專利名稱：新的特異性切割存活素的核酶及其藥物組合物和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的專一性的抗存活素核酶、含有該核酶的藥物組合物及其在抗腫瘤基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多細(xì)胞生命體的結(jié)構(gòu)和功能的完整性的有效維持是通過對細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞凋亡兩個相關(guān)過程中的精細(xì)平衡來獲得。細(xì)胞增殖亢起與凋亡銳減的最終后果是相同的，即腫瘤的形成。細(xì)胞凋亡這一復(fù)雜的生物學(xué)過程受到多個環(huán)節(jié)，涉及到正或負(fù)的效應(yīng)因子的控制。存活素(Survivin，NCBI Database，登錄號NO.BC008718)就是新進(jìn)發(fā)現(xiàn)一個細(xì)胞凋亡的拮抗性蛋白質(zhì)[1]，它在細(xì)胞周期的G2期和M期含量最高，并與參與細(xì)胞分裂的細(xì)胞骨架系統(tǒng)直接結(jié)合[2，3]。鑒于該存活素的啟動子的活性在G2期遠(yuǎn)較在G1期為高，這一蛋白的細(xì)胞周期性表達(dá)似乎主要是在轉(zhuǎn)錄水平上受控。
大量依據(jù)表明存活素的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞中異常升高，這與腫瘤細(xì)胞的凋亡速率極低呈正相關(guān)[1，9]。用反義RNA[2]或用顯性負(fù)調(diào)存活素[6，8]，強(qiáng)制性抑制存活素的表達(dá)，可引起腫瘤細(xì)胞的凋亡和瘤體消退。
一種很有前景的可下調(diào)RNA水平的方法涉及到特異性切割目標(biāo)蛋白的mRNA的核酶。核酶是具有順序特異性切割RNA分子的能力的核糖核酸酶[5]。核糖核酸(RNA)是它的唯一成分。由于它是一個酶，因此與反義RNA相比，它抑制基因表達(dá)的效率更為高。錘頭型(Hammerhead)的核酶是最小的一種核酶，它僅含有37個核苷酸的單鏈，從而也是最廣泛應(yīng)用的核酶[4，5]。
鑒于錘頭型核酶的上述特征，本領(lǐng)域中迫切需要有特異性切割存活素RNA的核酶。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供對存活素有專一性核酶活性的錘頭型核酶(下簡稱核酶)。
本發(fā)明的另一個目的是用本發(fā)明核酶來加速存活素表達(dá)過度的腫瘤細(xì)胞的凋亡。
本發(fā)明還有一個目的是用本發(fā)明的核酶或其重組表達(dá)載體來制備治療與存活素過度表達(dá)相關(guān)的疾病的藥物。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種含有本發(fā)明核酶的藥物組合物。
本發(fā)明還有一個目的是利用本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的存活素RNA編碼區(qū)中的特定位點來設(shè)計能特異性切割存活素RNA的核酶。
本發(fā)明一方面涉及一種分離的多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼特異性切割存活素RNA的錘頭型核酶，該核酶具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。
本發(fā)明另一方面涉及一種重組表達(dá)載體，該載體含有一種或多種上述多核苷酸序列的腺病毒及腺病毒相關(guān)病毒表達(dá)質(zhì)?；蚰孓D(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒。
在一個較佳的實施方案中，所述載體是含有一種或多種上述多核苷酸序列的腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒。
本發(fā)明另一方面涉及一種促進(jìn)存活素表達(dá)過度的細(xì)胞的凋亡的方法，該方法包括將上述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述存活素表達(dá)過度的細(xì)胞。
在一個較佳的實施方案中，所述重組表達(dá)載體是通過腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)來導(dǎo)入所述細(xì)胞的。
在另一較佳的實施方案中，所述存活素表達(dá)過度的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，更佳的是，所述存活素表達(dá)過度的細(xì)胞是肝癌細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面涉及一種藥物組合物，它包含特異性切割存活素編碼區(qū)61、83、232、294或358位點的核酶或含有該核酶的重組表達(dá)載體以及藥學(xué)上可接受的載體。
在一個較佳的實施方案中，所述特異性切割存活素編碼區(qū)61、83、232、294或358位點的核酶是錘頭型核酶，它具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。
本發(fā)明還有一方面涉及上述多核苷酸序列或重組表達(dá)載體在制備治療與存活素過度表達(dá)相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
在一個較佳的實施方案中，所述與存活素過度表達(dá)相關(guān)的疾病是癌癥。
本發(fā)明還有一個方面涉及存活素mRNA編碼區(qū)61、83、232、294或358位點的應(yīng)用，所述位點可用來設(shè)計或篩選特異性切割存活素RNA的核酶。
本發(fā)明提供了對存活素mRNA不同位點有專一性核酶活性的錘頭型的核酶。這些核酶通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體運載入受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，致使存活素的表達(dá)在RNA、蛋白質(zhì)水平上降低，從而使細(xì)胞的凋亡過程去抑制而引起細(xì)胞死亡。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點將在下文的詳細(xì)描述中有進(jìn)一步揭示。
附圖簡述

圖1顯示了腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織樣本中存活素表達(dá)水平的RT-PCR結(jié)果。
圖2顯示了預(yù)測的存活素mRNA的二級結(jié)構(gòu)，其中箭頭表示候選的核酶酶切位點。
圖3是用來構(gòu)建核酶表達(dá)質(zhì)粒的pGVal以及回文區(qū)(loop)中插入了核酶序列的pGVal-Rz的示意圖。
圖4顯示了用于進(jìn)行體外實驗的存活素表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HA-存活素以及加入了檢測標(biāo)記螢光素酶片段的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HA-存活素-螢光素酶的示意圖。
圖5顯示了本發(fā)明中采用的5種針對存活素RNA的核酶的序列，其中箭頭表示切點位置。
圖6顯示了用引物延伸法檢測活性的結(jié)果和切割位點。其中，圖6A是引物和預(yù)計的切割位點的示意圖；圖6B是引物延伸實驗的結(jié)果，箭頭表示存活素RNA經(jīng)核酶切割產(chǎn)生的片段。
圖7A顯示了核酶體外切割活性實驗中螢光素酶活性檢測的結(jié)果。
圖7B顯示了核酶切割產(chǎn)物經(jīng)體外翻譯后的Western印跡結(jié)果。
圖8是含有核酶序列Rz的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒的示意圖。
圖9顯示了逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的核酶導(dǎo)入的實驗結(jié)果。其中圖9A是RT-PCR結(jié)果，以β-肌動蛋白作為內(nèi)對照；圖9B是Western印跡結(jié)果，以PCNA作為內(nèi)對照。
圖10顯示了MTT試驗的結(jié)果。
圖11是顯示了腺病毒介導(dǎo)的核酶導(dǎo)入的實驗結(jié)果。RT-PCR結(jié)果，以β-肌動蛋白作為內(nèi)對照。
具體實施方案核酶切割RNA的效率取決于以下多個因素a)核酶的構(gòu)型，它的酶活性中心是否外露；b)底物RNA分子的二級結(jié)構(gòu)，有關(guān)的核酶酶切位點是否充分暴露和c)核酶在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的水平[4]。
Lieber利用腺病毒的VA I和RNA分子作為支架，將其中設(shè)計有暴露性結(jié)構(gòu)的核酶插入[4]。VA I屬pol III酶的基因家族，pol III在生長迅速的細(xì)胞中活性極高，從而這一系統(tǒng)可以很好的解決上述三個問題中的第一和第三個問題。對底物RNA的核酶位點的暴露性問題的解決方式有兩種1)根據(jù)自由能計算來對其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；2)對所預(yù)期到的核酶可切性進(jìn)行試驗。
本發(fā)明者通過對存活素RNA分子處于暴露區(qū)的核酶切點進(jìn)行選擇，設(shè)計并合成了5種具有特異性切割存活素活性的核酶，并以腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等作為常用載體進(jìn)行了細(xì)胞水平的試驗，證實了所合成的核酶具有預(yù)期的可切性，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明一方面涉及一種分離的多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼特異性切割存活素RNA的錘頭型核酶，它具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。
具體地說，所述核酶具有選自下列的多核苷酸序列CUUGAAUGCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGAGAUGC(SEQ ID NO1)AGCCCUCCCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGAAGGGC(SEQ ID NO2)AUGCUUUUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAUGUUCCU(SEQ ID NO3)AAUUCACCCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGGGUUAA(SEQ ID NO4)UUUCUUCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAUUGUUGG(SEQ ID NO5)。
它們在與存活素的mRNA序列特異性結(jié)合時呈現(xiàn)出如圖5所示的結(jié)構(gòu)。
本文所用的術(shù)語“分離的”在用于核酸時，表示核酸基本上不含其它在天然狀態(tài)下相關(guān)的細(xì)胞成分，其最好呈均質(zhì)狀態(tài)，但也可以是干的或水溶液。純度和均一性通常可用分析化學(xué)方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測定。
本文所用的術(shù)語“錘頭核酶”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的含義，它是僅含約37個核苷酸的單鏈RNA。
本發(fā)明中的核酶可用幾種方法獲得。例如，直接用化學(xué)方法合成DNA序列，然后利用DNA重組技術(shù)連接到重組質(zhì)粒中轉(zhuǎn)錄制得。另外，可用PCR技術(shù)來擴(kuò)增RNA(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)。
在得到了所述制得的核酶后，可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種技術(shù)，例如Sanger等人的雙脫氧鏈終止法(PNAS，1977，745463-5467)等來進(jìn)行測序。
本發(fā)明另一方面涉及一種重組表達(dá)載體，該載體含有一種或多種上述多核苷酸序列以及與所述多核苷酸序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
本文所用的術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體，例如但不局限于，在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體；在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體。然而，本發(fā)明范圍并不局限于該載體。只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。
這里所用的術(shù)語“表達(dá)調(diào)控序列”通常指參與控制核苷酸序列轉(zhuǎn)錄表達(dá)的序列。表達(dá)調(diào)控序列包括與目標(biāo)核苷酸序列操作性相連的啟動子和終止信號。典型的啟動子例如有pol III啟動子、T7啟動子等。“操作性相連”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動子或增強(qiáng)子增加了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列是操作性相連的。在上述重組表達(dá)載體中也可根據(jù)需要加入選擇性標(biāo)記基因。
由于本發(fā)明的核酶對存活素基因mRNA的位點有特異性切割活性，而存活素又與細(xì)胞凋亡的速度降低呈正相關(guān)，因此本發(fā)明還涉及一種促進(jìn)存活素表達(dá)過度的細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括將上述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述存活素表達(dá)過度的細(xì)胞。
所述“存活素表達(dá)過度的細(xì)胞”通常是真核細(xì)胞，更通常的是腫瘤細(xì)胞，例如肝腫瘤細(xì)胞。
可將多種含有上述相同或不同核酶多核苷酸序列的重組表達(dá)載體分別或同時導(dǎo)入存活素表達(dá)過度的細(xì)胞中。
將上述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的的，例如，采用腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的導(dǎo)入方法。然而，利用其它病毒載體或是利用其它方式來導(dǎo)入上述重組載體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
本發(fā)明另一方面涉及一種藥物組合物，它包含特異性切割存活素編碼區(qū)61、83、232、294或358位點的核酶或含有該核酶的重組表達(dá)載體以及藥學(xué)上可接受的載體。
在一個較佳的實施方案中，所述特異性切割存活素編碼區(qū)61、83、232、294或358位點的核酶是錘頭型核酶，它具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。存活素編碼區(qū)61、83、232、294或358位點如圖5所示。
本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)該載體以及組合物適當(dāng)?shù)亟o予動物或人時，它們不會產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)。通常，可作為藥學(xué)上可接受的載體或其組分的一些物質(zhì)的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調(diào)味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等。
本發(fā)明還涉及用上述多核苷酸序列或重組表達(dá)載體來制備治療與存活素過度表達(dá)相關(guān)的疾病的藥物。
在這里，所用的術(shù)語“疾病”表示可從上述處理獲益的與存活素表達(dá)過度有關(guān)的任何病征，例如包括癌癥?！鞍┌Y”是指哺乳動物中以無控制性細(xì)胞生長為典型特征的生理性癥狀?？蓮谋景l(fā)明獲益的癌癥例子包括，但不局限于，鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、腸胃癌、胰癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞瘤、乳房癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、腎癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌等。
本發(fā)明還有一個方面涉及存活素mRNA編碼區(qū)61、83、232、294或358位點的應(yīng)用，所述位點可用來設(shè)計或篩選特異性切割存活素RNA的核酶。盡管本發(fā)明中僅僅描述了根據(jù)存活素mRNA編碼區(qū)61、83、232、294或358位點來設(shè)計合成錘頭型核酶，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員也很容易根據(jù)這些位點來設(shè)計或篩選其它更復(fù)雜的且可能更有效切割這些位點的核酶。
下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于描述本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例存活素基因在腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織樣本中的過度表達(dá)存活素在腫瘤細(xì)胞中的過度表達(dá)與所述細(xì)胞的高度增殖的特征密切相關(guān)。
以肝癌為對象對存活素在肝癌組織，癌旁正常組織以及健康人的正常肝組織細(xì)胞中在穩(wěn)定態(tài)RNA水平上的表達(dá)RT-PCR的方法進(jìn)行了比較。
1)RNA的抽提組織RNA的抽提取125-250毫克磨碎的組織，加入2.5毫升Trizol(Gibco)。加入氯仿，劇烈震蕩。室溫靜置5分鐘，4℃ 10,000rpm離心15分鐘。上清轉(zhuǎn)移到一個無RNA酶的50毫升離心管，加入6毫升異丙醇，在離心管上標(biāo)記沉淀所在的位置，4℃ 10,000rpm離心10分鐘。輕輕倒去上清，用5毫升75％乙醇洗滌。室溫下干燥5分鐘。加入100微升DEPC水，轉(zhuǎn)移至1.5毫升離心管，-80℃保存。
細(xì)胞RNA的抽提取一瓶細(xì)胞(T25cm2)，倒去培液，用PBS洗2遍，每瓶細(xì)胞中加入0.5毫升Trizol。其余試劑等比例縮小，具體步驟同組織RNA抽提。
2)反轉(zhuǎn)錄取RNA 5微克，加入10mM dNTP，OligodT(0.5微克/微升)各1微升，再補加DEPC H2O至總體積為10微升。將Eppendorf管置于65℃，5分鐘。然后置于冰上1分鐘。在同一管中加入10×緩沖液2微升，0.1mM DTT 2微升，RNase抑制劑1微升。輕輕混勻后置于42℃，2分鐘。再加入反轉(zhuǎn)錄酶(50U/微升)1微升。置于42℃，50分鐘。然后置70℃，15分鐘，滅活RTase。所用反轉(zhuǎn)錄試劑盒是購自GIBICO的用于第一鏈cDNA合成的SuperScript預(yù)擴(kuò)增系統(tǒng)。
3)半定量PCR擴(kuò)增以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，在一個反應(yīng)體系中同時擴(kuò)增存活素和β-肌動蛋白(β-肌動蛋白作為內(nèi)對照)。所使用的引物為β-肌動蛋白上游引物(5’-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3’)(SEQ ID NO6)，下游引物(5’-TCAAGTTGGGGGACAAAAAG-3’)(SEQ ID NO7)，PCR產(chǎn)物為641bp；存活素上游引物(5’-TTTGCCACTGCTGTGTGATT-3’)(SEQ ID NO8)，下游引物(5’-ATTTCTCAGGAACAGCCGAG-3’)(SEQ ID NO9)，PCR產(chǎn)物為372bp。
反應(yīng)條件為94℃ 3分鐘1輪94℃ 30秒60℃ 30秒 25輪72℃ 30秒72℃ 5分鐘1輪分別取健康正常人的肝組織、肝癌患者的癌組織及其毗鄰的正常肝組織，用上述步驟抽提出細(xì)胞/組織中的RNA，反轉(zhuǎn)錄并用半定量RT-PCR方法測定RNA在各組織中的表達(dá)水平。如圖1所示，半定量RT-PCR方法檢驗的結(jié)果表明，正常肝和癌旁組織中的存活素水平遠(yuǎn)較肝癌組織中低。另外，在包括正常原代的人胚纖維母細(xì)胞株在內(nèi)的多種細(xì)胞株中，存活素均有相關(guān)水平的表達(dá)。
存活素基因特異性核酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建對存活素基因mRNA序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，并根據(jù)錘頭型核酶特異性切割位點的NUH(N表示任何一種核苷酸，U為尿嘧啶，H表示除G以外的任何一種核苷酸，切點位于H后)規(guī)律[5]，在mRNA單鏈區(qū)選擇出五個合適的位點(分別為存活素基因編碼區(qū)61、83、232、294或358位點)。圖2中顯示了根據(jù)能量最低原則來預(yù)計的存活素RNA的二級結(jié)構(gòu)，其中候選的5個核酶特異性切割位點位于環(huán)狀區(qū)。
如下所示，設(shè)計并合成針對這五個位點的核酶片段。另外，為了構(gòu)建克隆，還在核酶片段兩端分別加上了SalI和PstI酶切位點R1U(5’TCGACCTTGAATGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGAGATGCATGCA3’)(SEQ ID NO10)R1D(5’TGCATCTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGCATTCAAGG3’)(SEQID NO11)
R2U(5’TCGACAGCCCTCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGAAGGGCATGCA3’)(SEQ ID NO12)R2D(5’TGCCCTTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGAGGGCTG3’)(SEQID NO13)R3U(5’TCGACATGCTTTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAATGTTCCTATGCA3’)(SEQ ID NO14)R3D(5’TAGGAACATTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAAAAGCATG3’)(SEQID NO15)R4U(5’TCGACAATTCACCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGGGTTAAATGCA3’)(SEQ ID NO16)R4D(5’TTTAACCCTTTCGTCCTCCTCACGGACTCATCAGGGTGAATTG3’)(SEQ ID NO17)R5U(5’TCGACTTTCTTCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAATTGTTGGATGCA3’)(SEQ ID NO18)R5D(5’TCCAACAATTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAGAAGAAAG3’)(SEQID NO19)將上述合成的核酶片段加磷退火后，連接到pGVaL的SalI和PstI酶切位點中。pGaL質(zhì)粒的酶切圖如圖3所示。該質(zhì)粒具有以下特點，即其中的VAI基因中間加入了一個迴文結(jié)構(gòu)的順序(loop)，從而使核酶插入其中后，能夠得以充分暴露。VAI基因的上游有poll III啟動子，該啟動子可使該基因有效地在真核細(xì)胞中表達(dá)。另外，VAI基因地上游還有一個T7啟動子，使得在試管內(nèi)驗證該核酶的機(jī)制成為可能。
經(jīng)測序證實后，將重組質(zhì)粒命名為pGVaL-R1，pGVaL-R2，pGVaL-R3，pGVaL-R4，pGVaL-R5，統(tǒng)稱為pGVaL-Rz(圖3)。本實驗中核酶表達(dá)質(zhì)粒pGVaL-Rz在體外由T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，而在細(xì)胞內(nèi)則由真核RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄。
存活素表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建存活素基因片段用RT-PCR方法從BEL7402人肝癌細(xì)胞株(購自中國庫，上海生化細(xì)胞所)cDNA中擴(kuò)增，PCR引物為上游引物(5’CCGCTCGAGATGGGTGCCCCGACG 3’)(SEQ ID NO20)，下游引物(5’GAAGATCTATCCATGGCAGCCAGCT 3’)(SEQ ID NO21)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)BglII和XhoI消化、純化后，克隆到pCDNA-HA3載體的同樣位點中。pCDNA-HA3載體是是以pcDNA(invitrogen，CA，USA)為基本骨架、在其多克隆位點區(qū)中的EcoRI和XhoI之間插入了三個流感病毒血凝素抗原決定簇(HA)多肽序列構(gòu)建而成的真核細(xì)胞表達(dá)載體。經(jīng)測序證實后，存活素基因表達(dá)質(zhì)粒命名為pCDNA-HA-存活素(圖4)，簡稱為HA-Sur。
為了檢測的需要，我們將pGL-3 control質(zhì)粒(Promega，USA)中的螢光素酶片段克隆到HA-Sur的BglII和XbaI位點，形成可表達(dá)存活素和螢光素酶融合蛋白的質(zhì)粒，命名為pCDNA-HA-存活素-熒光素(圖4)，簡稱HA-Sur-Luc。
體外轉(zhuǎn)錄1)核酶的體外制備質(zhì)粒pGVaL-R1，pGVaL-R2，pGVaL-R3，pGVaL-R4，pGVaL-R5經(jīng)HindIII線性化后，用T7 RNA聚合酶分別進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。2微克線性質(zhì)粒，2.5微升10×緩沖液，2.5微升50mM DTT，10單位RNase抑制劑，2.5微升5mMNTPs和50單位T7 RNA聚合酶(Takara)，總體積25微升，37℃反應(yīng)1小時，再加入20單位DnaseI，37℃10分鐘。體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用無水乙醇沉淀純化后，溶解于20微升DEPC水中，用RT-PCR方法，以已知量的質(zhì)粒模板擴(kuò)增產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)，對體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定量，以pGVaL作為對照。
2)目的片段的體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒HA-Sur和HA-Sur-Luc經(jīng)Xba I線性化后，體外轉(zhuǎn)錄及定量過程同上。
核酶體外切割活性檢測取等摩爾數(shù)的核酶和目的片段RNA，在50mM Iris(pH7.5)和1mM EDTA條件下，95℃90秒后，立即放入冰中，再加入MgCl2至終濃度10mM，37℃反應(yīng)1小時，反應(yīng)總體積10微升。反應(yīng)結(jié)束后，用無水乙醇沉淀，沉淀產(chǎn)物溶于10微升DEPC水，進(jìn)行下面的檢測。
引物延伸實驗確定核酶切割位點引物SPE1(5’TGAAGCAGAAGAAACACTGGGCCAAGTCTG 3’)(SEQ ID NO22)，SPE2(5’GCAATTTTGTTCTTGGCTCTTTCTCTGTCCAG 3’)(SEQ ID NO23)，SPE3(5’ATCCATGGCAGCCAGCTGCTCGATG 3’)(SEQ ID NO24)各0.5pm用32P進(jìn)行5’末端標(biāo)記。用同樣的引物以質(zhì)粒HA-Sur和HA-Sur-Luc為模板進(jìn)行測序反應(yīng)。引物延伸產(chǎn)物和測序產(chǎn)物經(jīng)6％尿素變性膠電泳，放射自顯影分析結(jié)果，確定每個核酶在存活素RNA上的切割位點。
如圖5(B)所示，引物延伸實驗結(jié)果表明，經(jīng)本發(fā)明設(shè)計的核酶處理過的底物均在預(yù)期位置上有切點。這表明這些切割確實是本發(fā)明所設(shè)計的核酶活性的佐證。
螢光素酶活性檢測取3微升HA-Sur-Luc RNA的核酶切割產(chǎn)物進(jìn)行體外翻譯(Rabbit Reticulocyte Lysate System，Promega)，反應(yīng)總體積10微升。2微升的翻譯產(chǎn)物用于檢測螢光素酶活性，同時以pGVaL轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為核酶的陰性對照。結(jié)果顯示在圖6(A)中。
Western印跡雜交將存活素RNA分別與5個核酶進(jìn)行體外切割反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行體外翻譯，方法同上。各2微升體外翻譯產(chǎn)物經(jīng)7.5％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，用抗HA抗體(Santa Cruz，USA)1∶5000檢測切割后的存活素表達(dá)情況。結(jié)果顯示在圖6(B)中。
螢光素酶活性檢測和核酶切割產(chǎn)物經(jīng)體外翻譯后的Western印跡雜交結(jié)果均證實上述所得的結(jié)果是一致的。
如上所述，本發(fā)明所設(shè)計和檢測的5個核酶中，以1，3和5號的活性最高。所觀察到的各單一的核酶僅能部分地切割存活素RNA，可能是以下幾個原因所致a，其中僅部分存活素RNA分子呈對某一核酶敏感的二級構(gòu)象，b，核酶分子的穩(wěn)定性和效率等等。由于試管內(nèi)存活素RNA構(gòu)象與細(xì)胞內(nèi)可能不同，因此本發(fā)明者將所有5種核酶分別克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒(pFB，Stratagne)或腺病毒載體，以存活素過度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞BEL7402為受體細(xì)胞進(jìn)行核酶效率的檢測。
核酶逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建pGVaL-Rz系列質(zhì)粒經(jīng)XbaI酶切，用Klenow酶補平，再經(jīng)MluI酶切后，回收570bp核酶片段(其中包括幫助核酶維持活性結(jié)構(gòu)的vaI、vaII、loop序列)。將此核酶片段克隆至pFB-neo質(zhì)粒的5’EcoRI(補平)和3’MluI位點，酶切鑒定后，重組質(zhì)粒命名為pFB-R1，pFB-R2，pFB-R3，pFB-R4，pFB-R5，統(tǒng)稱為pFB-Rz。圖8中顯示了核酶逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒pFB-Rz的示意圖。
對照質(zhì)粒pFB-VaL用同樣方法，從pGVaL質(zhì)粒中切出VaL片段(僅含有vaI、vaII、loop序列)，克隆到pFB-neo質(zhì)粒中獲得。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染及逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒顆粒的收獲將上述獲得的pFB-Rz系列質(zhì)粒和對照pFB-VaL各10微克用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染5×106 PA317細(xì)胞，2星期后，用200毫克/毫升G418篩選。擴(kuò)增轉(zhuǎn)入pFB-Rz和pFB-VaL的PA317細(xì)胞克隆，收獲細(xì)胞培液，用0.22um孔徑的濾器過濾，4℃保存。將含病毒上清按10倍梯度稀釋，感染NIH3T3細(xì)胞，用G418 200毫克/毫升篩克隆，2周后，根據(jù)克隆數(shù)計算病毒滴度。
細(xì)胞內(nèi)核酶活性檢測1)細(xì)胞培養(yǎng)及逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)核酶導(dǎo)入用病毒上清10倍稀釋液5毫升感染1×106人肝癌細(xì)胞BEL7402細(xì)胞，并加入硫酸魚精蛋白(Protamine sulfate)至5微克/毫升，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24小時后，棄去培養(yǎng)液，換新鮮完全培養(yǎng)液(含10％新生小牛血清，青霉素、鏈霉素各100U/毫升的DMEM)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，收獲細(xì)胞，用于RT-PCR檢測和Western印跡分析。
2)RT-PCR檢測存活素在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)用Trizol(Gibco)抽提分別轉(zhuǎn)入了5種核酶病毒和對照病毒的BEL7402細(xì)胞的總RNA，cDNA制備如前所述。用PCR擴(kuò)增存活素片段，以β-肌動蛋白作為內(nèi)參照，引物序列及反應(yīng)條件同1.3)所述。用Smartview凝膠成像分析系統(tǒng)測定條帶灰度，檢測五種核酶對存活素mRNA的切割作用及其效率，其結(jié)果顯示在圖9(a)和下表1中。
表1 五種核酶的切割效率

3)Western印跡法檢測存活素在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)用細(xì)胞裂解液裂解收獲的BEL7402細(xì)胞，細(xì)胞總蛋白量用BCA試劑盒(PIERCE)測定。15％的SDS-聚丙烯酰胺膠分離蛋白，用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用存活素抗體(AlpaDiagnostic International)1∶2000檢測存活素表達(dá)，用抗PCNA抗體(Santa Cruz)1∶5000檢測PCNA表達(dá)，作為內(nèi)參照。分析轉(zhuǎn)入不同核酶的BEL7402細(xì)胞中存活素表達(dá)情況，其結(jié)果顯示在圖9(b)和表2中。
表2 轉(zhuǎn)入不同核酶的BEL7402細(xì)胞中存活素表達(dá)情況

核酶腺病毒載體的構(gòu)建用Stratagene公司的AdeasyTM adenoviral vector system.pGVaL-Rz系列質(zhì)粒經(jīng)XbaI酶切，Klenow酶補平，再經(jīng)HindIII酶切后，回收570bp核酶片段(包括幫助核酶維持活性結(jié)構(gòu)的vaI、vaII、loop序列)。將此核酶片段克隆至pShuttle-CMV質(zhì)粒的5’SalI(補平)和3’HindIII位點，酶切鑒定后，重組質(zhì)粒命名為pShuttle-R1，pShuttle-R2，pShuttle-R3，pShuttle-R4，pShuttle-R5，統(tǒng)稱為pShuttle-Rz。對照質(zhì)粒pShuttle-VaL用同樣的方法，從pGVaL質(zhì)粒中切出VaL片段(僅含有vaI、vaII、loop序列)，克隆到pShuttle-CMV質(zhì)粒中獲得。
pShuttle-Rz系列質(zhì)粒和pShuttle-VaL各1微克經(jīng)PmeI線性化，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀純化后，與0.1微克pAdEasy質(zhì)粒共轉(zhuǎn)E.coli BJ5183電轉(zhuǎn)感受態(tài)。克隆用50微克/毫升的卡那霉素篩選。挑取單克隆，抽質(zhì)粒，用PacI酶切鑒定，所得到的重組質(zhì)粒命名為pAd-R1，pAd-R2，pAd-R3，pAd-R4，pAd-R5，統(tǒng)稱為pAd-Rz，以及對照pAd-VaL。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染及腺病毒病毒顆粒的收獲pAd-Rz系列質(zhì)粒和對照pAd-VaL各10微克經(jīng)PacI酶切線性化后，用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染5×106HEK293細(xì)胞，7-8天后細(xì)胞發(fā)生病變，收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融4次后，離心收集上清。2毫升上清液再用于感染5×106 HEK293細(xì)胞，2-3天后收獲病毒。為了提高病毒滴度，這一過程需反復(fù)4次。用空斑實驗測定每種病毒的滴度，同時用PCR方法檢測病毒顆粒數(shù)。
細(xì)胞內(nèi)核酶活性檢測細(xì)胞培養(yǎng)及腺病毒介導(dǎo)的核酶導(dǎo)入按MOI為50的比例在人肝癌細(xì)胞BEL7402細(xì)胞中加入核酶腺病毒，37℃，5％CO2條件下8小時后，棄去培養(yǎng)液，換新鮮的含10％新生小牛血清，青霉素、鏈霉素各100U/毫升的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，收獲細(xì)胞，用于RT-PCR檢測分析。
用上述相同方法，用RT-PCR檢測存活素在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，其結(jié)果顯示在圖10中和下表3中。
表3 存活素在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)結(jié)果

進(jìn)行MTT實驗檢測核酶活性。在96孔板中接種BEL7402細(xì)胞4×103/孔，5小時后，按MOI為50的量分別加入不同核酶及對照的腺病毒，每種平行作3孔。8小時后，棄去培養(yǎng)液，換新鮮的DMEM全培液。在37℃，5％CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，加入30微升MTT溶液(5毫克/毫升)，4小時后，棄去培養(yǎng)液，用100微升DMSO將Formosan結(jié)晶完全溶解，加入顯色液(0.1M甘氨酸，NaCl，pH10)25微升顯色，570nm測OD。重復(fù)3次，結(jié)果顯示在圖11中。
本發(fā)明中核酶1，3和5在試管內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)均為最有效。這提示在相當(dāng)程度上試管內(nèi)的實驗結(jié)果對有關(guān)何種核酶為優(yōu)有很高的預(yù)見力。
雖然，任一有效的核酶并非能夠完全抑制存活素的表達(dá)，但或許可以通過聯(lián)合使用2個或更多的核酶來提高療效。譬如，核酶1，3和5可以串聯(lián)的方式放入腺病毒，腺相關(guān)病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，而用這種含有復(fù)合核酶基因的病毒來感染腫瘤細(xì)胞，可以通過對細(xì)胞中存活素的表達(dá)抑制來殺死腫瘤細(xì)胞。
下面列出了在本發(fā)明中提及的所有參考文獻(xiàn)，所有這些文獻(xiàn)均納入本文作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種變化或修改，這些變化或修改均包括在本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。
參考文獻(xiàn)1.G.Ambrosini，C.Adida，D.C.Altieri.A novel anti-apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma.Nature Med.3917-921(1997)2 Fengzhi Li，Grazia Ambrosini，et al.Control of apoptosis and mitotic spindlecheckpoint by survivin.Nature，396580-584(1998).
3.Dimitros A.Skoufias，Cristiana Mollinari，et al.Human survivin is a kinetochore-associated passenger protein.JCB，1511575-1581(2000).
4.Andre Liebeer，Michael Strauss.Selection of efficient cleavage sites in target RNAsby using a ribozyme expression library.Molecular and Cellular Biology，15540～551(1995).
5.N.Kyle Tanner.RibozymesThe characteristics and properties of catalytic RNAs.FEMS Microbiology Reviews.23257～275(1999).
6.Fengzhi Li，Elizabeth J.Ackermann，et al.Pleiotropic cell-division defects andapoptosis induced by interference with survivin function.Nature Cell Biology，1461-465(1999).
7.Tong Chuan He，Shibin Zhou，Luis T.Da Costa，Jian Yu，Kenneth W.Kinzler.BertVogelstein et al，A simplified system for generation recombinant adenoviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.952509～2514(1998).
8 Mehdi Mesri，Nathan R.Wall，Jia Li，Richard W.Kim，Dario C.Altieri et al.Cancergene therapy using a survivin mutant adenovirus.J.Clin.Invest.108981～990(2001).
9.John C.Reed.The survivin saga goes in vivo.J.Clin.Invest.108965～969(2001).
序列表<110>上海市腫瘤研究所<120>新的特異性切割存活素的核酶及其藥物組合物和應(yīng)用<130>023028<160>24<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>合成的核酶RNA<400>1cttgaatgct gatgagtccg tgaggacgaa agagatgc 38<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>合成的核酶RNA<400>2agccctccct gatgagtccg tgaggacgaa agaagggc 38<210>3<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>合成的核酶RNA<400>3atgcttttct gatgagtccg tgaggacgaa atgttcct 38<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>合成的核酶RNA<400>4aattcaccct gatgagtccg tgaggacgaa agggttaa 38<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>合成的核酶RNA<400>5tttcttctct gatgagtccg tgaggacgaa attgttgg 38<210>6<211>20<212>DNA<213>引物<400>6aagtactccg tgtggatcgg 20<210>7<211>20<212>DNA<213>引物<400>7tcaagttggg ggacaaaaag 20<210>8<211>20<212>DNA<213>引物<400>8tttgccactg ctgtgtgatt 20<210>9<211>20<212>DNA<213>引物<400>9atttctcagg aacagccgag 20<210>10<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R1的上鏈DNA<400>10tcgaccttga atgctgatga gtccgtgagg acgaaagaga tgcatgca 48<210>11<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R1的下鏈DNA<400>11tgcatctctt tcgtcctcac ggactcatca gcattcaagg 40<210>12<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R2的上鏈DNA<400>12tcgacagccc tccctgatga gtccgtgagg acgaaagaag ggcatgca 48<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R2的下鏈DNA<400>13tgcccttctt tcgtcctcac ggactcatca gggagggctg 40<210>14<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R3的上鏈DNA<400>14tcgacatgct tttctgatga gtccgtgagg acgaaatgtt cctatgca 48<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R3的下鏈DNA<400>15taggaacatt tcgtcctcac ggactcatca gaaaagcatg 40<210>16<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R4的上鏈DNA<400>16tcgacaattc accctgatga gtccgtgagg acgaaagggt taaatgca 48<210>17<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R4的下鏈DNA<400>17tttaaccctt tcgtcctcct cacggactca tcagggtgaa ttg 43<210>18<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R5的上鏈DNA<400>18tcgactttct tctctgatga gtccgtgagg acgaaattgt tggatgca 48<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R5的下鏈DNA<400>19tccaacaatt tcgtcctcac ggactcatca gagaagaaag 40<210>20<211>24<212>DNA<213>引物<400>20ccgctcgaga tgggtgcccc gacg24<210>21<211>25<212>DNA<213>引物<400>21gaagatctat ccatggcagc cagct 25<210>22<211>30<212>DNA<213>引物<400>22tgaagcagaa gaaacactgg gccaagtctg 30<210>23<211>32<212>DNA<213>引物<400>23gcaattttgt tcttggctct ttctctgtcc ag 32<210>24<211>25<212>DNA<213>引物<400>24atccatggca gccagctgct cgatg 2權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸序列，它編碼特異性切割存活素RNA的錘頭型核酶，其特征在于，該核酶具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。
2.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，該載體含有權(quán)利要求1所述的一種或多種多核苷酸序列以及與所述多核苷酸序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述載體是含有權(quán)利要求1所述的一種或多種多核苷酸序列的腺病毒及腺病毒相關(guān)病毒表達(dá)質(zhì)?；蚰孓D(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒。
4.一種促進(jìn)存活素表達(dá)過度的細(xì)胞的凋亡的方法，其特征在于，將權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述存活素表達(dá)過度的細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，通過腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述存活素表達(dá)過度的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
7.一種藥物組合物，其特征在于，它包含特異性切割存活素編碼區(qū)61、83、232、294或358位點的核酶或含有該核酶的重組表達(dá)載體以及藥學(xué)上可接受的載體。
8.權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列、權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體在制備治療與存活素過度表達(dá)相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述與存活素過度表達(dá)相關(guān)的疾病是癌癥。
10.存活素mRNA編碼區(qū)61、83、232、294或358位點的應(yīng)用，其特征在于，所述位點可用來設(shè)計或篩選特異性切割存活素RNA的核酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異性切割存活素RNA的錘頭型核酶，它具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。本發(fā)明還提供了含有該核酶的重組表達(dá)載體、用該載體來促進(jìn)存活素表達(dá)過度的細(xì)胞凋亡的方法以及上述核酶或重組表達(dá)載體在制備治療與存活素過度表達(dá)相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C12N15/63GK1465701SQ0211195
公開日2004年1月7日 申請日期2002年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月5日
發(fā)明者朱景德, 倪敏 申請人:上海市腫瘤研究所