u937為材料，以oxldl孵育造泡沫化模型，再以hdl作用于泡沫細(xì)胞，使泡沫細(xì)胞釋放膽固醇，細(xì)胞內(nèi)剩余膽固醇的量以高壓液相色譜法測(cè)定。

測(cè)定的結(jié)果是，以本發(fā)明建立的利凡諾法制備的hdl可使48.57%膽固醇釋出到細(xì)胞外，而以低溫乙醇法制備的hdl只能使24.48%膽固醇釋出到細(xì)胞外，可見(jiàn)兩種制備方法獲得的制品生物活性相差之大。

測(cè)試?yán)?

本發(fā)明富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑（一下簡(jiǎn)稱“人血hdl”）去除兔實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化療效試驗(yàn)

注：本試驗(yàn)療效研究所用人血hdl是實(shí)施例1~實(shí)施例3制備的制品

1.1.動(dòng)物模型和動(dòng)物分組

大耳白兔67只（某生研所動(dòng)物室提供），體重2.0-2.5kg，雌雄兼用?；A(chǔ)飼料適應(yīng)兩周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（8只），造型組（59只）。正常對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,造型組飼喂高脂飼料（每只每天膽固醇1.5g，蛋黃粉4.5g和豬油10g），兩部分基礎(chǔ)飼料用量相同，連續(xù)45天。經(jīng)12小時(shí)饑餓，由耳靜脈采血，測(cè)膽固醇、甘油三脂、hdl-c和ldl-c；證實(shí)造模型成功（見(jiàn)表1，給藥前），并根據(jù)造型兔血脂水平隨機(jī)分為四組，即as模型組，人血hdl高、中、低劑量三個(gè)組，連續(xù)治療10周，此階段仍繼續(xù)給高脂飼料（每只每天基礎(chǔ)飼料加膽固醇0.5g，蛋黃粉1.5g和豬油3g）。停用高脂飼料，改用基礎(chǔ)飼料后二周，采血和宰殺、測(cè)血脂、肝、血管壁中脂質(zhì)，并作血管壁直觀和病理切片觀察。

1.2.抗as試驗(yàn)方法人血hdl12mg/瓶?jī)龈芍破?，用滅菌蒸餾水溶解成3ml，人血hdl高、中、低三個(gè)劑量組分別按體重耳靜脈注射入血。hdl30、15和8mg/kg，2次/周，連續(xù)10周，正常對(duì)照組和as模型組各注射等體積生理鹽水。

1.3.檢測(cè)項(xiàng)目

末次給藥后3日，耳靜脈取血用752型紫外━━可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)膽固醇、甘油三酯、hdl-c、ldl－c。經(jīng)心臟取血，用spa-4型血小板儀測(cè)血小板聚集率和聚集時(shí)間；用lindg-100血流變學(xué)測(cè)檢儀測(cè)全血粘度和血漿粘度。兔處死后，取肝臟稱重，肉眼觀察壞死程度；取肝300mg，研磨后采用chod－pap法測(cè)肝總膽固醇和甘油三酯含量。剝?nèi)≈鲃?dòng)脈，自心臟和主動(dòng)脈弓接合部至髂動(dòng)脈分叉處，剔除主動(dòng)脈外膜脂肪組織，縱面剖開(kāi)，用福爾馬林固定，蘇丹ⅲ染色，測(cè)量主動(dòng)脈面積和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，結(jié)果用百分比表示；每組各取主動(dòng)脈和肝臟作病理切片檢查。

1.4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，用studentt檢驗(yàn)比較組間均數(shù)差異。

結(jié)果

2.1.甘油三酯分別下降40％，33％和27％。低密度脂蛋白也明顯降低，以高劑量組最為顯著，下降76％，p<0.001；結(jié)果見(jiàn)表1（給藥后）。說(shuō)明降脂效果十分顯著。

表1人血hdl對(duì)動(dòng)物粥樣硬化兔血總膽固醇、甘油三酯、hdl-c、ldl-c的影響（mol/l,x±sd）

與模型組比較*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

肉眼觀察模型組主動(dòng)脈表面均有明顯的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，占主動(dòng)脈面積的79.09±21.277%，經(jīng)人血hdl治療后的高、中、低三個(gè)劑量組分別為21.48±12.94%，32.32±22.85%和53.01±16.76%，即治療后，斑塊明顯消退，與模型組比較，分別消退72.83%，59.14%和32.97%，結(jié)果見(jiàn)圖1和表2。結(jié)果表明人血hdl有明顯治療動(dòng)脈粥樣硬化作用。

2.2.病理組織學(xué)檢查模型組均為ⅳ級(jí)病變。hdl三個(gè)劑量組均有不同程度的逆轉(zhuǎn)，其中以高劑量組治療效果最明顯，已恢復(fù)到1級(jí)病變。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3.經(jīng)人血hdl治療后，肝臟損傷有不同程度減輕，表現(xiàn)在肝系數(shù)和肝壞死程度明顯降低，結(jié)果見(jiàn)表3。

肝臟甘油三酯明顯降低，與模型組比較，差異顯著，高、中、低三個(gè)劑量組分別為p<0.001、p<0.01、p<0.01，肝總膽固醇含量也有不同程度降低，高、中、低三個(gè)劑量組與模型組比較p<0.01、p<0.01和p<0.05，甘油三酯也均有明顯下降。結(jié)果見(jiàn)表4。病理組織學(xué)檢查表明經(jīng)人血hdl治療后與模型組比較脂肪肝均有不同程度減輕。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4.經(jīng)人血hdl治療后兔血小板聚集率有不同程度降低，其中高劑量組作用明顯，結(jié)果見(jiàn)表5。人血hdl對(duì)血小板聚集時(shí)間無(wú)明顯影響。

2.5.經(jīng)人血hdl治療后，兔全血粘度和血漿粘度明顯下降，結(jié)果見(jiàn)表6。

結(jié)論：

高脂血癥是指血漿中膽固醇和/或甘油三酯水平升高，是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素，是形成動(dòng)脈粥樣硬化的物質(zhì)基礎(chǔ)。上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，富含載脂蛋白a的人血高密度脂蛋白制劑（hdl）能較大幅度地降低總膽固醇和甘油三酯的水平，同時(shí)對(duì)于血小板聚集率和血液粘度等動(dòng)脈粥樣硬化影響因素都有較顯著的降低作用，結(jié)合本發(fā)明用人血hdl制劑對(duì)預(yù)防大鼠高脂血癥的研究結(jié)果，說(shuō)明hdl制劑作為降低血脂藥物有良好的應(yīng)用前景。

赫爾辛基的manninan等強(qiáng)調(diào)“l(fā)dl/hdl是冠心?。╟hd）危險(xiǎn)性的最好預(yù)告指標(biāo)，tg>200mg/d1、ldl/hdl>5者危險(xiǎn)性最大”，從表1可見(jiàn)，hdl制劑的應(yīng)用對(duì)升高h(yuǎn)dl的作用并不顯著，而對(duì)降低ldl和ldl/hdl比值的作用卻是十分顯著的。恰ldl水平和ldl/hdl是chd的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素，說(shuō)明hdl制劑對(duì)chd發(fā)生的關(guān)鍵因素具有顯著影響。

從表3、表4的數(shù)據(jù)和圖3的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變可見(jiàn)，hdl制劑對(duì)于由脂質(zhì)代謝紊亂所造成的肝重系數(shù)，肝壞死程度，肝總膽固醇、肝甘油三酯以及肝細(xì)胞脂肪變性等皆有良好的治療作用。此方面的研究發(fā)現(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)，其意義顯然是十分重要的。

由圖1和圖2所見(jiàn)結(jié)合動(dòng)脈粥樣硬化面積減少的測(cè)算，可見(jiàn)hdl制劑可清除as的面積達(dá)72％以上，動(dòng)脈粥樣硬化的病理學(xué)改變可從ⅲ級(jí)變?yōu)棰〖?jí)，說(shuō)明hdl制劑作為一種治療動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病等病癥的藥物具有十分良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。