本發(fā)明涉及一種絲素蛋白纖維支架及其制備方法，可用于軟組織、硬組織修復及藥物緩釋等再生醫(yī)學領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由于疾病和事故導致的器官或組織損傷和功能缺失的病人每年都有數(shù)百萬之多，僅美國每年需要800多萬次手術(shù)對這類病人進行救治，其經(jīng)濟花費在4000億美元以上。隨著現(xiàn)代醫(yī)學和外科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，通過組織或器官移植來修復功能損失已經(jīng)被廣泛接受，然而卻面臨著巨大的供體缺口。通過再生醫(yī)學手段體在體內(nèi)或體外形成組織或器官為受損功能的修復提供了新的治療方案。其中，組織工程支架材料的選擇及構(gòu)建成為該治療方法的關(guān)鍵之一。

蠶絲蛋白是來源于自然界的天然高分子生物材料，具有優(yōu)異的力學性質(zhì)、可控的生物降解性、易加工性，特別是其與膠原同等的生物相容性而成為理想的再生醫(yī)學支架的原材料。我國是蠶絲的主要生產(chǎn)國，蠶絲產(chǎn)量占世界產(chǎn)量的70%以上。近年來，蠶絲的研究與應用從傳統(tǒng)的紡織領(lǐng)域延伸到高新技術(shù)領(lǐng)域，如光電子與生物醫(yī)用材料，特別是作為生物醫(yī)用材料已經(jīng)取得了重要進展。

目前，制備絲素蛋白多孔支架的方法有很多，包括冷凍干燥、鹽析法、氣體發(fā)泡法、三維打印等，然而這些方法都依然存在一些難以克服的不足。例如，冷凍干燥法易形成片層結(jié)構(gòu)，不利于細胞與組織生長，盡管現(xiàn)有技術(shù)報道了一種反復進行膜溶解控制絲素蛋白自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)，進而形成多孔支架，但效率低，重復性差，并且孔壁結(jié)構(gòu)的存在直接限制細胞的遷移與相互作用，組織生長也因此受限。利用靜電紡絲技術(shù)制備的纖維支架被認為是組織工程理想的支架結(jié)構(gòu)；然而靜電紡絲技術(shù)加工復雜、產(chǎn)量低、且靜電紡纖維膜結(jié)構(gòu)致密，也不利于細胞與組織生長。

為此，克服現(xiàn)有加工技術(shù)與絲蛋白支架結(jié)構(gòu)的上述問題，開發(fā)一種制備方法，并構(gòu)建出有利于細胞與組織生長的絲素蛋白支架對絲素蛋白在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應用及再生醫(yī)學的臨床應用都具有非常重大的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種絲素蛋白纖維支架的制備方法，及由該方法制備的絲素蛋白纖維支架，具有多孔支架的大孔徑高空隙率優(yōu)點，同時具有纖維狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征，極大促進細胞生長，如細胞增殖與遷移、和組織生長，對組織工程技術(shù)臨床應用非常有利。

為達到上述目的，本發(fā)明提供一種絲素蛋白纖維支架的制備方法，包括以下步驟：

（1）蠶絲脫膠后，浸泡在酸溶液中進行分散，得到蠶絲纖維分散液；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進行冷凍處理得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入水或有機溶劑中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）將步驟（3）得到的濕態(tài)絲素蛋白纖維支架進行冷處理得到冷凍體，然后對冷凍體進行冷凍干燥即得到絲素蛋白纖維支架。

上述技術(shù)方案中，所述蠶絲為桑蠶絲、柞蠶絲、蓖麻蠶絲、天蠶絲中的一種或者幾種；所述有機溶劑為甲醇、乙醇、丙醇中的一種或幾種。本發(fā)明以酸溶液溶脹蠶絲，具有廣泛適用性，可直接溶脹桑蠶絲，特別還可以溶脹柞蠶絲、蓖麻蠶絲、天蠶絲等野蠶絲，從而獲得單種或幾種共混蠶絲纖維分散液，其中蠶絲部分可以作為粘合劑，使得纖維支架具有一定力學性能且不易散架，為豐富蠶絲制品夯實基礎。

上述技術(shù)方案中，所述酸為甲酸、三氟乙酸、氫氟酸中的一種；所述酸溶液的濃度50～99wt%。本發(fā)明以酸分散絲素蛋白纖維，而不溶解，制備的天然絲素纖維支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)以纖維為主，具有高孔隙率、高貫通率、優(yōu)良的力學性能。

上述技術(shù)方案中，所述分散處理的時間為5～30分鐘，對蠶絲具有良好分散性，結(jié)合微溶黏結(jié)作用，制備的絲素蛋白纖維支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)以纖維為主，具有高孔隙率。

上述技術(shù)方案中，所述蠶絲纖維分散液的質(zhì)量濃度為0.5～10%，由此得到的支架具有更為均勻的多孔結(jié)構(gòu)、適宜的孔隙率，更適合細胞與組織生長。

上述技術(shù)方案中，步驟（2）中，所述冷凍處理的溫度為酸溶液的冰點溫度；步驟（4）中，所述冷處理的溫度為-1～-80℃，冷凍干燥的溫度為-1～-60℃。這樣處理的優(yōu)點是兼顧能源節(jié)約與多孔結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定獲取，由此得到的多孔結(jié)構(gòu)更有利于細胞的黏附與生長，及組織長入。

本發(fā)明還公開了根據(jù)上述制備方法制備的絲素蛋白纖維支架；所述絲素蛋白纖維多孔支架由直徑為5μm～20μm的纖維組成；所述絲素蛋白纖維多孔支架的孔隙率大于60%，孔徑為50μm～2mm。

本發(fā)明的天然絲素絲蛋白多孔支架因具有三維多孔結(jié)構(gòu)，可以為細胞的粘附增殖、及組織的再生提供三維空間，并且有利于營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸，因此本發(fā)明進一步公開了上述絲素蛋白纖維支架在制備細胞與組織生長材料中的應用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明直接以蠶絲絲素纖維構(gòu)建纖維多孔材料，該制備方法利用酸對蠶絲的良好分散性及微溶黏結(jié)作用，結(jié)合處理工藝，所制備的絲素蛋白纖維支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)以纖維為主，具有高孔隙率、高貫通率、優(yōu)良的力學性能，非常有利于營養(yǎng)物質(zhì)的輸送、細胞的遷移、組織的生長，是理想的組織工程支架，并且本發(fā)明具有工藝簡單、成本低、易于批量化加工的優(yōu)點。

特別的，本發(fā)明公開的制備多孔、大孔徑絲素蛋白纖維支架的方法簡單，僅采用酸分散蠶絲，無需其他化學試劑的使用，一方面避免試劑殘留不利于生物材料體內(nèi)應用的問題，另一方面減少純化步驟與時間，可以極大地保持蠶絲纖維的天然性能并利于工業(yè)生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為實施例一獲得的濕態(tài)（左）、干態(tài)（中）絲素纖維支架的照片和掃描電鏡圖（右）；

圖2為實施例二獲得的絲素纖維支架的照片（左）和掃描電鏡圖（右）；

圖3為實施例三獲得的絲素纖維支架斷面的掃描電鏡圖；

圖4為實施例四獲得的天然絲素纖維支架斷面的掃描電鏡圖；

圖5為實施例五獲得的天然絲素纖維支架斷面的掃描電鏡圖；

圖6為實施例六支架接種骨髓間充質(zhì)干細胞后的熒光圖；

圖7為實施例六支架接種骨髓間充質(zhì)干細胞一天后的熒光圖；

圖8為實施例六支架接種骨髓間充質(zhì)干細胞五天后的熒光圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步描述：

實施例一

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分數(shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于88%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度2%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進行冷凍處理（溫度-20℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入甲醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）將步驟（3）得到的濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-20℃冷凍，然后-40℃冷凍干燥，得到絲素纖維支架。

附圖1為上述獲得的濕態(tài)（左）、干態(tài)（中）絲素纖維支架的照片和掃描電鏡圖片（右），由圖可見，本發(fā)明支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成，該纖維支架的壓縮模量約15kpa。

實施例二

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分數(shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于98%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度3%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進行冷凍處理（溫度-10℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-10℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到絲素纖維支架。

附圖2為上述獲得的絲素纖維支架的照片（左）和掃描電鏡圖（右）；由圖可見，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成，且有部分細小纖維分散于蠶絲纖維表面與纖維間，該纖維支架的壓縮模量約10kpa。

實施例三

（1）天然柞蠶絲用質(zhì)量分數(shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于98%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度5%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進行冷凍處理（溫度-30℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入丙醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-20℃冷凍，然后-80℃冷凍干燥，得到天然絲素纖維支架。

附圖3為上述獲得的絲素纖維支架斷面的掃描電鏡圖，由圖可見，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成，纖維未有明顯分纖與宏觀結(jié)構(gòu)破壞，該纖維支架的壓縮模量約100kpa。

實施例四

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分數(shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于90%三氟乙酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度4%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進行冷凍處理（溫度-80℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除三氟乙酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-196℃冷凍，然后-10℃冷凍干燥，得到天然絲素纖維支架。

附圖4為上述獲得的天然絲素纖維支架斷面的掃描電鏡圖，右圖為放大圖；由圖可見，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成，同時出現(xiàn)大量微細纖維組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)將有利于細胞的黏附與生長，該纖維支架的壓縮模量約60kpa。

實施例五

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分數(shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于60%氫氟酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度3%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進行冷凍處理（溫度-80℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除氫氟酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-100℃冷凍，然后-50℃冷凍干燥，得到天然絲素纖維支架。

附圖5為上述獲得的天然絲素纖維支架斷面的掃描電鏡圖，右圖為放大圖；由圖可見，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成，同時出現(xiàn)大量微細纖維組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)將有利于細胞的黏附與生長，該纖維支架的壓縮模量約50kpa。

實施例六

（1）天然桑蠶絲用質(zhì)量分數(shù)0.05wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于98%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度8%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進行冷凍處理（溫度-50℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-10℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到絲素纖維支架，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成。該纖維支架的壓縮模量約150kpa。

附圖6-8為上述支架接種骨髓間充質(zhì)干細胞后的熒光圖片；由圖6可見接種后細胞開始在支架黏附；1天后（圖7）細胞開始鋪展，并沿纖維方向排列；接種5天后（圖8），細胞大量增殖。細胞實驗表面，該支架具有良好的細胞生物相容性，支持細胞的黏附、鋪展與增殖等細胞生物學行為，是一種良好的生物支架。

實施例七

（1）天然蓖麻蠶絲用質(zhì)量分數(shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于98%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度5%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進行冷凍處理（溫度-70℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-20℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到絲素纖維支架，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成。該纖維支架的壓縮模量約50kpa。

實施例八

（1）天然天蠶絲用質(zhì)量分數(shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于78%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度10%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進行冷凍處理（溫度-40℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-10℃冷凍，然后-60℃冷凍干燥，得到天然絲素纖維支架，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成。該纖維支架的壓縮模量約70kpa。

實施例九

（1）天然蓖麻蠶絲用質(zhì)量分數(shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于98%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度10%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進行冷凍處理（溫度-50℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入甲醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-80℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到天然絲素纖維支架，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成。該纖維支架的壓縮模量約300kpa。

實施例十

（1）天然天蠶絲用質(zhì)量分數(shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸30min脫膠，重復3次后獲得絲素纖維；將絲素纖維分散于98%甲酸溶劑中，得到的蠶絲纖維分散液濃度6%；

（2）將蠶絲纖維分散液注入模具中進行冷凍處理（溫度-30℃）得到蠶絲纖維冷凍體；

（3）將步驟（2）的蠶絲纖維冷凍體浸入乙醇中去除甲酸，然后用去離子水浸泡洗滌得到濕態(tài)絲素蛋白纖維支架；

（4）濕態(tài)絲素蛋白纖維支架在-20℃冷凍，然后-20℃冷凍干燥，得到天然絲素纖維支架，支架內(nèi)部主要由纖維構(gòu)成。該纖維支架的壓縮模量約110kpa。