本發(fā)明涉及牙科種植體技術(shù)領(lǐng)域，具體來(lái)說，涉及一種用于長(zhǎng)期抗血小板藥物治療患者的特異性種植體及制作所述種植體表面的方法。

背景技術(shù)：

據(jù)最新資料統(tǒng)計(jì)我國(guó)心血管疾病患者約有2.9億，口服抗血小板藥物對(duì)于心血管疾病的預(yù)防與治療具有重要意義。牙列缺損、牙列缺失導(dǎo)致的美觀、咀嚼、語(yǔ)音、消化等功能的異常，迫使患者積極尋求口腔修復(fù)治療。越來(lái)越多的伴牙列缺失的中老年心血管病人為了提高生活質(zhì)量，選擇種植修復(fù)牙齒缺失。種植修復(fù)近年來(lái)由于諸多優(yōu)點(diǎn)如：對(duì)鄰牙損傷小、美觀逼真、形態(tài)功能類似天然牙等被廣泛用于修復(fù)牙列缺損。針對(duì)長(zhǎng)期口服抗血小板藥物患者的口腔種植外科手術(shù)是目前口腔頜面外科的一個(gè)難點(diǎn)，因?yàn)槠浯嬖谛g(shù)中術(shù)后不可控的出血風(fēng)險(xiǎn)，而且停用抗血小板藥物會(huì)有誘發(fā)心腦血管急癥的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)手術(shù)出血風(fēng)險(xiǎn)不同，將各種有創(chuàng)的操作和外科手術(shù)分為很高危、高危、中危、低危和很低危5類，其中認(rèn)為口腔外科手術(shù)為高危出血風(fēng)險(xiǎn)。

聚多巴胺涂層法是一種常見的材料表面功能化修飾的方法。由于操作簡(jiǎn)單，安全性高，便于相關(guān)基團(tuán)的接枝等優(yōu)點(diǎn)被廣泛作為生物材料的表面改性方法。利用多巴胺在堿性溶液中可以自聚合的特性，可以改善材料表面的親水性。形成的聚多巴胺涂層結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，細(xì)胞毒性低，具有良好的生物相容性。本課題組前期研究聚多巴胺涂層修飾細(xì)胞爬片基底對(duì)血小板的粘附活化影響，證明該種修飾方法安全可靠。

二磷酸腺苷是從血小板致密顆粒釋放出來(lái)的一種內(nèi)源性物質(zhì)，可以通過與血小板膜兩種adp受體結(jié)合，誘發(fā)血小板活化聚集。同時(shí)也是臨床上常用的抗血小板藥物氯吡格雷的作用靶點(diǎn)。纖維蛋白原可以與血小板膜受體gpiia/iiib相結(jié)合，導(dǎo)致血小板聚集。它是由aα、bβ、γ三對(duì)不同多肽鏈所組成，分子間以及分子內(nèi)部以二硫鍵相連。血小板受到材料刺激時(shí)，信號(hào)首先作用于血小板表面受體的胞內(nèi)部分，然后引起該受體的胞外區(qū)結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而結(jié)合纖維蛋白原。纖維蛋白原的另一端又結(jié)合臨近的血小板，導(dǎo)致血小板的聚集。纖維蛋白原與血小板的結(jié)合進(jìn)一步激活信號(hào)傳遞系統(tǒng)，等信號(hào)分子向細(xì)胞骨架募集，作用于細(xì)胞骨架，引起其重組裝，導(dǎo)致血小板激活聚集。

長(zhǎng)期抗血小板藥物治療患者能夠在種植修復(fù)牙齒的過程中，就面臨著高危出血風(fēng)險(xiǎn)，為了順利地種植修復(fù)牙齒，不得不選擇停止服用抗血小板藥物來(lái)避免出血風(fēng)險(xiǎn)，而治療過程中又難以找到一個(gè)合適的時(shí)間點(diǎn)來(lái)停止服用藥物，因此，如何能夠讓長(zhǎng)期抗血小板藥物治療患者在不停藥的狀態(tài)下即可種植修復(fù)牙齒成為口腔外科手術(shù)中的一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。

針對(duì)相關(guān)技術(shù)中的問題，目前尚未提出有效的解決方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)相關(guān)技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種用于長(zhǎng)期抗血小板藥物治療患者的特異性種植體，能夠使長(zhǎng)期抗血小板藥物治療患者在不停藥的狀態(tài)下即可種植修復(fù)牙齒，大大提高了種植修復(fù)牙齒的成功率，并且，本發(fā)明還提供了一種制作所述種植體的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種用于長(zhǎng)期抗血小板藥物治療患者的特異性種植體，所述種植體表面為聚多巴胺涂層修飾的鈦表面，所述聚多巴胺涂層修飾的鈦表面還具有促血小板活化聚集的功能性分子修飾涂層。

進(jìn)一步地，所述功能性分子修飾涂層為二磷酸腺苷修飾涂層。

進(jìn)一步地，所述功能性分子修飾涂層為纖維蛋白原修飾涂層。

進(jìn)一步地，所述功能性分子修飾涂層為二磷酸腺苷與纖維蛋白原混合修飾涂層。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種制作上述種植體表面的方法，利用聚多巴胺涂層修飾所述特異性種植體的鈦表面，并進(jìn)一步用具有促血小板活化聚集的功能性分子涂層修飾所述鈦表面。

進(jìn)一步地，所述的功能性分子為二磷酸腺苷。

進(jìn)一步地，所述的功能性分子為纖維蛋白原。

進(jìn)一步地，所述的功能性分子為二磷酸腺苷和纖維蛋白原。

本發(fā)明的有益效果：通過聚多巴胺涂層法將具有促血小板活化聚集的功能性分子接枝至聚多巴胺涂層修飾的鈦表面，得到的種植體具有促進(jìn)血小板活化聚集的效果，進(jìn)而在種植修復(fù)牙齒的手術(shù)中，使長(zhǎng)期抗血小板藥物治療患者的出血量降低，提高種植修復(fù)牙齒的成功率和安全性，同時(shí)聚集的活化血小板能產(chǎn)生的類似prp（plateletrichplasma，富血小板血漿）效應(yīng)，具有潛在的促成骨作用。從而無(wú)需停藥也可以安全地進(jìn)行種植修復(fù)牙齒，尤其適用于長(zhǎng)期抗血小板藥物治療的心腦血管病患者，另一方面，本發(fā)明還提供了具體的制作所述種植體的方法。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所述的具有二磷酸腺苷與纖維蛋白原混合修飾涂層的種植體表面的制備流程圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所述的鈦組、adp組、fib組、adp與fib混合接枝組表面xps圖譜；

圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所述的鈦組、adp組、fib組、adp與fib混合接枝組表面接觸角度柱形圖；

圖4a-4h是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所述的掃描電鏡下血小板形貌；

圖5是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所述的鈦組、adp組、fib組、adp與fib混合接枝組表面血小板粘附量柱形圖；

圖6是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所述的健康血小板的聚集激活情況；

圖7是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所述的病例血小板的聚集激活情況；

圖8是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所述的體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果柱形圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，該具體實(shí)施方式應(yīng)理解為是為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不用以限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料如無(wú)特殊說明均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例一：材料的制備過程

如圖1所示。

1.1聚多巴胺涂層表面修飾

將鈦片置于24孔板，加入2mg/ml多巴胺溶液1ml，parafilm封口膜封口后，浸泡24h。使用超聲清洗儀清洗去除未反應(yīng)的多巴胺顆粒，為聚多巴胺涂層修飾的鈦表面（ti+dop）。

1.2adp涂層修飾、fib涂層修飾

在聚多巴胺修飾的鈦表面中加入mg/mladp溶液1ml，1mg/mlfib溶液1ml.parafilm封口膜封閉后反應(yīng)24h。獲得ti+dop+adp、ti+dop+fib。

1.3adp與fib混合修飾

在聚多巴胺修飾的鈦表面中加入mg/mladp溶液與1mg/mlfib溶液(1：1)。parafilm封口膜封閉后反應(yīng)24h。即為ti+dop+adp+fib。

實(shí)施例二：材料表征分析

2.1x射線光電子能譜分析（xps）

使用axisultra多功能成像電子能譜儀，陽(yáng)極靶為鋁靶，能量為1486.7ev，樣品室真空度保持為6.7x10-7pa，光電子入射角為20o。經(jīng)284.8ev的c1s峰進(jìn)行校準(zhǔn)。表征前材料表面烘干。用casaxps軟件分析處理數(shù)據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，純鈦組材料表面主要是ti吸收峰。經(jīng)過多巴胺修飾后材料表面的ti峰消失，有很明顯的n元素吸收峰，是由于多巴胺中含有氨基（-nh2），以此可以證明多巴胺已成功涂層到鈦表面；纖維蛋白原組可見在多巴胺基礎(chǔ)上，n吸收峰增強(qiáng)，以及s吸收峰出現(xiàn)。由于纖維蛋白原結(jié)構(gòu)中含有大量的氨基，以及二硫鍵。證明纖維蛋白原已成功接枝；n峰的增強(qiáng)，佐證了纖維蛋白原的接枝成功；二磷酸腺苷組有p吸收峰出現(xiàn)，而且相比于多巴胺組n吸收峰也有所增加。證明二磷酸腺苷已成功接枝。纖維蛋白原與二磷酸腺苷混合接枝組可見n、p、s吸收峰出現(xiàn)，p吸收峰相比于纖維蛋白原組有所下降，n吸收峰介于纖維蛋白原組與二磷酸腺苷組之間，是由于材料對(duì)表面的部分覆蓋，證明纖維蛋白原與二磷酸腺苷在材料表面的成功接枝。

2.2靜態(tài)接觸角檢測(cè)

于室溫條件下懸滴法來(lái)測(cè)量樣品與水之間的接觸角，采用的測(cè)試液體為雙蒸水。分別檢測(cè)ti、ti+dop、ti+dop+adp、ti+dop+fib和ti+dop+adp+fib樣品，用2μl雙蒸水滴在干燥后的材料表面，穩(wěn)定后測(cè)其靜態(tài)接觸角。每個(gè)樣品測(cè)量3個(gè)點(diǎn)，材料表面的接觸角的大小表征材料表面的親水性能。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，種植體表面性質(zhì)對(duì)成骨細(xì)胞的粘附具有一定的影響。研究表明親水性表面能夠調(diào)節(jié)許多細(xì)胞的功能，如血小板、成骨細(xì)胞，促進(jìn)早期與種植體的結(jié)合。鈦組表面接觸角平均值大約為72°。展現(xiàn)為相對(duì)疏水的性質(zhì)。對(duì)鈦材料表面進(jìn)行聚多巴胺涂層修飾后，材料表面的接觸角平均值降至29°。由于多巴胺中含有大量的親水性機(jī)團(tuán)所致。經(jīng)過二磷酸腺苷接枝后，材料表面的接觸角平均值大約為26°。纖維蛋白原修飾后的材料表面的接觸角平均值為76°。二磷酸腺苷與纖維蛋白原混合接枝后的材料表面接觸角平均值為52°。

實(shí)施例三：血小板相關(guān)實(shí)驗(yàn)

3.1制備富含血小板血漿(platelet-richplasma,prp)

采集未服用抗血小板藥物的健康志愿者靜脈血10ml作為對(duì)照組（共1組），長(zhǎng)期服用抗血小板藥物一年以上病情穩(wěn)定的患者靜脈血10ml作為病例組（共3組）。實(shí)驗(yàn)室制備血小板懸浮液。健康志愿者靜脈血及長(zhǎng)期服用抗血小板藥物一年以上病情穩(wěn)定的患者靜脈血樣本均采集自安貞醫(yī)院。

3.2fe-sem觀察（fe-sem即場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡）

分別將100μl血小板懸浮液的健康對(duì)照組，與服用抗血小板藥物的患者病例組加到四組樣品表面，孵育30min，用2.5％戊二醛固定樣本后，乙醇梯度脫水；室溫。使用fe-sem分析ti、ti+dop、ti+dop+adp、ti+dop+fib和ti+dop+adp+fib表面血小板的形貌。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，其中a圖為對(duì)照組，b圖為實(shí)驗(yàn)組，在低倍鏡下觀察，鈦表面粘附的血小板量很少。表面改性后的材料表面血小板粘附量增加。adp與fib混和接枝組的血小板粘附量相對(duì)多與單獨(dú)接枝組。

3.3乳酸脫氫酶（ldh）測(cè)定血小板粘附量

分別取200μl富血小板懸浮液的健康對(duì)照組，與服用抗血小板藥物的患者病例組加到四組樣品表面加入樣品中孵育30min，加入0.1%triton溶液裂解0.5h，使用ldh試劑盒測(cè)定乳酸脫氫酶的含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，經(jīng)過表面改性后的材料表面血小板粘附量要高于鈦組。

3.4免疫熒光染色

分別取300μ血小板懸浮液的健康對(duì)照組，與服用抗血小板藥物的患者病例組加到四組樣品表面加入樣品中，室溫下孵育30min，4%的多聚甲醛固定30min，0.1%的triton-100溶液裂解細(xì)胞30min。分別加入抗體cd41-fitc和cd62p-pe，孵育。熒光顯微鏡下觀察血小板在材料表面的熒光分布。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6和圖7所示。

分別用帶熒光的抗體cd41-fitc（綠光）和cd62p-pe（紅光）與血小板膜上的cd41受體和cd62p受體結(jié)合，免疫熒光顯微鏡下觀察adp組、fib組、adp與fib混合接枝組材料表面血小板的熒光強(qiáng)度要顯著高于鈦組。表明有大量的血小板處于激活狀態(tài)。

實(shí)施例四：體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

在超凈臺(tái)中將實(shí)驗(yàn)室制備的材料，酒精消毒后置于無(wú)菌24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按3×104cells/ml的濃度接種hmsc（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞），分別于接種后的1d，3d，5d，用cck8試劑盒檢測(cè)hmsc增殖情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。

hmsc隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞在所有樣本表面均持續(xù)性增加，說明功能化的表面具有良好的細(xì)胞相容性。

綜上所述，根據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)峁┑挠糜陂L(zhǎng)期抗血小板藥物治療患者的特異性種植體，確實(shí)具有促血小板活化聚集的功能，具有良好的親水性，能夠調(diào)節(jié)許多細(xì)胞的功能，如血小板、成骨細(xì)胞，促進(jìn)早期與種植體的結(jié)合，且具有良好的細(xì)胞相容性，不會(huì)給患者帶來(lái)其他的負(fù)面影響。