本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)藥偶聯(lián)物及其制備方法并應(yīng)用，特別是涉及一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物及其制備方法并應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胰島素是臨床治療糖尿病的首選藥物，以皮下注射為主。頻繁地注射胰島素不僅給患者帶來極大痛苦，還可能導(dǎo)致皮下脂肪萎縮、外周高胰島素引起的高血壓和動脈粥樣硬化等。口服胰島素是一種理想的給藥方式，不僅患者順應(yīng)性好，而且模仿胰島素的生理途徑，減少副作用產(chǎn)生。然而，一般情況下由于藥物的分子尺寸較大以及化學(xué)穩(wěn)定性較差導(dǎo)致直接口服胰島素的生物利用度很低。

目前，關(guān)于改善胰島素口服吸收的研究有很多，包括將胰島素裝載入納米載體（eur.j.pharm.biopharm.2009,73:25-33.）或互穿式水凝膠（biomaterials.2010,31:3347-56），或者用腸溶材料包衣（biomaterials.2010,31:3384-94.），以及聯(lián)合酶抑制劑（biomaterials.2012,33:2801-11.）等。理論上，這些策略可以減少藥物被消化酶降解，打開腸道上皮細(xì)胞的緊密連接，大大促進(jìn)藥物的跨膜吸收。然而事實上，胰島素的口服生物利用度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到理想程度。最主要的問題還是出在藥物的跨膜吸收與遞送這一步，如何高效安全地促進(jìn)藥物的跨膜轉(zhuǎn)運成為研究的重點。

細(xì)胞穿膜肽（cell-penetratingpeptides,cpps）是一類能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的短肽，為大分子藥物跨膜吸收提供了一條新途徑。其穿膜作用不依賴經(jīng)典的胞吞作用，具有細(xì)胞膜親和性高、穿膜速度快、可迅速被降解等優(yōu)勢。此外，它們有一些共性：具有靜正電荷和兩親性；具有很強(qiáng)的跨膜轉(zhuǎn)運能力，能夠攜帶比其相對分子質(zhì)量大100倍的外源性大分子進(jìn)入細(xì)胞；可以攜帶多種活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)入近乎所有的細(xì)胞；可以通過固相合成或原核表達(dá)制備，方法成熟簡便。由于細(xì)胞穿膜肽具有很強(qiáng)的跨膜轉(zhuǎn)運能力，無刺激性，并且在一定濃度范圍內(nèi)對宿主細(xì)胞無毒害作用，因此作為一種新型的藥物遞送工具受到越來越多的關(guān)注。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物及其制備方法并應(yīng)用，本發(fā)明用二甲基馬來酸酐（dmma）對cpps上的氨基進(jìn)行保護(hù)，使其巰基與交聯(lián)劑的mal基團(tuán)反應(yīng)，然后nhs基團(tuán)再與ins上的氨基反應(yīng)，最后脫氨基保護(hù)得偶聯(lián)物。整個合成過程簡單易行，不涉及劇烈條件，對于蛋白藥物活性保留十分有利。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)如下所示：

其中，n為15～220；ins代表胰島素分子；cpps代表細(xì)胞穿膜肽分子。

所述的一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物，所述細(xì)胞穿膜肽為穿膜肽tat（序列g(shù)rkkrrqrrrppqc）、多聚精氨酸r8（序列rrrrrrrrc）、穿膜素penetratin（序列rqikiwfqnrrmkwkkc）和低分子量魚精蛋白lmwp（序列vsrrrrrrggrrrrc）中的一種或幾種（端基均為半胱氨酸）。

所述的一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物，所述胰島素和細(xì)胞穿膜肽是通過交聯(lián)劑nhs-peg-mal完成的偶聯(lián)。

所述的一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物，所述交聯(lián)劑nhs-peg-mal中peg分子量為1000～10000。

一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物制備方法，所述方法包括以下過程：

（1）將cpps與二甲基馬來酸酐（dmma）反應(yīng)，以保護(hù)cpps上的氨基，暴露巰基；

（2）將氨基保護(hù)的cpps與交聯(lián)劑nhs-peg-mal發(fā)生反應(yīng)，生成nhs-peg-cpps；

（3）將nhs-peg-cpps與胰島素發(fā)生反應(yīng)，脫氨基保護(hù)，得到細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物。

所述的一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物制備方法，所述方法具體步驟如下：

（1）將cpps溶于ph8.5的pbs溶液中，加入dmma，室溫下反應(yīng)2～4h，優(yōu)選3h；然后采用透析法除去未反應(yīng)的dmma，得到溶液a；dmma與cpps的摩爾比為20～100:1，優(yōu)選為40～60:1；

（2）向溶液a中加入交聯(lián)劑nhs-peg-mal，室溫孵育0.5～2h，優(yōu)選1h，使cpps分子上的巰基與mal發(fā)生反應(yīng)，得到nhs-peg-cpps；cpps與nhs-peg-mal的摩爾比為1：1～10，優(yōu)選為1:5；

（3）將胰島素溶于ph7.4的pbs溶液中，滴加入nhs-peg-cpps中，室溫孵育1～2h，使胰島素的氨基與nhs基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，然后將反應(yīng)物在37℃，ph5.5條件下脫掉dmma，透析，凍干，得到偶聯(lián)物；胰島素與nhs-peg-cpps的摩爾比為1:1～10，優(yōu)選為1:5。

所述的一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物制備方法，所述步驟（1）和（3）中的透析是在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中室溫條件下進(jìn)行，透析時間為24～48h。

所述的一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物制備方法，所述步驟（3）的凍干起始溫度在零下40℃。

一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物的應(yīng)用，所述細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物應(yīng)用于治療糖尿病。

本發(fā)明的優(yōu)點與效果是：

本發(fā)明細(xì)胞穿膜肽是穿膜肽tat（序列g(shù)rkkrrqrrrppqc），多聚精氨酸r8（序列rrrrrrrrc），穿膜素penetratin（序列rqikiwfqnrrmkwkkc）和低分子量魚精蛋白lmwp（序列vsrrrrrrggrrrrc）中的一種或幾種。本發(fā)明穿膜肽是通過固相合成的方法得到，在每種穿膜肽的端基修飾半胱氨酸（c）以提供巰基，然后通過交聯(lián)劑nhs-peg-mal（peg分子量1000～10000da）將insulin（ins）與cpps進(jìn)行偶聯(lián)。由于穿膜肽和胰島素分子中均有氨基和巰基，交聯(lián)劑的兩端與兩種物質(zhì)都能進(jìn)行反應(yīng)，如果直接混合，反應(yīng)位點多，產(chǎn)物較雜。在本發(fā)明中，首先用二甲基馬來酸酐（dmma）對cpps上的氨基進(jìn)行保護(hù)，使其巰基與交聯(lián)劑的mal基團(tuán)反應(yīng)，然后nhs基團(tuán)再與ins上的氨基反應(yīng)，最后脫氨基保護(hù)，即得偶聯(lián)物。整個合成過程簡單易行，不涉及劇烈條件，對于蛋白藥物活性保留十分有利。

本發(fā)明通過細(xì)胞穿膜肽介導(dǎo)可以大大提高胰島素的跨膜吸收和轉(zhuǎn)運，為解決現(xiàn)有口服胰島素制劑吸收效率低的問題提供了可能的辦法。本發(fā)明提供的偶聯(lián)物的合成方法簡單，條件溫和，所用試劑無毒無害，對蛋白藥物的活性保留十分有利，也為后續(xù)的藥效學(xué)實驗打下了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備的細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物的合成路線圖；

圖2為本發(fā)明制備的細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物用于大鼠回腸給藥降血糖試驗。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

本發(fā)明提供了一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)如下所示：

其中，n為15～220；ins代表胰島素分子；cpps代表細(xì)胞穿膜肽分子。

優(yōu)選地，所述的細(xì)胞穿膜肽為穿膜肽tat（序列g(shù)rkkrrqrrrppqc），多聚精氨酸r8（序列rrrrrrrrc），穿膜素penetratin（序列rqikiwfqnrrmkwkkc）和低分子量魚精蛋白lmwp（序列vsrrrrrrggrrrrc）中的一種或幾種（端基均為半胱氨酸）。

本發(fā)明所述的藥物胰島素和細(xì)胞穿膜肽是通過交聯(lián)劑nhs-peg-mal完成的偶聯(lián)。

優(yōu)選地，其中nhs-peg-mal中peg分子量為1000～10000。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物的制備方法，包括以下步驟：

（1）將cpps與二甲基馬來酸酐（dmma）反應(yīng)，以保護(hù)cpps上的氨基，暴露巰基；

（2）將氨基保護(hù)的cpps與交聯(lián)劑nhs-peg-mal發(fā)生反應(yīng)，生成nhs-peg-cpps；

（3）將nhs-peg-cpps與胰島素發(fā)生反應(yīng)，脫氨基保護(hù)，得到細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物。

優(yōu)選地，所述的細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物的制備方法，具體包括以下步驟：

（1）將適量的cpps溶于ph8.5的pbs溶液中，加入dmma，室溫下反應(yīng)2～4h；然后采用透析法除去未反應(yīng)的dmma，得到溶液a；所述的dmma與cpps的摩爾比為20～100:1；

（2）向溶液a中加入適量交聯(lián)劑nhs-peg-mal，室溫孵育0.5～2h，使cpps分子上的巰基與mal發(fā)生反應(yīng)，得到nhs-peg-cpps；所述的cpps與nhs-peg-mal的摩爾比為1：1～10；

（3）將適量胰島素溶于ph7.4的pbs溶液中，滴加入nhs-peg-cpps中，室溫孵育1～2h，使胰島素的氨基與nhs基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，然后將反應(yīng)物在37℃，ph5.5條件下脫掉dmma，透析，凍干，得到偶聯(lián)物。所述的胰島素與nhs-peg-cpps的摩爾比為1:1～10。

優(yōu)選地，步驟（1）所述的室溫下反應(yīng)時間為3h。

優(yōu)選地，步驟（1）所述的dmma與cpps的摩爾比為40～60:1。

優(yōu)選地，步驟（2）所述的室溫孵育時間為1h。

優(yōu)選地，步驟（2）所述的cpps與nhs-peg-mal的摩爾比為1:5。

優(yōu)選地，步驟（3）所述的胰島素與nhs-peg-cpps的摩爾比為1:5。

優(yōu)選地，所述的步驟（1）和（3）中的透析是在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中室溫條件下進(jìn)行,透析時間為24～48h；

優(yōu)選地，步驟（3）所述的凍干起始溫度在零下40℃。

按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物的應(yīng)用，應(yīng)用于治療糖尿病。

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明的各個實施方式所涉及的技術(shù)特征只要彼此間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

本發(fā)明供了一種細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)如下所示：

其中，n為15～220；ins代表胰島素分子；cpps代表細(xì)胞穿膜肽分子。

該偶聯(lián)物結(jié)構(gòu)中包括胰島素，細(xì)胞穿膜肽和交聯(lián)劑。其中細(xì)胞穿膜肽為穿膜肽tat（序列g(shù)rkkrrqrrrppqc），多聚精氨酸r8（序列rrrrrrrrc），穿膜素penetratin（序列rqikiwfqnrrmkwkkc）和低分子量魚精蛋白lmwp（序列vsrrrrrrggrrrrc）中的一種或幾種，交聯(lián)劑為nhs-peg-mal，其中peg分子量為1000～10000。

按照圖1所示，細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物的制備方法，包括以下步驟：

（1）將cpps與二甲基馬來酸酐（dmma）反應(yīng)，以保護(hù)cpps上的氨基，暴露巰基；

（2）將氨基保護(hù)的cpps與交聯(lián)劑nhs-peg-mal發(fā)生反應(yīng)，生成nhs-peg-cpps；

（3）將nhs-peg-cpps與胰島素發(fā)生反應(yīng)，脫氨基保護(hù)，得到細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物。

本發(fā)明通過對cpps的氨基進(jìn)行保護(hù)，減少了cpps與nhs基團(tuán)反應(yīng)的概率，進(jìn)而減少了副產(chǎn)物的生成，提高了交聯(lián)反應(yīng)的效率和目標(biāo)產(chǎn)物的含量。

以下各實施例中所用原料均為從市場上購得，細(xì)胞穿膜肽為委托合成。

實施例1

按照如下步驟制備細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物：

（1）將10mg的穿膜肽tat（序列g(shù)rkkrrqrrrppqc）溶于1mlph8.5的pbs溶液中，加入35mg的dmma，室溫下反應(yīng)3h；然后在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，除去未反應(yīng)的dmma，得到溶液a；

（2）向溶液a中加入65mg的交聯(lián)劑nhs-peg-mal（其中peg分子量為2000），室溫孵育2h，使cpps分子上的巰基與mal發(fā)生反應(yīng)，得到nhs-peg-cpps；

（3）取胰島素8mg溶于1ml的ph7.4的pbs溶液中，滴加入nhs-peg-cpps中，室溫孵育1h，使胰島素的氨基與nhs基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，然后將反應(yīng)物在37℃，ph5.5條件下脫掉dmma，在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，凍干，得到偶聯(lián)物ins-peg2000-tat。

實施例2

按照如下步驟制備細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物：

（1）將10mg的穿膜肽tat（序列g(shù)rkkrrqrrrppqc）溶于1mlph8.5的pbs溶液中，加入40mg的dmma，室溫下反應(yīng)3h；然后在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，除去未反應(yīng)的dmma，得到溶液a；

（2）向溶液a中加入140mg的交聯(lián)劑nhs-peg-mal（其中peg分子量為5000），室溫孵育2h，使cpps分子上的巰基與mal發(fā)生反應(yīng)，得到nhs-peg-cpps；

（3）取胰島素10mg溶于1ml的ph7.4的pbs溶液中，滴加入nhs-peg-cpps中，室溫孵育1h，使胰島素的氨基與nhs基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，然后將反應(yīng)物在37℃，ph5.5條件下脫掉dmma，在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，凍干，得到偶聯(lián)物ins-peg5000-tat。

實施例3

按照如下步驟制備細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物：

（1）將10mg的多聚精氨酸r8（序列rrrrrrrrc）溶于1mlph8.5的pbs溶液中，加入45mg的dmma，室溫下反應(yīng)3h；然后在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，除去未反應(yīng)的dmma，得到溶液a；

（2）向溶液a中加入84mg的交聯(lián)劑nhs-peg-mal（其中peg分子量為2000），室溫孵育2h，使cpps分子上的巰基與mal發(fā)生反應(yīng)，得到nhs-peg-cpps；

（3）取胰島素8mg溶于1ml的ph7.4的pbs溶液中，滴加入nhs-peg-cpps中，室溫孵育1h，使胰島素的氨基與nhs基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，然后將反應(yīng)物在37℃，ph5.5條件下脫掉dmma，在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，凍干，得到偶聯(lián)物ins-peg2000-r8。

實施例4

按照如下步驟制備細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物：

（1）將10mg的多聚精氨酸r8（序列rrrrrrrrc）溶于1mlph8.5的pbs溶液中，加入45mg的dmma，室溫下反應(yīng)3h；然后在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，除去未反應(yīng)的dmma，得到溶液a；

（2）向溶液a中加入193mg的交聯(lián)劑nhs-peg-mal（其中peg分子量為5000），室溫孵育2h，使cpps分子上的巰基與mal發(fā)生反應(yīng)，得到nhs-peg-cpps；

（3）取胰島素10mg溶于1ml的ph7.4的pbs溶液中，滴加入nhs-peg-cpps中，室溫孵育1h，使胰島素的氨基與nhs基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，然后將反應(yīng)物在37℃，ph5.5條件下脫掉dmma，在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，凍干，得到偶聯(lián)物ins-peg5000-r8。

實施例5

按照如下步驟制備細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物：

（1）將20mg的穿膜素penetratin（序列rqikiwfqnrrmkwkkc）溶于1mlph8.5的pbs溶液中，加入56mg的dmma，室溫下反應(yīng)3h；然后在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，除去未反應(yīng)的dmma，得到溶液a；

（2）向溶液a中加入102mg的交聯(lián)劑nhs-peg-mal（其中peg分子量為2000），室溫孵育2h，使cpps分子上的巰基與mal發(fā)生反應(yīng)，得到nhs-peg-cpps；

（3）取胰島素10mg溶于1ml的ph7.4的pbs溶液中，滴加入nhs-peg-cpps中，室溫孵育1h，使胰島素的氨基與nhs基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，然后將反應(yīng)物在37℃，ph5.5條件下脫掉dmma，在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，凍干，得到偶聯(lián)物ins-peg2000-penetratin。

實施例6

按照如下步驟制備細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物：

（1）將20mg的穿膜素penetratin（序列rqikiwfqnrrmkwkkc）溶于1mlph8.5的pbs溶液中，加入56mg的dmma，室溫下反應(yīng)3h；然后在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，除去未反應(yīng)的dmma，得到溶液a；

（2）向溶液a中加入235mg的交聯(lián)劑nhs-peg-mal（其中peg分子量為5000），室溫孵育2h，使cpps分子上的巰基與mal發(fā)生反應(yīng)，得到nhs-peg-cpps；

（3）取胰島素10mg溶于1ml的ph7.4的pbs溶液中，滴加入nhs-peg-cpps中，室溫孵育1h，使胰島素的氨基與nhs基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，然后將反應(yīng)物在37℃，ph5.5條件下脫掉dmma，在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，凍干，得到偶聯(lián)物ins-peg5000-penetratin。

實施例7

按照如下步驟制備細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物：

（1）將15mg的低分子量魚精蛋白lmwp（序列vsrrrrrrggrrrrc）溶于1mlph8.5的pbs溶液中，加入48mg的dmma，室溫下反應(yīng)3h；然后在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，除去未反應(yīng)的dmma，得到溶液a；

（2）向溶液a中加入87mg的交聯(lián)劑nhs-peg-mal（其中peg分子量為2000），室溫孵育2h，使cpps分子上的巰基與mal發(fā)生反應(yīng)，得到nhs-peg-cpps；

（3）取胰島素10mg溶于1ml的ph7.4的pbs溶液中，滴加入nhs-peg-cpps中，室溫孵育1h，使胰島素的氨基與nhs基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，然后將反應(yīng)物在37℃，ph5.5條件下脫掉dmma，在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，凍干，得到偶聯(lián)物ins-peg2000-lmwp。

實施例8

按照如下步驟制備細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物：

（1）將15mg的低分子量魚精蛋白lmwp（序列vsrrrrrrggrrrrc）溶于1mlph8.5的pbs溶液中，加入48mg的dmma，室溫下反應(yīng)3h；然后在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，除去未反應(yīng)的dmma，得到溶液a；

（2）向溶液a中加入200mg的交聯(lián)劑nhs-peg-mal（其中peg分子量為2000），室溫孵育2h，使cpps分子上的巰基與mal發(fā)生反應(yīng)，得到nhs-peg-cpps；

（3）取胰島素10mg溶于1ml的ph7.4的pbs溶液中，滴加入nhs-peg-cpps中，室溫孵育1h，使胰島素的氨基與nhs基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，然后將反應(yīng)物在37℃，ph5.5條件下脫掉dmma，在室溫下在2%（m/v）的氯化鈉溶液（含20mm的edta）中透析48h，凍干，得到偶聯(lián)物ins-peg5000-lmwp。

實施例9

正常大鼠回腸給藥降血糖試驗

取sd大鼠（體重180～220g），實驗前12小時禁食，隨機(jī)分組，每組5只。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，沿腹中線打開腹腔，取出10cm左右的回腸段，用37℃預(yù)熱的pbs清洗內(nèi)容物，然后兩端用線結(jié)扎成封閉腸環(huán)。待手術(shù)1h血糖水平平穩(wěn)后給藥，向腸環(huán)內(nèi)分別注入生理鹽水、胰島素pbs溶液（ph7.4）、細(xì)胞穿膜肽胰島素偶聯(lián)物（ins-peg2000-tat、ins-peg2000-r8、ins-peg2000-penetratin和ins-peg2000-lmwp）的pbs溶液，給藥劑量按胰島素計為50iu/kg。分別于給藥前和給藥后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8和10h大鼠尾靜脈取血，用血糖儀測定血糖值，觀察降血糖效果。另取大鼠5只皮下注射胰島素溶液（5iu/kg），按上述時間點采血測血糖，計算相對藥理生物利用度。

結(jié)果如圖2所示，給予胰島素溶液與生理鹽水組0～10h血糖水平?jīng)]有降低，反而升高，這主要是手術(shù)引起的動物應(yīng)激性反應(yīng)。皮下注射組胰島素降低程度最大，4h后血糖回升速度也最快。而給予四種穿膜肽胰島素偶聯(lián)物組的大鼠血糖水平在0～4h持續(xù)降低，4h后血糖水平緩慢升高。其中ins-peg2000-penetratin組效果最好，ins-peg2000-tat組次之，ins-peg2000-r8和ins-peg2000-lmwp組再次。經(jīng)計算，tat、r8、penetratin和lmwp組的相對藥理學(xué)生物利用度分別為9.6%、7.8%、10.9%和8.2%。藥效實驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的穿膜肽胰島素偶聯(lián)物腸道給藥后均可顯著地降低大鼠的血糖水平，這說明該偶聯(lián)物可以促進(jìn)胰島素的經(jīng)腸道吸收，提高藥物的口服生物利用度。