本發(fā)明涉及一種無(wú)機(jī)納米材料用于腫瘤治療，特別涉及一種SWCNT及其衍生物在破壞腫瘤微環(huán)境、抑制TGFβ信號(hào)通路、抑制腫瘤干細(xì)胞、降低腫瘤血管密度與腫瘤細(xì)胞增殖能力、增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性以及腫瘤治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤干細(xì)胞(CSC)是腫瘤組織內(nèi)一群具有干細(xì)胞樣特征的腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及惡性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。CSC對(duì)化療藥物具有高度的耐受性，能夠躲避化療藥物的殺傷。目前，臨床上常規(guī)的腫瘤治療方法化療，只能清除普通的腫瘤細(xì)胞，卻不能有效殺傷腫瘤中的CSC，這是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和治療失敗的關(guān)鍵原因。因此，迫切需要設(shè)計(jì)新的治療策略來(lái)特異性靶向并清除CSC，進(jìn)而達(dá)到最終理想的治療效果。與傳統(tǒng)的化療藥物相比，納米材料獨(dú)特的理化性質(zhì)使其具有更好的生物相容性、溶解性、靶向性、穿過(guò)血腦屏障和細(xì)胞膜的能力、更強(qiáng)的可塑性以及光熱性能等，在靶向與殺傷CSC中具有很好的應(yīng)用前景。

現(xiàn)今，納米材料常被用于藥物載體來(lái)靶向治療CSC，比如靶向CSC標(biāo)志物(CD44、CD90、CD133等)或者靶向與CSC性能相關(guān)的信號(hào)通路(TGFβ、Wnt/β-catenin、Notch等)來(lái)抑制CSC的自我更新和多向分化。然而，在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，CSC群體數(shù)量并不是一成不變的，在特定腫瘤微環(huán)境的影響下，普通的腫瘤細(xì)胞能逐漸獲得干性去分化成CSC，進(jìn)而加速腫瘤的惡性進(jìn)展，使更多的腫瘤細(xì)胞獲得化療耐受性，從而逃脫傳統(tǒng)化療對(duì)其的殺傷。因此，破壞腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境、抑制普通腫瘤細(xì)胞獲得干性可能成為更有效的治療腫瘤的方法。目前，國(guó)內(nèi)外已有實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)研究，比如Gd@C82(OH)22納米材料能抑制上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(EMT)，從而抑制乳腺上皮癌細(xì)胞獲得CSC特征，有效減少CSC數(shù)量并抑制腫瘤生長(zhǎng)。

研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中TGFβ1表達(dá)水平異常高，TGFβ1信號(hào)通路對(duì)腫瘤微環(huán)境的形成和腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。已有大量研究表明，TGFβ1是一種強(qiáng)有力的EMT誘發(fā)劑，能夠促使上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞獲得CSC特性，并與腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。骨肉瘤來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞或骨祖細(xì)胞，是一種惡性程度很高的原發(fā)性骨腫瘤。在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞不斷侵犯周圍的骨基質(zhì)，同時(shí)將骨基質(zhì)中大量的TGFβ1釋放出來(lái)，逐步形成骨肉瘤的微環(huán)境。最近的研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ1也能誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞去分化、使普通的骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變成骨肉瘤干細(xì)胞，即CSC細(xì)胞，從而加速骨肉瘤的惡性進(jìn)展。骨肉瘤患者極易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移后的患者預(yù)后極差且存活率低。目前，臨床上尚沒(méi)有靶向藥物抑制骨肉瘤的惡性進(jìn)展。因此，TGFβ1可作為治療靶點(diǎn)用于骨肉瘤微環(huán)境的調(diào)控和骨肉瘤干細(xì)胞的靶向治療。

單壁碳納米管(SWCNT)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景，比如疾病的診斷與治療、生物傳感器等。在腫瘤治療中，SWCNT被廣泛用作藥物載體，用于靶向和藥物輸送，然而其本身對(duì)癌細(xì)胞的影響以及在癌癥發(fā)展中的作用還不是很清楚。在本發(fā)明中，我們以骨肉瘤為例說(shuō)明SWCNT及其衍生物能在體外特異性抑制普通腫瘤細(xì)胞去分化形成CSC，減少腫瘤組織中CSC的數(shù)量和腫瘤微血管密度，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。同時(shí)SWCNT及其衍生物能顯著抑制TGFβ1信號(hào)通路，進(jìn)而破壞腫瘤微環(huán)境，從而達(dá)到抑制CSC的形成和治療腫瘤的目的。目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有其他關(guān)于SWCNT及其衍生物本身能特異性靶向抑制CSC和TGFβ1信號(hào)通路的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種碳納米材料SWCNT及其衍生物用于抑制腫瘤干細(xì)胞及制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，所要解決的技術(shù)問(wèn)題是合成穩(wěn)定的水相懸浮的碳納米材料SWCNT及其衍生物。與傳統(tǒng)的癌癥治療藥物相比，該材料能抑制CSC的形成，降低腫瘤組織中CSC的數(shù)量、腫瘤血管密度和腫瘤細(xì)胞增殖能力等，抑制TGFβ信號(hào)通路，破壞腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤生長(zhǎng)。該納米材料可用作CSC抑制劑用于腫瘤的治療，提高腫瘤的治療效果。

本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明提供一種SWCNT及其衍生物在特異性抑制腫瘤干細(xì)胞(CSC)方面的應(yīng)用。

另外，本發(fā)明還提供一種SWCNT及其衍生物在抑制TGFβ信號(hào)通路及破壞腫瘤微環(huán)境中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種SWCNT及其衍生物在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明實(shí)施例的應(yīng)用，所述衍生物包含SWCNT-Raw與SWCNT-COOH。

本發(fā)明實(shí)施例的應(yīng)用，所述SWCNT-Raw及SWCNT-COOH的合成方法為：

1)將SWCNT-Raw和SWCNT-COOH分別溶于超純水中，用探頭式超聲儀超聲至材料充分分散，然后視情況加入終濃度為1-6M的鹽酸；

2)在超聲清洗儀中繼續(xù)超聲至材料充分分散，通過(guò)離心分離出溶液中的納米材料沉淀，然后用超純水多次清洗沉淀，最后用少量超純水重懸，利用超聲清洗儀超聲法將其分散于水中，最終獲得穩(wěn)定懸浮于水中的納米材料，且濃度約為100-150μg/mL。

本發(fā)明實(shí)施例的應(yīng)用，包括：

1)抑制CSC形成的方法，發(fā)現(xiàn)SWCNT及其衍生物能顯著抑制CSC的形成；

2)SWCNT及其衍生物能顯著提高腫瘤微環(huán)境內(nèi)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，促進(jìn)化療藥物對(duì)其的殺傷；

3)SWCNT及其衍生物能顯著降低腫瘤組織內(nèi)的CSC數(shù)量、腫瘤微血管密度和腫瘤細(xì)胞的增殖能力等，并抑制腫瘤的生長(zhǎng)；

4)SWCNT及其衍生物能顯著抑制TGFβ信號(hào)通路及下游相關(guān)的基因的表達(dá)，進(jìn)而破壞CSC賴以存在的腫瘤微環(huán)境。

借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1)本發(fā)明中所用的碳納米材料制備條件和步驟簡(jiǎn)單，易于操作，具有產(chǎn)業(yè)化合成的前景；

2)本發(fā)明中所制備的碳納米材料具有較高的生物相容性，且能特異性抑制CSC的形成；

3)本發(fā)明中所制備的碳納米材料能顯著抑制腫瘤組織內(nèi)CSC，降低腫瘤血管密度和腫瘤細(xì)胞增殖能力等，抑制腫瘤生長(zhǎng)；

4)本發(fā)明中所制備的碳納米材料能有效抑制TGFβ信號(hào)通路，破壞腫瘤微環(huán)境，可有望作為特異性靶向抑制CSC和TGFβ信號(hào)通路的試劑，用于腫瘤治療。

附圖說(shuō)明

圖1是水相SWCNT及其衍生物水溶液(A)和TEM表征(B)。

圖2是納米材料對(duì)人成纖維細(xì)胞(A)和普通腫瘤細(xì)胞(B)的CCK8結(jié)果。

圖3是納米材料進(jìn)入腫瘤細(xì)胞生物電鏡圖片，綠色箭頭所指的為細(xì)胞內(nèi)的納米材料。

圖4是納米材料抑制腫瘤細(xì)胞去分化形成CSC球囊(A)和CSC標(biāo)志物蛋白表達(dá)(B)，降低細(xì)胞克隆形成能力(C)和脂肪誘導(dǎo)分化能力(D)，不影響化療藥物對(duì)普通腫瘤細(xì)胞的殺傷(E)，增加化療藥物對(duì)微環(huán)境中藥物耐受性腫瘤細(xì)胞的殺傷(F)。

圖5是低氧和酸性條件下納米材料對(duì)腫瘤細(xì)胞去分化的形成CSC球囊的影響。

圖6是納米材料對(duì)其他腫瘤細(xì)胞系去分化形成CSC球囊的影響。

圖7是納米材料給藥時(shí)間和次數(shù)(A)，對(duì)腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞增殖(Ki-67表達(dá)水平)和腫瘤血管密度(CD31)的影響(B)，以及降低組織內(nèi)CSC能力(D)。

圖8是納米材料對(duì)腫瘤細(xì)胞中TGFβ信號(hào)通路中TGFβ受體TGFβRI和下游smad2磷酸化水平(A)以及下游與CSC性能相關(guān)基因的表達(dá)的影響(B)，納米材料對(duì)腫瘤組織中TGFβRI和下游smad2磷酸化水平(C)以及下游基因的表達(dá)的影響(D)。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體較佳實(shí)施例結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不僅限于以下的實(shí)施例。

本發(fā)明的一種碳納米材料SWCNT及其衍生物包含水相SWCNT-Raw和SWCNT-COOH，MWCNT為對(duì)照材料，SWCNT-Raw，SWCNT-COOH以及MWCNT的合成方法為：

1)將5-10mg SWCNT-Raw，SWCNT-COOH和MWCNT分別溶于超純水10-20mL中，用探頭式超聲儀超聲分散后，加入終濃度為1-6M的鹽酸；

2)在超聲清洗儀中繼續(xù)超聲分散后，通過(guò)離心分離出溶液中的納米材料沉淀，然后用超純水多次清洗沉淀，最后用超純水重懸，利用超聲清洗儀超聲法將其分散于水中，最終獲得穩(wěn)定懸浮于水中的納米材料，且濃度約為100-150μg/mL。

使用透射電子顯微鏡(TEM)方法表征本發(fā)明中制備的納米顆粒；細(xì)胞CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)材料的生物學(xué)相容性；通過(guò)細(xì)胞自我更新、細(xì)胞免疫熒光、脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化、化療藥物敏感性等方法檢測(cè)該納米材料抑制腫瘤細(xì)胞去分化形成CSC能力；利用小鼠腫瘤模型、腫瘤組織免疫組化、腫瘤組織免疫熒光等方法分析該納米材料抑制腫瘤組織中CSC和對(duì)腫瘤的治療效果；通過(guò)RT-PCR、Western blot等試驗(yàn)研究該納米材料對(duì)TGFβ1信號(hào)通路的抑制作用。

具體檢測(cè)結(jié)果分別如下：

1)合成納米材料的TEM表征

合成的懸浮于水中的納米材料的TEM圖片(圖1)表明，分散于水中的SWCNT-Raw與SWCNT-COOH納米顆粒長(zhǎng)度為1-3μm，外徑尺寸為1-2nm。

2)生物相容性分析

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0-10μg/mL的SWCNT-Raw及SWCNT-COOH處理的人成纖維細(xì)胞和普通腫瘤細(xì)胞均保持較高的存活率(圖2)，說(shuō)明該納米材料具有很好的生物相容性。

3)納米材料進(jìn)細(xì)胞分析

細(xì)胞生物電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SWCNT-Raw及SWCNT-COOH能進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)(圖3)。

4)腫瘤細(xì)胞去分化形成CSC檢測(cè)

利用TGFβ1誘導(dǎo)無(wú)血清培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞(MNNG/HOS)去分化形成CSC，誘導(dǎo)過(guò)程中貼壁細(xì)胞會(huì)逐漸轉(zhuǎn)變并形成CSC球囊。SWCNT(SWCNT-Raw和SWCNT-COOH)能顯著抑制CSC球囊的形成并抑制CSC標(biāo)志物的表達(dá)，且SWCNT處理的細(xì)胞自我更新能力(克隆形成能力)、分化為脂肪細(xì)胞的能力以及化療藥物敏感性與普通腫瘤細(xì)胞相似(圖4)，表明SWCNT有效抑制了TGFβ1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞去分化形成CSC過(guò)程。

在低氧或者酸性微環(huán)境中，SWCNT仍然能抑制TGFβ1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞去分化形成CSC過(guò)程(圖5)。在其他腫瘤細(xì)胞系(Saos-2和MG63)中，SWCNT有同樣的抑制效果(圖6)。對(duì)照材料MWCNT則對(duì)去分化過(guò)程沒(méi)有影響。

5)體內(nèi)腫瘤模型實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

將MNNG/HOS細(xì)胞肌肉注射至小鼠腿部，待腫瘤直徑大小在1cm左右，將SWCNT直接注射到腫瘤組織內(nèi)，處理31天后，將腫瘤組織取出并進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。SWCNT能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并降低組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖、腫瘤微血管密度和CSC群體數(shù)量(圖7)。

6)TGFβ1信號(hào)通路分析

體外細(xì)胞培養(yǎng)和TGFβ1誘導(dǎo)CSC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SWCNT能顯著抑制TGFβ1信號(hào)通路過(guò)程和下游基因的表達(dá)水平(圖8)。體內(nèi)腫瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明SWCNT能抑制腫瘤組織中TGFβ1信號(hào)通路過(guò)程和下游基因的表達(dá)水平(圖8)。

實(shí)施例1

將SWCNT-Raw，SWCNT-COOH和MWCNT 5-10mg分別溶于超純水中，用探頭式超聲儀超聲分散后，加入終濃度為1-6M的鹽酸。在超聲清洗儀中繼續(xù)超聲分散后，通過(guò)離心分離出溶液中的納米材料沉淀，然后用超純水多次清洗沉淀，最后用少量超純水重懸，利用超聲清洗儀超聲法將其分散于水中，最終獲得穩(wěn)定懸浮于水中的納米材料，且濃度約為100-150μg/mL。

將骨肉瘤細(xì)胞MNNG/HOS培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分別加入5-10μg/mL SWCNT-Raw、SWCNT-COOH以及MWCNT孵育24小時(shí)，收集細(xì)胞并將細(xì)胞置于2％戊二醛中放置過(guò)夜。隨后，細(xì)胞經(jīng)1％的四氧化三鋨后固定1小時(shí)，梯度酒精脫水后制備超薄電鏡切片。超薄切片經(jīng)乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，置于透射電鏡下觀察。如圖3所示，SWCNT-Raw、SWCNT-COOH以及MWCNT均可在MNNG/HOS細(xì)胞質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)(綠色箭頭所示)，這說(shuō)明三種納米材料都可以很好的被腫瘤細(xì)胞所吸收。

實(shí)施例2

根據(jù)已有的研究報(bào)道，普通的骨肉瘤細(xì)胞能在TGFβ1的作用下發(fā)生去分化，形成CSC。我們以骨肉瘤細(xì)胞MNNG/HOS為例，說(shuō)明SWCNT及其衍生物對(duì)骨肉瘤細(xì)胞去分化及CSC形成的抑制作用。將MNNG/HOS培養(yǎng)在含有4ng/mLTGFβ1的無(wú)血清培養(yǎng)基中，同時(shí)分別添加不同濃度的SWCNT-Raw、SWCNT-COOH以及MWCNT進(jìn)行處理。如圖4A所示，5天后，SWCNT-Raw和SWCNT-COOH能夠顯著抑制球囊樣CSC的形成，并且這種抑制作用隨著SWCNT納米材料濃度的升高而增強(qiáng)。而作為對(duì)照材料的MWCNT則沒(méi)能顯示出對(duì)骨肉瘤細(xì)胞去分化以及CSC形成的抑制作用。如圖4B所示，與對(duì)照組(Control)相比，SWCNT-COOH能夠顯著抑制MNNG/HOS細(xì)胞表達(dá)骨肉瘤CSC的標(biāo)志基因c-Kit、stro-1、TRA-1-60、SSEA1和SSEA4。如圖4C所示，TGFβ1處理后MNNG/HOS細(xì)胞的克隆形成能力顯著強(qiáng)于處理前的普通MNNG/HOS細(xì)胞(Adherent)，但是加入SWCNT-COOH后，TGFβ1對(duì)MNNG/HOS細(xì)胞克隆形成能力的提升作用被顯著抑制。同時(shí)，也顯著抑制了TGFβ1處理后的MNNG/HOS細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的能力(圖4D)。這些結(jié)果說(shuō)明，SWCNT及其衍生物SWCNT-COOH能夠有效抑制TGFβ1作用的MNNG/HOS細(xì)胞獲得CSC特性，比如CSC表面標(biāo)志基因的表達(dá)、自我更新能力以及多向分化能力。

將SWCNT-Raw、SWCNT-COOH或者相同體積的超純水(對(duì)照)分別與不同劑量的化療藥物阿霉素(adriamycin)共同處理貼壁培養(yǎng)的MNNG/HOS細(xì)胞24小時(shí)后，利用CCK8試劑分析活細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果如圖4E所示，SWCNT及其衍生材料并不影響普通MNNG/HOS細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。隨后，將SWCNT-Raw與TGFβ1、SWCNT-COOH與TGFβ1、TGFβ1或者相同體積的超純水(對(duì)照)處理無(wú)血清培養(yǎng)的MNNG/HOS細(xì)胞，5d后TGFβ1能促使細(xì)胞去分化形成CSC，同時(shí)在各組加入不同劑量的化療藥物。處理24小時(shí)后，利用CCK8試劑分析活細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果如圖4F所示，與對(duì)照組(Control)相比，TGFβ1使MNNG/HOS細(xì)胞去分化形成CSC后，大大提升了細(xì)胞對(duì)化療藥物阿霉素的耐受性，而SWCNT及其衍生物顯著降低了TGFβ1誘導(dǎo)的MNNG/HOS細(xì)胞的化療耐受性。這些結(jié)果說(shuō)明，SWCNT及其衍生材料能夠破壞骨肉瘤細(xì)胞的微環(huán)境，從而提升腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，增強(qiáng)治療效果。

實(shí)施例3

將MNNG/HOS細(xì)胞培養(yǎng)在含有TGFβ1的pH 6.4無(wú)血清培養(yǎng)基中模擬腫瘤內(nèi)酸性的微環(huán)境；將MNNG/HOS細(xì)胞培養(yǎng)在含有TGFβ1的PH7.4無(wú)血清培養(yǎng)基中的同時(shí)培養(yǎng)在3％O₂的低氧培養(yǎng)箱中，模擬腫瘤內(nèi)低氧的微環(huán)境；在培養(yǎng)基中分別加入SWCNT-Raw、SWCNT-COOH進(jìn)行處理，對(duì)照組(Control)中加入相同體積的超純水。3天或5天后，如圖5所示，與對(duì)照組(Control)相比，SWCNT及其衍生物在酸性和低氧兩種條件下均能夠顯著抑制MNNG/HOS細(xì)胞去分化形成球囊狀CSC。這說(shuō)明，SWCNT的對(duì)腫瘤細(xì)胞去分化和腫瘤干細(xì)胞的形成的抑制作用不僅僅限于正常條件下，也適用于腫瘤內(nèi)酸性和低氧的極端微環(huán)境。

實(shí)施例4

將骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2、MG-63分別培養(yǎng)在含有TGFβ1的無(wú)血清培養(yǎng)基中，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)組中分別添加SWCNT-Raw、SWCNT-COOH進(jìn)行處理，對(duì)照組(Control)中加入相同體積的超純水。5天后，如圖6所示，與對(duì)照組(Control)相比，SWCNT及其衍生物在能夠顯著抑制Saos-2與MG-63細(xì)胞去分化形成球囊狀CSC。這說(shuō)明，SWCNT及其衍生材料能夠抑制多種骨肉瘤細(xì)胞去分化，對(duì)骨肉瘤細(xì)胞去分化形成CSC的抑制作用具有普遍適用性。

實(shí)施例5

將4×10⁶MNNG/HOS細(xì)胞接種在4～5周大小的BALB/c裸鼠腿部肌肉中，使其成瘤。待腫瘤最大直徑達(dá)1.0cm左右時(shí)，按照?qǐng)D7A所示的時(shí)間軸，將6μg SWCNT-COOH、MWCNT與超純水(Control)分別直接注射至腫瘤內(nèi)。每隔一天對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，并測(cè)量小鼠腫瘤的體積。結(jié)果如圖7B所示，SWCNT-COOH組小鼠腫瘤的體積增長(zhǎng)明顯小于MWCNT組和超純水對(duì)照組(圖8C)，而MWCNT組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。這說(shuō)明SWCNT-COOH能夠特異性抑制小鼠體內(nèi)骨肉瘤的生長(zhǎng)。

隨后，我們對(duì)小鼠腫瘤組織進(jìn)行HE染色和免疫組化分析，結(jié)果如圖7C所示，SWCNT-COOH處理組腫瘤組織內(nèi)壞死區(qū)周圍CD31⁺血管(綠色箭頭)密度顯著低于MWCNT組和超純水對(duì)照組，同時(shí)顯著降低了細(xì)胞增殖標(biāo)志基因Ki67的表達(dá)。更為重要的是，SWCNT-COOH處理組腫瘤組織內(nèi)壞死區(qū)周圍CSC表面標(biāo)志基因c-Kit、stro-1、TRA-1-60、SSEA1和SSEA4的表達(dá)顯著降低(圖7D)，這說(shuō)明SWCNT-COOH顯著降低了腫瘤組織干細(xì)胞池內(nèi)CSC的數(shù)量。

實(shí)施例6

為了進(jìn)一步闡明SWCNT及其衍生物對(duì)骨肉瘤微環(huán)境中TGFβ1信號(hào)通路的影響，我們將MNNG/HOS細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中，并進(jìn)行以下處理：

1)添加相同體積超純水，2)添加TGFβ1和相同體積超純水，3)添加TGFβ1和SWCNT-COOH，4)添加TGFβ1和SWCNT-Raw，5)添加TGFβ1和MWCNT，24小時(shí)后，收集細(xì)胞采用western blot的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)TGFβ1受體TGFβR1以及下游效應(yīng)分子Smad2的磷酸化活性。

如圖8A所示，SWCNT及其衍生物SWCNT-COOH顯著降低了TGFβR1和Smad2的磷酸化活性。此外，我們進(jìn)一步分析了TGFβ1信號(hào)通路下游與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和干細(xì)胞特性密切相關(guān)的基因Hey1、Snail1和Sanil2的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示(圖8B)，SWCNT及其衍生物SWCNT-COOH顯著降低了MNNG/HOS細(xì)胞中TGFβ1誘導(dǎo)的Hey1、Snail1和Sanil2的表達(dá)。隨后，我們進(jìn)一步分析了SWCNT在體內(nèi)對(duì)TGFβ1信號(hào)通路活性的影響。將SWCNT-COOH、MWCNT以及超純水處理后的小鼠腫瘤組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，SWCNT-COOH顯著降低了腫瘤組織中TGFβR1和Smad2的磷酸化活性(圖8C)，且TGFβ1信號(hào)通路下游與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和干細(xì)胞特性密切相關(guān)的基因Hey1、Snail1和Sanil2的表達(dá)也顯著降低(圖8D)。而對(duì)照材料MWCNT則不會(huì)影響TGFβ1受體及其下游效應(yīng)分子、靶基因的表達(dá)。這說(shuō)明，SWCNT-COOH能特異性地破壞骨肉瘤細(xì)胞的微環(huán)境，抑制腫瘤細(xì)胞中TGFβ1信號(hào)通路的活性。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，故凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾,均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。