專利名稱：11段人消化道腫瘤血管特異性結合環(huán)肽gx系列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，涉及體內篩選血管特異性結合肽，特別涉及11段人消化道腫瘤血管特異性結合環(huán)肽GX系列。
背景技術：
雖然近些年來胃癌有逐漸減少的趨勢，但是其仍居國人十大癌癥死因排名的第三位，傳統(tǒng)的治療方式仍是手術，化療和放療。1971年，F(xiàn)olkman教授提出腫瘤生長和轉移依賴于血管的學說，阻斷腫瘤血管生成成為一種抑制腫瘤生長的方法。與傳統(tǒng)方法相比，腫瘤血管抑制治療具有以下優(yōu)點①不易產(chǎn)生耐藥性；②藥物易于到達靶部位；③抑制腫瘤轉移；④無遺傳毒性，；⑤作用強等。如目前正在進行3期臨床實驗的angiostatin(U.S.Patent No.5,801,012)，Endostatin(U.S.Patent No.6,174,861)。然而，腫瘤血管抑制治療雖然具有明顯的優(yōu)勢，但也存在一些不足①腫瘤血管針對性不強，腫瘤難以被完全根治，還有潛在抑制正常內皮細胞的危險性。尤其在傷口愈合、月經(jīng)周期、妊娠等情況下不宜使用。②表達效率低，療效受限。③目前進入臨床實驗多數(shù)血管生成抑制分子進入體內表達效率低，不能在腫瘤血管局部維持治療濃度。反復使用易引起免疫反應，且價格昂貴，限制了它們的臨床應用。
由于腫瘤血管與正常血管在形態(tài)與功能上都有很大的不同，如內皮細胞體積縮小，形態(tài)不規(guī)則，細胞間隙增大，有的血管壁甚至無內皮細胞，血管壁通透性增加等等。更為重要的是腫瘤血管表達一些被稱為“vascular zipcodes”的與正常血管不同的特異性蛋白。正是這些僅在腫瘤血管表達而在正常細胞中不表達或者痕量級表達的特異性分子是腫瘤血管治療的關鍵靶標。
檢測腫瘤血管特異性的分子標志物存在著很多困難，因為這些分子只存在于腫瘤血管，正常血管中并不存在。并且表達的量較小、難以檢測、更無法純化。正因為這樣，噬菌體隨機肽庫的成功應用解決了這一難題(US.Patent.No.5,866,363)。采用噬菌體隨機肽庫技術，可以在欲篩選的靶標分子結構不明確的情況下，無需事先知道它們之間相互作用的區(qū)域及相互作用的性質來進行篩選，從而篩選出一些能與靶分子結合的特異性多肽。Arap.W.等采用噬菌體隨機肽庫技術發(fā)現(xiàn)能夠與前列腺腫瘤血管特異性結合的小肽“SMSIARL”(US.Patent.No.6,610,651)目前，大多數(shù)篩選方法均采用體外篩選，但是對于腫瘤血管內皮細胞而言，直接分離和體外培養(yǎng)人腫瘤血管內皮細胞，一是分離技術操作的難度，二是長期體外培養(yǎng)使內皮細胞失去了體內的生存環(huán)境，從而使內皮細胞細胞喪失組織特異性。而進行的一些體內的實驗大多采用人腫瘤細胞系或者移植組織瘤塊的裸鼠模型，也有一些采用轉基因小鼠進行，移植瘤生長周期較長，這樣常常使腫瘤細胞的形態(tài)和生存能力發(fā)生變化，或者喪失人源性，從而影響到這樣的實驗結果也許并非理想。
6天法建立CTX免疫抑制Balb/c小鼠人胃癌或食管癌移植瘤模型，由于移植瘤生長周期較短，雖小鼠血管內皮細胞開始出芽生長并引起與人胃癌組織血管的再通，保證了局部的血液供應，但是，瘤塊內部的血管內皮細胞在6天內并沒有被小鼠血管內皮細胞所完全取代，還大多保持了人源性。本研究所曾經(jīng)利用6天法建立CTX免疫抑制Balb/c小鼠人胃癌移植瘤模型對胃癌進行了篩選，但是可能因為挑取克隆用于下一步篩選的方法不很完善，所以小肽的特異性不很理想，并且未能夠進行對小肽進行體內活性檢測的體內競爭抑制實驗。申請人采用改進的噬菌體隨機肽庫體內篩選技術成功在體內篩選出能夠與胃癌和食管癌血管特異性相結合的環(huán)狀7肽GX系列，目前的研究結果表明該系列肽段可以同胃癌血管特異性結合，而與正常脾臟血管不結合，與肝癌，血管瘤的血管也未見特異性結合。
盡管申請人篩選出的模擬小肽其序列與天然已知分子并無相似之處，但這樣并不能說明它沒有同天然分子相類似的功能，也不能否認其不具有能與天然分子相結合的能力。如從噬菌體表面隨機短肽庫中篩選出模擬環(huán)狀小肽(U.S.Patent No.5,835,382)，雖然其序列與天然EPO的序列亦無相似之處，但是它的確能夠與EPO受體高親合力結合，并且模擬促紅細胞生成素(EPO)的功能。與此類似，篩選出能與消化道腫瘤血管特異性結合多肽將會在腫瘤靶向治療等方面具有重大的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用噬菌體隨機肽庫進行體內篩選和篩選結果活性檢測的方法，并且獲得11個能夠與腫瘤血管特異性結合的環(huán)狀7肽的氨基酸序列。
實現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術方案是首先制備免疫抑制小鼠人腫瘤組織腎包膜下移植瘤模型，從中篩選出具有能與腫瘤的血管內皮細胞高結合活性的多肽；并利用噬斑形成實驗、免疫組化檢測GX系列的特異性歸巢性，荷瘤小鼠體內競爭抑制實驗等檢測了GX系列的結合活性；確認獲得GX系列多肽的氨基酸序列，且證明相應序列的惟一性。
本發(fā)明選用噬菌體隨機肽庫體內篩選技術，成功的獲得人胃低分化腺癌和人食道鱗癌血管的特異性結合環(huán)狀7肽GX系列，并獲得其獨特的氨基酸序列，將會在腫瘤血管靶向治療，腫瘤血管特異性分子標志物試劑的研制方面打下了良好的基礎。


圖1是本發(fā)明的11段能夠特異性結合于人消化道腫瘤血管內皮細胞上的環(huán)肽的氨基酸序列。
圖2是本發(fā)明的GX1序列同其同源性最高的蛋白序列比較。
圖3是本發(fā)明的GX2序列同其同源性最高的蛋白序列比較。
圖4是本發(fā)明的GX3序列同其同源性最高的蛋白序列比較。
圖5是本發(fā)明的GX4序列同其同源性最高的蛋白序列比較。
圖6是本發(fā)明的GX5序列同其同源性最高的蛋白序列比較。
圖7是本發(fā)明的GX6序列同其同源性最高的蛋白序列比較。
圖8是本發(fā)明的GX7序列同其同源性最高的蛋白序列比較。
圖9是本發(fā)明的GX8序列同其同源性最高的蛋白序列比較。
圖10是本發(fā)明的GX9序列同其同源性最高的蛋白序列比較。
圖11是本發(fā)明的GX10序列同其同源性最高的蛋白序列比較。
圖12是本發(fā)明的GX11序列同其同源性最高的蛋白序列比較。
氨基酸序列GX1Gly Asn Ser Asn Pro Lys SerGX2Pro His Asn Leu Thr Lys LeuGX3Tyr Ser Phe Asn Ser Trp MetGX4Pro Asn Pro Asn Asn Ser ThrGX5Tyr Ser Ile Asn Asp Trp HisGX6Leu Phe Ala Met Pro Asn SerGX7Ser Thr Val Ala Thr Ser GlnGX8Tyr Val Thr Pro Tyr Asp IleGX9Ser Pro Ala Asn Leu Phe ThrGX10Pro Met Asn Ala Asp Asn LeuGX11Ser Arg His Asp Leu Asn Ser
具體實施例方式
以下結合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
腫瘤血管內皮細胞分子表面標記物是腫瘤血管治療的基礎，為此，申請人選用噬菌體隨機肽庫體內篩選技術，成功的獲得一組人胃低分化腺癌和人食道鱗癌血管的特異性結合環(huán)狀7肽GX系列，并利用噬斑形成實驗、免疫組化檢測GX系列的特異性歸巢性，荷瘤小鼠體內競爭抑制實驗等檢測了GX系列的結合活性，該系列GX肽具有較高的結合消化道腫瘤血管內皮細胞的能力。
1.技術方案及其路線1.1人腫瘤組織腎包膜下移植瘤模型的建立1.1.1術前準備Balb/c純系小鼠雌雄各半(購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心)，6周齡，體重20g-24g，實驗前24h小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX，購自江蘇恒瑞股份有限公司)150mg/kg一次，制成CTX免疫抑制小鼠。
1.1.2新鮮癌組織的處理在手術過程中分別取胃癌或食管癌手術患者的腫瘤組織，手術患者均經(jīng)術前病理診斷為胃低分化腺癌或者食道鱗癌，瘤組織離體后立即將其投入無血清RPMI1640(購自Gibco BRL公司)中，在超凈工作臺中去除結締和壞死組織，用含有雙抗RPMI-1640中浸泡15min(雙抗青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100μg/ml)，然后將其切成2mm3左右的小塊，再用無血清RPMI1640反復沖洗，置于RPMI-1640中備用。
1.1.3腎包膜下移植參考王瑜法行SRCA法戊巴比妥鈉150mg/kg(上海化學試劑分裝廠)腹腔注射麻醉小鼠，消毒，無菌條件下暴露，游離腎臟，小心分離腎包膜，將切割好的組織塊植入小鼠腎包膜下，縫合切口。
1.2噬菌體小鼠體內淘篩1.2.1體內淘篩過程術后第6天，取一只荷瘤BALB/c小鼠，戊巴比妥鈉150mg/kg腹腔注射麻醉，75％乙醇浸泡5min。將含1011pfu C7C噬菌體隨機肽庫(購自于NEWENGLAND BIOLABS公司)的200μl RPMI1640，注入小鼠尾靜脈，5min后取瘤組織和其他對照組織，稱重，加入冰1ml RPMI1640-PI(含1Mm PMSF，20ug/ml aprotinin，1ug/ml leupeptin)用組織勻漿器研磨，把勻漿移入50ml離心管，加5ml冰RPMI1640-PI(含1％BSA)洗滌4次后。與1ml大腸桿菌ER2738(OD＝0.5)靜止感染30min，加9ml LB培養(yǎng)液室溫孵育30min，把混合液鋪制到LB瓊脂糖平皿上(含4％X-gal，5％IPTG)，37℃過夜。
1.2.2噬菌體的體外擴增用牙簽隨機挑取250個左右呈現(xiàn)藍斑的噬菌體克隆，每個克隆加入5mlLB培養(yǎng)液于搖菌管內，37℃下250rpm培養(yǎng)12～14h。然后將培養(yǎng)物混合，4℃10000rpm離心15min，將上清移入一無菌三角錐形瓶中，加入1/6體積的PEG/NaCl(購自北京鼎國生物技術發(fā)展中心)溶液，4℃靜置過夜。將4℃過夜的沉降液于4℃下10000rpm離心15min，棄去上清。用1ml RPMI1640重懸沉淀物，再次加入160μl PEG/NaCl溶液，冰浴1h，4℃下10000rpm離心10min，棄去上清，以200μl含0.02％NaN3(購自北京鼎國生物技術發(fā)展中心)的RPMI1640溶液重懸沉淀物，此即為第一輪擴增的噬菌體。將其保存于4℃，用于下一輪篩選。胃腺癌組織體內淘篩4輪，食道鱗癌組織淘篩5輪。
1.2.3陽性噬菌體克隆的挑選及測序第4輪胃腺癌組織或第5輪食道鱗癌組織篩選結束后，無菌條件下以牙簽隨機挑取14個(胃癌)或13個(食管癌)分隔良好的藍色噬斑分別加至2ml LB培養(yǎng)液中，37℃下250rpm培養(yǎng)2h。將噬菌體培養(yǎng)液4℃10000rpm離心10min后取培養(yǎng)上清。用華舜公司生產(chǎn)的單鏈DNA提取試劑盒進行噬菌體單鏈DNA的提取，按操作說明書進行操作在含有單個噬菌體克隆的LB培養(yǎng)液中加入沉淀液，高速離心后得到噬菌體顆粒沉淀，加入裂解液裂解噬菌體外殼蛋白，經(jīng)過樹脂純化，洗脫得到噬菌體單鏈DNA。以單鏈DNA為模板，采用噬菌體隨機肽庫試劑盒中所提供的測序引物，-96gIII，5′-HOCCC TCATAG TTA GCG TAA CG-3′送至上海生物工程有限公司測序。結果顯示如下表及圖1將其分別命名為GX1-GX11，食道癌中有2例樣本未測出。


1.3呈現(xiàn)噬菌體歸巢性的鑒定1.3.1藍斑計數(shù)取移植有人胃腺癌或食道鱗癌的荷瘤BALB/c小鼠，將獲得的GX系列單克隆分別以1011pfu 200μl RPMI1640注入小鼠尾靜脈，其他操作方法同上，37℃孵箱內過夜后比較藍色噬斑數(shù)量。結果顯示GX1從瘤組織獲取的藍色噬斑是其在對照組織的4.6～137.26倍；GX2從瘤組織獲取的藍色噬斑是其在對照組織的3.98～180.74倍；GX3從瘤組織獲取的藍色噬斑是其在對照組織的3.01～44.57倍；GX4從瘤組織獲取的藍色噬斑是其在對照組織的1.43～3.26倍；GX5從瘤組織獲取的藍色噬斑是其在對照組織的5.16～70.68倍；GX6從瘤組織獲取的藍色噬斑是其在對照組織的1.69～9.42倍；GX7從瘤組織獲取的藍色噬斑是其在對照組織的3.47～12.39倍；GX8從瘤組織獲取的藍色噬斑是其在對照組織的1.18～4.45倍；GX9從瘤組織獲取的藍色噬斑是其在對照組織的1.15～3.16倍；GX10從瘤組織獲取的藍色噬斑是其在對照組織的1.28～5.71倍；GX11從瘤組織獲取的藍色噬斑是其在對照組織的1.44～3.13倍。從結果來看GX系列均有良好的歸巢于腫瘤血管的特性。
1.3.2免疫組化1.3.2.1噬菌體M13蛋白在移植瘤中的表達取荷胃癌或食管癌小鼠，尾靜脈分別注入GX系列噬菌體1011pfu，灌洗小鼠全身，方法同前。取腫瘤組織和對照組織，4％低聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。采用常規(guī)SP法染色(SP試劑盒購自于北京中山生物技術有限公司)，一抗為小鼠抗M13單克隆抗體(購自于Pharmacia公司，工作濃度為1∶80)，陰性對照采用正常山羊血清代替M13一抗，余步驟同前，封片后觀察結果。結果顯示GX系列的呈現(xiàn)噬菌體均停留在移植瘤的血管內，M13表達較高，而在其他對照組織上幾乎無表達。
1.3.2.2 VIII因子相關抗原在移植瘤中的表達如上法取移植瘤組織，4％低聚甲醛固定，石蠟包埋，切片。采用常規(guī)SP法染色(SP試劑盒購自于北京中山生物技術有限公司)，一抗為兔抗人VIII因子多克隆抗體(購自于DAKO公司，工作濃度為1∶300)，余步驟同前，封片后觀察結果。結果顯示移植瘤中VIII因子顯色較強，說明移植瘤內血管豐富，M13染色同VIII因子相關抗原比較結果也證實M13 GX系列呈現(xiàn)噬菌體表達與VIII因子表達范圍類似，說明GX系列呈現(xiàn)肽可以特異結合在血管上。
1.3.2.3呈現(xiàn)噬菌體GX系列在人胃癌和食道癌上的表達取人胃低分化腺癌或人食道鱗癌標本，石蠟包埋，切片。對于人胃低分化腺癌采用呈現(xiàn)噬菌體GX1與GX2作為一抗，對于人食道鱗癌采用GX3～GX11作為一抗，小鼠抗M13單克隆抗體作為二抗，其他程序與SP法相同，對照組織采用人肝癌組織、人血管瘤、人脾臟。觀察結果顯示GX1與GX2結合于人胃低分化腺癌血管內皮上，而GX3～GX11結合于人食管腺癌血管內皮細胞上，而在其他對照組織上無特異性結合。說明GX1，GX2呈現(xiàn)噬菌體特異結合于人胃癌血管內皮細胞上，而GX3～GX11呈現(xiàn)噬菌體特異結合于人食道鱗癌血管內皮細胞上。
1.3.3體內競爭抑制實驗以下是申請人選取實驗結果最好的GX1為例，其他的GX2～GX11同樣按照這個方法進行；
合成GX1多肽(由上海吉爾生化有限公司合成)，制備荷人胃低分化腺癌小鼠模型，方法同上。由小鼠尾靜脈注入GX1合成肽，劑量分別為12.5μg，25μg，50μg，100μg，200μg和400μg，5～15min后再從尾靜脈注射GX1噬菌體1011pfu，5min后取瘤組織，具體操作方法同上，鋪板，37℃過夜，計算藍斑數(shù)目。結果表明隨著GX1合成肽劑量的上升，GX1噬菌體的噬斑數(shù)下降，說明GX1呈現(xiàn)肽可以阻斷GX1呈現(xiàn)噬菌體與腫瘤血管的結合，說明GX1肽特異結合在腫瘤血管上。
1.3.4肽序列的氨基酸同源性分析確定測序無誤后，按下述技術方案，鑒定氨基酸的同源性。
在non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白質數(shù)據(jù)庫中，進行氨基酸序列同源性分析(Search for short，nearlyexact matches)結果表明，在現(xiàn)有的蛋白多肽庫里沒有發(fā)現(xiàn)與GX系列的環(huán)狀小肽相同的已知蛋白序列。GX1與編號為gi/44554133/gb/EAK06478.1/序列中一段結構的同源性最高，為100％，但是該序列為環(huán)境中的未知蛋白并且該序列為線性的，也并非我們實驗中獲得的環(huán)狀肽(圖2)。GX2與線性的編號為gi/19923540/ref/NP_060177.2/的人肝癌上調因子有同源性，但是人肝癌上調因子為線性，而GX2為環(huán)狀多肽(圖3)。GX3同線蟲的假象蛋白gi/7497287/pir/T19889同源性最高，該假想蛋白也屬于未明確功能和性質的蛋白(圖4)。GX4同Schizosaccharomyces pombe(fission yeast)中的假象蛋白gi/19113611/ref/NP_596819中一段結構有同源性(圖5)，但是，該蛋白仍屬線性結構，而非申請人試驗結果的環(huán)狀。GX57肽中的6個肽與環(huán)境中的未知蛋白gi/44477743/gb/EAJ54860.1/的部分序列成100％相同(圖6)，但是GX5的環(huán)狀結構卻無同源序列。GX6的7肽序列與一種可能的金屬蛋白酶gi/32473780/ref/NP_866774.1/相同(圖7)，但是該蛋白為線性結構，是可能的金屬蛋白酶，其具體功能仍不很清楚。GX7的7肽序列與編號為gi/39593478/emb/CAE61770.1/的假想蛋白中的部分氨基酸序列有100％同源性(圖8)，但是該假想蛋白仍屬于線性的未知蛋白。GX8中的6個肽與線蟲屬編號為gi/39597108/emb/CAE59335.1/的假想蛋白有100％同源(圖9)，但是，該蛋白仍屬線性結構，并且屬于未明確功能和性質的蛋白。GX9與環(huán)境中編號為gi/44043120/gb/EAG81516.1/的未知蛋白有100％同源(圖10)，但是該序列為環(huán)境中的未知蛋白并且該序列為線性的，也并非我們實驗中獲得的環(huán)狀結構。GX107肽中有6個肽與假想膜蛋白gi/29349446/ref/NP_812949.1/在氨基酸序列上有100％同源性(圖11)，但是仍為線性的假想蛋白。GX11中的6個肽與編號為gi/32488243/emb/CAE03063.1/有100％同源(圖12)，但是和前面幾個肽的情況類似，這個蛋白仍為線性的，而GX11為一環(huán)狀7肽，所以即使二者序列之間有較高的同源性，但實際上的空間結構和功能并不相同。因此，準確的說并未為這11段環(huán)狀7肽查到同源的、功能和結構一致的已知蛋白，這11段環(huán)狀7肽屬于新蛋白，并且它們同消化道腫瘤之間有明顯的關系。(見附圖2-12)2.技術效果本發(fā)明采用噬菌體隨機環(huán)7肽庫篩選人胃癌或食管癌血管特異性環(huán)肽，篩選出能與血管內皮細胞結合的高特異性結合環(huán)狀7肽GX1～GX11，經(jīng)移植瘤組織噬斑滴定，移植瘤組織和人胃癌、食管癌組織免疫組化染色，GX1合成肽與GX1呈現(xiàn)噬菌體在體內的競爭抑制實驗均顯示該系列7肽與人消化道腫瘤組織血管結合的特異性。這些環(huán)肽的發(fā)現(xiàn)將會在腫瘤血管靶向治療，腫瘤血管特異性分子標志物試劑的研制方面將具有巨大的潛在價值。
另外，編碼GX系列環(huán)肽的氨基酸序列經(jīng)同源性分析后，未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明相同的基因序列，因此本發(fā)明具有惟一性和自主的知識產(chǎn)權。
3.最佳實施方式3.1靶向藥物的構建3.1.1血管靶向性腺病毒介導siRNA的構建將本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的特異性環(huán)肽用腺病毒pAdeasy系統(tǒng)改造為特異性靶向胃癌血管內皮的基因治療載體，并借助該載體將VEGFR、Raf-1的siRNA特異性導入胃癌或食管癌血管內皮細胞，通過RNAi方式干擾胃癌或食管癌血管內皮細胞的生長信號，抑制胃癌或食管癌血管內皮細胞增殖和遷移，最終達到抑制胃癌或食管癌的目的。
3.1.2血管靶向性復合肽的構建將本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的特異性環(huán)肽同一種生物活性肽D(KLAKLAK)2連接，利用本發(fā)現(xiàn)中環(huán)肽特異性結合血管內皮細胞的能力和生物活性肽D(KLAKLAK)2選擇作用于線粒體膜的作用，使復合肽靶向破壞胃癌或食管癌的血管內皮細胞，從而達到抑制胃癌或食管癌的目的。
3.2腫瘤血管特異性分子標志物試劑盒的構建合成本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的特異性環(huán)肽，免疫Balb/c小鼠或新西蘭兔，按常規(guī)方法制備單克隆抗體，從而構建腫瘤血管特異性分子標志物的單克隆抗體試劑盒。
權利要求
1.一種人消化道腫瘤血管特異性結合環(huán)肽GX系列，其特征在于，包含11段能夠特異性結合于人消化道腫瘤血管內皮細胞上的環(huán)肽，具體氨基酸序列如下GX1 Gly Asn Ser Asn Pro Lys SerGX2 Pro His Asn Leu Thr Lys LeuGX3 Tyr Ser Phe Asn Ser Trp MetGX4 Pro Asn Pro Asn Asn Ser ThrGX5 Tyr Ser Ile Asn Asp Trp HisGX6 Leu Phe Ala Met Pro Asn SerGX7 Ser Thr Val Ala Thr Ser GlnGX8 Tyr Val Thr Pro Tyr Asp IleGX9 Ser Pro Ala Asn Leu Phe ThrGX10Pro Met Asn Ala Asp Asn LeuGX11Ser Arg His Asp Leu Asn Ser
全文摘要
本發(fā)明公開了11段人消化道腫瘤血管特異性結合環(huán)肽GX系列。本發(fā)明利用隨機噬菌體環(huán)狀7肽庫及免疫抑制小鼠腎包膜下人轉移瘤模型，成功的篩選出能與人食道鱗癌及人胃低分化腺癌血管高特異性結合的環(huán)狀7肽GX
文檔編號C07K14/435GK1580075SQ20041002613
公開日2005年2月16日 申請日期2004年5月17日 優(yōu)先權日2004年5月17日
發(fā)明者吳開春, 郅敏, 董蕾, 郝志明, 喬泰東, 丁杰, 樊代明 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學