技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于膽汁淤積藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用雷公藤紅素作為治療膽汁淤積性肝病的藥物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
：

膽汁淤積發(fā)生的最根本原因是肝細(xì)胞內(nèi)積聚的毒性膽汁酸，是一種肝內(nèi)的紊亂現(xiàn)象。膽汁淤積可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化、肝功能衰竭、甚至死亡。膽汁淤積分為肝外膽汁淤積及肝內(nèi)膽汁淤積兩種：肝外膽汁淤積由膽管腫瘤、囊腫、膽管結(jié)石等疾病引起；肝內(nèi)膽汁淤積由敗血癥、藥物、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化膽道炎、病毒性肝炎、酒精肝、及妊娠等引起；此外，也存在許多遺傳引起的進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積(pfic)。‐到目前為止，熊去氧膽酸(udca)和奧貝膽酸是美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)認(rèn)證的僅有的兩種治療膽汁淤積性肝病的藥物。udca可有效治療i期及ii期原發(fā)性膽汁性肝硬化(pbc)，但udca對原發(fā)性硬化性膽道炎(psc)的治療效果不佳，且許多病人對udca長期單一療法存在耐受性，因此其使用仍存在爭議。奧貝膽酸是2016年fda批準(zhǔn)的治療膽汁淤積性肝病的藥物，該藥的副作用還未完全被人們了解，目前臨床觀察，奧貝膽酸最常見的副作用包括皮膚瘙癢和疲勞。目前，臨床上大量患者因膽汁淤積性肝病急需藥物治療，但已上市的保肝藥物極少或療效不可靠，數(shù)以萬計(jì)的膽汁淤積性肝病患者不能得到有效的藥物治療；肝臟移植可以顯著提高病人的存活率，但是這種移植手術(shù)的安全性在很大程度上取決于患者殘余肝臟的再生能力，只適合患有晚期肝病或急性肝衰竭的病人，因此研發(fā)治療膽汁淤積性肝病藥物迫在眉睫。

中藥雷公藤為衛(wèi)矛科植物雷公藤的根，又名黃藤、黃臘藤、菜蟲藥、紅藥、及水莽草，主產(chǎn)于福建、安徽、浙江、河南等地，中醫(yī)用于治療關(guān)節(jié)炎、麻風(fēng)病、濕疹、肺結(jié)核等疾病。雷公藤紅素(又名南蛇藤素)作為中藥雷公藤中重要的三萜類活性成分，廣泛存在于衛(wèi)矛科植物雷公藤、南蛇藤、及獨(dú)子藤等中。雷公藤紅素在抗炎、免疫抑制、抗腫瘤、抗神經(jīng)退行性疾病以及減肥等研究中展示出良好的生物活性，具有廣闊的開發(fā)前景。但是將雷公藤紅素用于治療膽汁淤積性肝病的應(yīng)用，至今未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的局限，對雷公藤紅素針對膽汁淤積性肝病的保護(hù)作用效果進(jìn)行研究，明確雷公藤紅素對膽汁淤積性肝病的保護(hù)作用。同時(shí)，為傳統(tǒng)的衛(wèi)矛科雷公藤屬雷公藤提取物雷公藤紅素拓展新的應(yīng)用領(lǐng)域，本發(fā)明將雷公藤紅素應(yīng)用于膽汁淤積性肝病的治療，具有明顯效果。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

雷公藤紅素在制備治療膽汁淤積性肝病的藥物中的應(yīng)用。

如所述的應(yīng)用，其中所述的膽汁淤積性肝病為化學(xué)性膽汁淤積性肝病或藥物性膽汁淤積性肝病或原發(fā)性膽汁淤積性肝病。

如所述的應(yīng)用，其中所述的膽汁淤積性肝病是由體內(nèi)雌激素過高引起的。

如所述的應(yīng)用，其中所述的治療膽汁淤積性肝病的藥物的給藥方式為口服，對應(yīng)相應(yīng)患者的體重，其用量為1.1mg/kg·d，使用對象為膽汁淤積性肝病患者。

所述雷公藤紅素提取于衛(wèi)矛科雷公藤屬雷公藤，生產(chǎn)廠家為成都瑞芬思生物科技有限公司，結(jié)構(gòu)式為：

其治療膽汁淤積的作用機(jī)制為：雷公藤紅素通過調(diào)節(jié)膽酸的合成基因如cyp7a1、cyp8b1減少體內(nèi)膽汁酸的形成，從源頭抑制膽酸進(jìn)一步合成。還可通過cyp3a4、sult2a1、ugt2b4、ugt2b7等基因促進(jìn)膽酸脫毒，降低有害膽酸含量。此外，雷公藤紅素可能抑制膽酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體(如ntcp、oatp1、oatp4)的表達(dá)，降低進(jìn)入肝臟的膽酸；增加膽酸流出轉(zhuǎn)運(yùn)體(如ostβ、mrp4、bsep、mrp2)的表達(dá)，促進(jìn)膽酸排泄，從而達(dá)到治療膽汁淤積性肝病的作用。

使用要求：給藥方式為口服，對應(yīng)相應(yīng)患者的體重，其用量為1.1mg/kg·d。

使用對象：膽汁淤積性肝病患者。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明通過anit及taa誘導(dǎo)的小鼠膽汁淤積性肝損傷模型，研究并證實(shí)了雷公藤紅素可用于治療膽汁淤積性肝損傷，能顯著降低血漿中各種膽汁酸成分，從而顯著降低由膽汁淤積引起的肝損傷、肝臟壞死，顯著抑制由膽汁淤積引起的炎癥，對膽汁淤積有顯著的療效。

附圖說明：

圖1：空白組小鼠肝臟組織切片圖；

圖2：taa模型小鼠肝臟病理切片圖；

圖3：雷公藤紅素治療taa誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝病病理切片圖。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合本發(fā)明的具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，但并不以此來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：

雷公藤紅素對anit誘導(dǎo)的小鼠膽汁淤積性肝病的治療作用：

動物：c57bl/6小鼠，spf級，37～40日齡，體重20～23g，雄性；合格證號均為：scxk(湘)2013‐0004，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

藥品與試劑：雷公藤紅素，紅色無定型結(jié)晶粉末，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號l‐003‐150420。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)試劑盒(貨號c010‐3，批號20161031)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)試劑盒(貨號c009‐3，批號20161031)、及堿性磷酸酶(alp)試劑盒(貨號a059‐3，批號20161031)，均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。α‐萘異硫氰酸苯酯(anit，貨號n4525‐10g，批號101734146)、dmso(貨號v900090‐500ml，批號101669350)、吐溫80(貨號p1754‐500ml，批號101761909)均購自sigma公司。玉米油(貨號c116025‐500g，批號l1524089)購自阿拉丁公司。

主要儀器：精密電子天平，sartorius公司；全自動酶標(biāo)儀，biotekinstruments公司；水浴恒溫振蕩器sha‐c，常州中誠儀器制造有限公司；冷凍離心機(jī)，eppendorf公司。

實(shí)驗(yàn)方法：

實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)共需18只雄性c57bl/6小鼠，分為三組：空白組(n＝6)；造模組(n＝6)；治療組(雷公藤紅素+anit，n＝6)。

藥物溶解及劑量：雷公藤紅素采用1％dmso、2％吐溫80、及97％水(v：v：v)溶解，灌胃給藥，給藥劑量10mg/kg·d，給藥容積為5μl/g·d。anit采用玉米油溶解，灌胃給藥，給藥劑量75mg/kg·d，給藥容積為5μl/g·d。

實(shí)驗(yàn)流程：治療組雷公藤紅素采用灌胃給藥，給藥劑量為10mg/kg·d，連續(xù)給藥五天；空白組及造模組喂以等劑量1％dmso、2％吐溫、及97％水，連續(xù)給藥五天。在實(shí)驗(yàn)第三天，造模組及治療組在雷公藤紅素處理4h后進(jìn)行anit造模，空白組喂以等劑量玉米油。anit處理48h后，小鼠co2麻醉處死。小鼠摘眼球取血，血漿樣品于冰上放置1‐2h后，在4℃下4000g離心5min，取上清血漿樣品，測定血漿生化指標(biāo)ast、alt、及alp水平。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表1結(jié)果顯示，空白組、模型組及治療組3組小鼠體重均勻，無顯著差異。但模型組小鼠處死時(shí)肝重(1.22g)顯著高于空白組(1.00g)，且模型組小鼠肝重/體重(5.78％)顯著高于空白組(4.56％)，表明anit模型組肝損傷嚴(yán)重。治療組小鼠處死時(shí)肝重(1.01g)顯著低于模型組(1.22g)，與空白組間無顯著性差異；且治療組小鼠肝重/體重(4.66％)顯著低于模型組(5.78％)，與空白組間無顯著性差異，表明雷公藤紅素對anit誘導(dǎo)的膽汁淤積模型有顯著的治療作用，可顯著降低治療組肝重、及肝重/體重。

表1雷公藤紅素治療小鼠anit誘導(dǎo)的膽汁淤積體重及肝重變化

模型組與空白組相比：^##p<0.01；治療組與模型組相比^**p<0.01。

表2結(jié)果顯示，模型組血漿中ast、alt、及alp水平均顯著高于空白組(p<0.01)，表明模型組肝部損傷嚴(yán)重。治療組ast、alt、及alp水平均較模型組顯著降低(p<0.01)，與空白組相比均無顯著性差異，表明雷公藤紅素對anit誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝病的顯著的治療作用，可顯著降低治療組ast、alt、及alp水平。

表2雷公藤紅素治療小鼠anit誘導(dǎo)的膽汁淤積血漿ast、alt、及alp變化

模型組與空白組相比：^##p<0.01；治療組與模型組相比^**p<0.01。

實(shí)施例2：

雷公藤紅素對taa誘導(dǎo)的小鼠膽汁淤積性肝病的治療作用：

動物：c57bl/6小鼠，spf級，37～40日齡，體重20～23g，雄性；合格證號均為：scxk(湘)2013‐0004，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

藥品與試劑：雷公藤紅素，紅色無定型結(jié)晶粉末，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號l‐003‐150420。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ast)試劑盒(貨號c010‐3，批號20161031)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alt)試劑盒(貨號c009‐3，批號20161031)、及堿性磷酸酶(alp)試劑盒(貨號a059‐3，批號20161031)，均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。硫代乙酰胺(taa，貨號c1290‐25g，批號1002213299)、dmso(貨號v900090‐500ml，批號101669350)、吐溫80(貨號p1754‐500ml，批號101761909)、甲酸(貨號94318‐250ml‐f，批號101721592)、氯磺丙脲(貨號c1290‐25g，批號1002213299)、膽酸(ca，貨號c1129‐25g)、熊脫氧膽酸(udca，貨號u5127‐1g)、豬脫氧膽酸(hdca，貨號u5127‐1g)、鵝脫氧膽酸(cdca，貨號c9377‐5g)、脫氧膽酸(dca，貨號d2510‐10g)、?；悄懰?tca，貨號t4009‐1g)、甘氨膽酸(gca，貨號g2878‐500mg)、?；秦i脫氧膽酸(thdca，貨號t0682‐250mg)、?；蛆Z脫氧膽酸(tcdca，貨號t6260‐25mg)、?；敲撗跄懰?tdca，貨號t0875‐1g)、?；鞘懰?tlca，貨號t7515‐100mg)購自sigma公司。色譜級乙腈(貨號1.00030.4008)購自默克。nacl注射液(批號b16080e1)購自浙江國鏡藥業(yè)有限公司。ω‐鼠膽酸(ω‐mca，貨號sc‐396738)、?；签\β‐鼠膽酸(t‐β‐mca，貨號sc‐361829)購自santacruz公司。?；切苊撗跄懰?tudca，貨號hy‐19696a)購自mce公司。β‐鼠膽酸(β‐mca，貨號c008852)、?；签\α‐鼠膽酸(t‐α‐mca，貨號c1893‐000)購自steraloids公司。

主要儀器：精密電子天平，sartorius公司；全自動酶標(biāo)儀，biotekinstruments公司；水浴恒溫振蕩器sha‐c，常州中誠儀器制造有限公司；冷凍離心機(jī)，eppendorf公司；超高效液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜，包含1290進(jìn)樣器、1290泵、柱溫箱、xdb‐c18色譜柱(2.1×100mm,1.8μm)、及6530四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜，agilent公司。

實(shí)驗(yàn)方法：

實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)共需18只雄性c57bl/6小鼠，分為三組：空白組(n＝6)；模型組(n＝6)；治療組(雷公藤紅素+taa，n＝6)。

藥物溶解及劑量：雷公藤紅素采用1％dmso、2％吐溫、及97％水(v：v：v)溶解，灌胃給藥，給藥劑量10mg/kg·d，給藥容積為5μl/g·d。taa采用0.9％nacl溶解，腹腔注射給藥，給藥劑量300mg/kg，給藥容積為5μl/g·d。

實(shí)驗(yàn)流程：治療組采用灌胃給藥，給藥劑量為10mg/kg·d，連續(xù)給藥4天；空白組及模型組喂以等劑量1％dmso、2％吐溫、及97％水。taa造模在第4天，在雷公藤紅素處理1h后腹腔注射taa300mg/kg，taa處理24h后co2麻醉處死。小鼠摘眼球取血，血漿樣品于冰上放置1‐2h后，在4℃下4000g離心5min，取上清血漿樣品，測定血漿生化指標(biāo)alt、ast、及alp水平。同時(shí)，制備液質(zhì)血樣處理液：取10μl血漿樣品，與190μl67％的乙腈(含內(nèi)標(biāo)氯磺丙脲5μm)混合，在4℃下18000g離心20min，取上清進(jìn)樣。液相條件如下：進(jìn)樣體積5μl；柱溫45℃；流動相流速0.3ml/min；洗脫梯度：在16min的運(yùn)行時(shí)間內(nèi)，乙腈濃度由5％變至95％，流動相(水及乙腈)均含0.01％的甲酸。質(zhì)譜條件如下：干燥氣溫度350℃，噴霧器壓力35psi，毛細(xì)管電壓3.5kv。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

表3結(jié)果顯示，空白組、模型組及治療組3組小鼠體重均勻，無顯著差異。但模型組小鼠處死時(shí)肝重(1.54g)顯著高于空白組(1.18g)，且模型組小鼠肝重/體重(6.37％)顯著高于空白組(4.92％)，表明taa模型組肝損傷嚴(yán)重。治療組小鼠處死時(shí)肝重(1.55g)與造模組間無顯著性差異；且治療組小鼠肝重/體重(6.48％)與造模組間無顯著性差異，表明雷公藤紅素對taa模型的治療作用對小鼠肝重影響不大。

表3雷公藤紅素治療小鼠taa誘導(dǎo)的膽汁淤積體重及肝重變化

模型組與空白組相比：^##p<0.01。

表4結(jié)果顯示，模型組血漿ast、alt、及alp水平均顯著高于空白組(p<0.05)，表明模型組嚴(yán)重的肝損傷。治療組ast、alt、及alp水平均較模型組降低(p<0.01)，表明雷公藤紅素對taa誘導(dǎo)的膽汁淤積的治療作用，可顯著降低治療組血漿中ast、alt、及alp水平。

表4雷公藤紅素治療小鼠taa誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝病血漿ast、alt、及alp變化

模型組與空白組相比：^#p<0.05，^##p<0.01；治療組與模型組相比^**p<0.01。

表5結(jié)果顯示，模型組血漿中多種膽酸水平均顯著高于空白組(p<0.01)，如ω‐mca、β‐mca、t‐β‐mca/t‐α‐mca、tca、thdca/tudca、tcdca、tdca、及血漿總膽酸水平，表明模型組嚴(yán)重的肝損傷，造成肝臟膽汁淤積。治療組多種膽酸水平均較模型組降低(p<0.01)，如t‐β‐mca/t‐α‐mca、tca、thdca/tudca、tcdca、tdca、及總膽酸水平，表明雷公藤紅素對taa誘導(dǎo)的膽汁淤積的治療作用，顯著降低了治療組血漿中多種膽酸及總膽酸的含量。

表5雷公藤紅素治療小鼠taa誘導(dǎo)的膽汁淤積血漿中膽酸變化

模型組與空白組相比：^#p<0.05，^##p<0.01；治療組與模型組相比^*p<0.05，^**p<0.01。