本發(fā)明屬于免疫學(xué)、腫瘤微環(huán)境和腫瘤免疫治療學(xué)領(lǐng)域，涉及DC-CIK(樹突狀細(xì)胞活化的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞)細(xì)胞和抗PD-1(程序性死亡受體1)抗體組合物的用途，具體涉及DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物用于制備免疫藥物的用途。

背景技術(shù)：

隨著工業(yè)化的發(fā)展，環(huán)境污染的加重，以及吸煙、不良生活和飲食習(xí)慣等外界因素的作用，腫瘤在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率逐年增高，已成為我國城市居民的首位死亡原因。

近年來，由于手術(shù)、化療、放療和免疫治療等綜合治療手段的發(fā)展，腫瘤已漸漸成為一種可控性疾病。尤其是免疫治療被認(rèn)為是一種能徹底治愈腫瘤的終極方法。Science雜志于2013年將“腫瘤免疫治療”評為當(dāng)年十大科學(xué)突破，并在2014年繼續(xù)將“腫瘤免疫治療”列為2015年最值得關(guān)注的領(lǐng)域之一。而在腫瘤免疫治療領(lǐng)域，免疫檢查點(diǎn)阻斷劑：抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體和抗CTLA-4抗體在臨床腫瘤免疫治療中的應(yīng)用最值得關(guān)注，它們顯著延長了晚期惡性黑色素瘤、肺癌和結(jié)腸癌等患者的生存期。免疫檢查點(diǎn)阻斷劑主要是通過阻斷腫瘤組織內(nèi)T細(xì)胞抑制性信號通路，從而使T細(xì)胞持續(xù)性活化，達(dá)到殺傷腫瘤的目的。目前FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了抗CTLA-4和抗PD-1抗體用于臨床治療晚期惡性黑色素瘤和肺癌等腫瘤。然而，在實(shí)際臨床應(yīng)用過程中，免疫檢查點(diǎn)阻斷劑也受到一些挑戰(zhàn)：一是由于免疫檢查點(diǎn)阻斷劑是通過阻斷機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答的“剎車系統(tǒng)”，誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的持續(xù)攻擊，因而患者應(yīng)用后常產(chǎn)生較強(qiáng)的自身免疫反應(yīng)，從而引起較強(qiáng)的毒副作用；二是需要足量足療程的應(yīng)用，患者難以承受高額的治療費(fèi)用。

而作為一種高效低毒的過繼性細(xì)胞免疫治療方法，CIK細(xì)胞和DC-CIK細(xì)胞在多種血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體腫瘤中均顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤作用。CIK細(xì)胞是一種由外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)的多克隆T細(xì)胞，主要以CD3+CD56+、CD3+CD8+、和CD3-CD56+細(xì)胞亞群為主，其中CD3+CD56+細(xì)胞亞群是其主要活性細(xì)胞群，通過MHC非限制性的NK細(xì)胞樣的作用殺傷腫瘤細(xì)胞。DC-CIK細(xì)胞是在CIK細(xì)胞培養(yǎng)到一定階段，與自體或異體DC細(xì)胞混合培養(yǎng)后獲得的一群異質(zhì)性T細(xì)胞，因其含有更高水平的CD3+CD8+和CD3+CD56+細(xì)胞亞群，并具有更強(qiáng)的IFN-γ分泌能力，所以DC-CIK細(xì)胞的體內(nèi)外殺傷腫瘤細(xì)胞的能力顯著強(qiáng)于CIK細(xì)胞。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞在肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、宮頸癌、腎癌和白血病等多種腫瘤中有治療作用，能改善患者的生存質(zhì)量，提高患者的生存時(shí)間。與CIK細(xì)胞相比，DC-CIK細(xì)胞由于其制備過程較前者復(fù)雜，生產(chǎn)成本較高，因而目前有關(guān)DC-CIK細(xì)胞的臨床研究相對較少。目前的研究證實(shí)，腫瘤患者常規(guī)治療后，繼續(xù)接受CIK細(xì)胞和DC-CIK過繼性細(xì)胞免疫治療，僅部分患者能從中獲益，而且臨床緩解力很低。因此，需要開展新的免疫治療方法的臨床研究以進(jìn)一步提高腫瘤患者的治療效果。

目前，已有部分研究報(bào)道將免疫檢查點(diǎn)阻斷劑與過繼性細(xì)胞免疫治療聯(lián)合應(yīng)用提高CIK細(xì)胞殺傷能力的方法。例如，Poh等人在體外用細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)證實(shí)，阻斷KIR、LAG-3和PD-1等免疫檢查點(diǎn)后，CIK細(xì)胞對急性髓性細(xì)胞白血病細(xì)胞的殺傷能力增強(qiáng)；但這種殺傷能力增強(qiáng)的作用在另外一個(gè)免疫檢查點(diǎn)CTLA-4阻斷后沒有觀察到(Poh SL,et al.Cancer ImmunolImmunother.2016；65(5):525-36)。同樣，Dai等人也發(fā)現(xiàn)阻斷PD-1后，CIK細(xì)胞對胃癌細(xì)胞的殺傷能力顯著增強(qiáng)(Dai C,et al.Oncotarget.2016；7(9):10332-44)。由于與CIK細(xì)胞在細(xì)胞亞群分布和細(xì)胞因子分泌等諸多不同，目前尚無研究報(bào)道DC-CIK細(xì)胞與免疫檢查點(diǎn)阻斷劑聯(lián)用的治療作用，也無相關(guān)研究報(bào)道DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物在人體應(yīng)用的具體方法，治療效果和毒副作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物的用途。

本發(fā)明所述的用途是：DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物用于制備治療癌癥或延緩癌癥進(jìn)展的免疫藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明所述的用途的進(jìn)一步特征，所述免疫藥物含有1-1.5×10¹⁰個(gè)DC-CIK細(xì)胞與10mg抗PD-1抗體。

根據(jù)本發(fā)明所述的用途的進(jìn)一步特征，所述免疫藥物在輸入人體前在37℃恒溫箱孵育30分鐘。

優(yōu)選地，所述的癌癥包括：肝癌、腎癌、結(jié)直腸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌或鼻咽癌等。

優(yōu)選地，所述的癌癥是處于中晚期階段。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種用于治療癌癥或延緩癌癥進(jìn)展的聯(lián)合免疫組合物。

本發(fā)明所述的用于治療癌癥或延緩癌癥進(jìn)展的聯(lián)合免疫組合物是由有效劑量的DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組成。

根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物的進(jìn)一步特征，所述組合物含有1-1.5×10¹⁰個(gè)DC-CIK細(xì)胞與10mg抗PD-1抗體。

根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物的進(jìn)一步特征，所述DC-CIK細(xì)胞與抗PD-1抗體在組合后在37℃恒溫箱孵育30分鐘。

優(yōu)選地，所述的癌癥包括：肝癌、腎癌、結(jié)直腸癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌或鼻咽癌等。

優(yōu)選地，所述的癌癥是處于中晚期階段。

本發(fā)明的有益效果在于：DC-CIK細(xì)胞具有增強(qiáng)的活化、增殖和/或細(xì)胞裂解活性，雖然DC-CIK細(xì)胞具有殺傷腫瘤細(xì)胞的活性，但由于DC-CIK細(xì)胞可表達(dá)PD-1等抑制性分子，回輸?shù)綑C(jī)體內(nèi)后，與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1分子作用，降低了DC-CIK細(xì)胞的殺傷活性，限制了它們治療腫瘤的療效。而在本發(fā)明所述的組合物中，DC-CIK細(xì)胞經(jīng)抗PD-1抗體處理后再回輸?shù)襟w內(nèi)，經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)：顯著增強(qiáng)了DC-CIK細(xì)胞殺傷腫瘤的活性，提供其治療腫瘤的療效。在一些實(shí)施方案中，腫瘤患者獲得明顯的療效，出現(xiàn)腫瘤消失，部分反應(yīng)或疾病穩(wěn)定。

附圖說明

圖1是DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療方案。(A)根據(jù)入組標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，37個(gè)晚期癌癥患者符合入組條件，入組接受DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療，其中6人因失訪脫落，最終有31人可以進(jìn)行進(jìn)一步的臨床評價(jià)。(B)開始接受聯(lián)合免疫治療前1個(gè)月，患者停止使用所有其他腫瘤特異性治療，開始治療前14天抽血進(jìn)行DC-CIK細(xì)胞制備，回輸當(dāng)天DC-CIK細(xì)胞與抗PD-1抗體在37℃恒溫箱孵育30分鐘后，靜脈回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，每個(gè)患者至少進(jìn)行8個(gè)療程的聯(lián)合免疫治療，前4個(gè)療程為每周1次，后4個(gè)療程為2周1次，部分患者在療程結(jié)束后可以繼續(xù)接受聯(lián)合免疫組合物治療，直至腫瘤進(jìn)展。

圖2顯示入組患者臨床基本特征?？稍u價(jià)的31例癌癥患者中，有24位是男性，7位女性，中位年齡是52歲(31-71歲)。治療的癌癥包括9例肝癌、8例腎癌、6例結(jié)直腸癌、3例肺癌、2例膀胱癌，乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌各1例。這些患者均在手術(shù)、化療、放療等綜合治療后失敗，開始接受聯(lián)合免疫治療，接受聯(lián)合免疫組合物治療的次數(shù)至少8次，最多26次，中位的治療次數(shù)為12次。

圖3顯示DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療晚期腫瘤患者的臨床效果。(A)31例患者接受DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療后，按照RECIST評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，比較靶病灶較基線水平的變化。(B)患者的總生存和無疾病進(jìn)展生存時(shí)間。(C)患者接受DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療后，1/31例獲得完全緩解，7/31例患者獲得部分緩解，疾病有效率達(dá)到22.5％；總共有20/31例患者疾病無進(jìn)展，疾病控制率達(dá)到64.5％。

圖4顯示DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療前后病灶大小。病例1是一例肝癌患者接受聯(lián)合免疫治療，肝內(nèi)病灶消失；病例2是一例腎癌患者肺轉(zhuǎn)移病灶，接受聯(lián)合免疫治療后，肺內(nèi)大部分病灶消失，剩余病灶明顯縮小。

圖5顯示DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療晚期腫瘤患者的毒副作用?；颊呓邮苈?lián)合免疫治療，僅2人出現(xiàn)了3或4級毒性反應(yīng)，說明該方法安全性好。

圖6顯示體外實(shí)驗(yàn)分析DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物的治療作用機(jī)制。(A)制備的DC-CIK細(xì)胞表型檢測。(B)DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物對原代腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。(C)原代腫瘤細(xì)胞殺傷前后PD-L1表達(dá)情況。(D)殺傷前后DC-CIK細(xì)胞分泌IFN-γ的水平。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述的將DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物用于制備治療癌癥或延緩癌癥進(jìn)展的免疫藥物的實(shí)驗(yàn)步驟如下。

入組常規(guī)治療失敗經(jīng)病理確診的晚期癌癥患者，并在開始接受聯(lián)合免疫治療前1個(gè)月停用所有其他特異性腫瘤治療，從治療前14天開始抽取患者外周血，用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，采用Quanta-007無血清培養(yǎng)基懸浮分離的PBMC，以1×10⁸/ml的數(shù)量鋪于75cm²的培養(yǎng)瓶中，置于CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1小時(shí)。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，吸出未貼壁的淋巴細(xì)胞，置于新的培養(yǎng)瓶中，加入1000U/ml IFN-γ培養(yǎng)24小時(shí)，第2天加入100ng/ml OKT、1ng/ml IL-1α和1000U/ml IL-2繼續(xù)培養(yǎng)，隔天加入含IL-2的新鮮培養(yǎng)基。貼壁細(xì)胞加入含1000U/ml GM-CSF，400U/ml IL-4以及Cellgro無血清DC培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。隔天全量補(bǔ)新鮮培養(yǎng)液一次，第5天收獲未成熟DC細(xì)胞(iDC)，加入OK-432(0.1KE/ml)和IFN-γ(1000U/ml)培養(yǎng)24小時(shí)后，即可獲得成熟的DC細(xì)胞。第7天將成熟的DC細(xì)胞與上述CIK細(xì)胞按照1:20的比例混合培養(yǎng)7天，即可獲得DC-CIK細(xì)胞。經(jīng)離心、洗滌后DC-CIK細(xì)胞，用含10mg抗PD-1抗體的200ml的生理鹽水重懸，孵育30分鐘后，將DC-CIK細(xì)胞經(jīng)靜脈回輸給患者。患者至少接受8個(gè)療程的聯(lián)合免疫組合物治療，前4個(gè)療程為每周1次，后4個(gè)療程為2周1次，若患者腫瘤穩(wěn)定可以繼續(xù)接受該方案治療，直至腫瘤進(jìn)展。

本發(fā)明入組了37個(gè)晚期癌癥患者，其中6人由于失訪脫落，在接受聯(lián)合免疫組合物治療的31人中，按照RECIST評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，有1人獲得完全緩解，6人獲得部分緩解，13人獲得疾病穩(wěn)定，總的有效率達(dá)到22.5％，疾病控制率為64.5％，中位總生存時(shí)間為288天，中位無進(jìn)展生存時(shí)間為162天。只有2人出現(xiàn)3或4級不良反應(yīng)，分別是發(fā)熱和白細(xì)胞減少。這些結(jié)果說明本發(fā)明所述的聯(lián)合免疫組合物治療方法，能顯著提高疾病控制率，延長晚期癌癥患者生成時(shí)間，與單獨(dú)使用抗PD-1抗體(按美國上市的抗PD-1抗體的使用說明：腫瘤患者按2mg/kg體重使用，通常一次用量超過100mg)相比，具有用量少(每次10mg)，副作用小，更好的安全性和有效性。

實(shí)施例1：臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

本實(shí)施例開展的是I期單臂的前瞻性臨床試驗(yàn)研究，有關(guān)病例選擇了常規(guī)治療(手術(shù)、放化療、靶向治療)后進(jìn)展的晚期難治性惡性腫瘤患者，觀察用DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療這些患者臨床應(yīng)用的安全性、可行性和有效性。

(一)研究對象的納入：

1)入選標(biāo)準(zhǔn):

①晚期難治性惡性腫瘤患者，包括原發(fā)性肝細(xì)胞癌、腎透明細(xì)胞癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等；②年齡18-75歲；③預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月；④ECOG評分0或1分；⑤心肺肝腎功能正常；⑥充足的骨髓儲(chǔ)備能力及凝血酶原正常；⑦育齡婦女在給藥開始前尿妊娠試驗(yàn)陰性，并同意在試驗(yàn)期間直至最后一次隨訪采取有效的避孕措施者；⑧按照RECIST標(biāo)準(zhǔn)有可評價(jià)病灶；⑨自愿參加本實(shí)驗(yàn)并簽署知情同意書。

2)排除標(biāo)準(zhǔn)：

①使用CTLA-4或PD-1/PD-L1阻斷劑治療過的患者；②年齡<18或>75歲；③妊娠期或哺乳期婦女，處于生育期而未采取有效避孕措施者；④有嚴(yán)重心、腦血管疾病，不能控制的高血壓和糖尿病、腎功能不全或衰竭者；⑤HIV陽性或其它免疫缺陷疾??；⑥有自身免疫性疾病患者；⑦有器官移植史的患者在4周內(nèi)使用過大劑量糖皮質(zhì)激素或其它免疫抑制劑的患者；⑧有明確感染或者發(fā)熱的患者；⑨T細(xì)胞淋巴瘤、骨髓瘤患者。

3)退出標(biāo)準(zhǔn)：

①醫(yī)師根據(jù)患者情況認(rèn)為終止治療對患者有益；②患者主動(dòng)要求退出或未按研究計(jì)劃實(shí)施；③試驗(yàn)期間需要進(jìn)行本方案以外的其它化療、手術(shù)治療或試驗(yàn)性藥物治療；④發(fā)生嚴(yán)重不良事件，并發(fā)癥或特殊生理變化，不宜接受繼續(xù)治療。

(二)治療方案：

用DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療前一個(gè)月，入組的患者停止所有腫瘤相關(guān)治療，制備的DC-CIK細(xì)胞與抗PD-1抗體在37℃恒溫箱內(nèi)孵育30分鐘后回輸，每周一次，至少回輸4次為前一階段治療；完成后進(jìn)行一次評估，如果患者有效或穩(wěn)定，可考慮進(jìn)行第2個(gè)階段的維持治療，即2周一次的方案，共4次；完成第8個(gè)療程后，經(jīng)評估，如果病情穩(wěn)定或有療效，可繼續(xù)考慮2周一次的維持治療，并每3個(gè)月進(jìn)行臨床評估。

(三)結(jié)果分析：

1)患者納入及基本臨床資料分析：

參見圖1A所示，患者納入分析結(jié)果顯示，臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)中共納入了37例晚期難治性惡性腫瘤患者，進(jìn)行DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療后有6例患者失訪，最終剩余31例患者進(jìn)行后續(xù)分析研究。如圖2所示，31例患者中包括男性24例，女性7例。其中原發(fā)性肝細(xì)胞癌9例、腎透明細(xì)胞癌8例、大腸癌6例、非小細(xì)胞肺癌3例、膀胱癌2例，以及乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌各1例。

2)患者治療方案設(shè)計(jì)結(jié)果：

參見圖1B所示，研究納入的患者按照設(shè)計(jì)的治療方案進(jìn)行DC-CIK細(xì)胞和抗P D-1抗體組合物治療。圖2的分析結(jié)果顯示，31例患者的治療至少都達(dá)到一個(gè)療程(至少回輸8次)，前4個(gè)療程為每周1次，后4個(gè)療程為2周1次，回輸次數(shù)范圍是8-26次，中位回輸次數(shù)為12次。

實(shí)施例2：DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療癌癥的具體方法

確定研究對象后，本實(shí)施例將抽取患者外周血分離PBMC，進(jìn)行DC-CIK細(xì)胞的培養(yǎng)，與抗PD-1抗體共孵育后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)進(jìn)行治療。

(一)材料和方法：

1)DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物的制備

認(rèn)真核對抽血物品和患者相關(guān)信息后，抽取患者外周血50ml，800g×8min離心后，收集自體血漿，56℃水浴滅活30min，放置4℃15min后，800g×8min，取上清血漿(約20ml)待用。在超凈工作臺(tái)正常工作狀態(tài)下，將離心收集后的外周血細(xì)胞用0.9％注射用生理鹽水稀釋至60ml，用2支一次性50ml滅菌離心管，貼上標(biāo)簽，標(biāo)明患者姓名、性別、年齡和住院號等相關(guān)信息，分別加入20ml淋巴細(xì)胞分離液，用密度梯度離心法分離獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。

采用Quanta-007無血清培養(yǎng)基懸浮分離的PBMC，以1×10⁸/ml的數(shù)量鋪于75cm²的培養(yǎng)瓶中，置于CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1小時(shí)。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，吸出未貼壁的淋巴細(xì)胞，置于新的培養(yǎng)瓶中，加入1000U/ml IFN-γ培養(yǎng)24小時(shí)，第2天加入終濃度為100ng/ml OKT、1ng/ml IL-1α和1000U/ml IL-2繼續(xù)培養(yǎng)，隔天加入含IL-2的新鮮培養(yǎng)基。上述貼壁細(xì)胞加入含1000U/ml GM-CSF，400U/ml IL-4以及Cellgro無血清DC培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。隔天全量補(bǔ)新鮮培養(yǎng)液一次，第5天收獲未成熟DC細(xì)胞(iDC)，加入OK-432(0.1KE/ml)和IFN-γ(1000U/ml)培養(yǎng)24小時(shí)后，即可獲得成熟的DC細(xì)胞。第7天將成熟的DC細(xì)胞與上述CIK細(xì)胞按照1:20的比例混合培養(yǎng)7天，即可獲得DC-CIK細(xì)胞。

第14天或第15天，收集DC-CIK細(xì)胞于一次性無菌離心杯(250ml)中，2300rpm×8min離心收集，并用生理鹽水洗滌2次，將細(xì)胞用含5ml 20％的人血白蛋白的0.9％注射用生理鹽水中重懸。制備好的細(xì)胞懸液留樣2ml于玻璃安瓿中，封安瓿口，貼上標(biāo)簽，注明病人姓名、性別、年齡、住院號和治療項(xiàng)目，4℃存放三個(gè)月備查。將制備好的DC-CIK細(xì)胞與含有10mg抗PD-1抗體的200ml生理鹽水于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min后，送病區(qū)進(jìn)行回輸。

2)流式細(xì)胞儀分析DC-CIK細(xì)胞表型

收集一小部分上述制備好的DC-CIK細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+及CD3-CD16+CD56+細(xì)胞的比例。其中CD3+CD8+細(xì)胞應(yīng)不低于60％，CD3+CD56+細(xì)胞應(yīng)不低于10％。

(二)結(jié)果分析：

1)DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物的質(zhì)量檢測結(jié)果：

物理檢查：外觀為乳白色細(xì)胞懸濁液，裝量約為200ml；

細(xì)胞數(shù)量：采用白細(xì)胞計(jì)數(shù)法，每例患者細(xì)胞數(shù)都不少于1×10¹⁰個(gè)細(xì)胞，范圍約為1-1.5×10¹⁰個(gè)；

細(xì)胞存活率：用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測，細(xì)胞存活率都不低于95％；

無菌、無支原體和無內(nèi)毒素檢測：按現(xiàn)行版《中國藥典》生物制品試驗(yàn)規(guī)程對回輸細(xì)胞進(jìn)行細(xì)菌、支原體及內(nèi)毒素檢測，結(jié)果均為陰性。

2)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果：

采用流式細(xì)胞儀檢測分析DC-CIK細(xì)胞后，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+及CD3-CD16+CD56+細(xì)胞的比例。結(jié)果參見圖6(A)所示，30例患者的DC-CIK細(xì)胞中，CD3+T淋巴細(xì)胞平均比例達(dá)到94.1％，而主要成分為CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞，平均占的比例為66.1％；CD3+CD56+T淋巴細(xì)胞，平均占的比例為20.2％。

實(shí)施例3：DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療癌癥的臨床療效和安全性評價(jià)

(一)療效評估：

納入本臨床試驗(yàn)研究的患者都有可測量的目標(biāo)病灶。病灶的評價(jià)是通過CT影像學(xué)在基線時(shí)(治療前一個(gè)月)、治療階段(每3個(gè)月)以及治療結(jié)束后的隨訪階段(每6個(gè)月)進(jìn)行。

1)療效評估標(biāo)準(zhǔn)

采用實(shí)體瘤的療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)進(jìn)行療效評價(jià)。先確定所有可測量的目標(biāo)病灶在基線時(shí)的長度總和，作為有效緩解記錄的參考基線，然后根據(jù)治療階段或治療結(jié)束后的隨訪階段目標(biāo)病灶相對基線水平的變化評價(jià)病情有效緩解情況。

2)有效緩解的標(biāo)準(zhǔn)

緩解的標(biāo)準(zhǔn)包括CR：所有目標(biāo)病灶消失；PR：基線病灶長徑總和縮小大于等于30％；SD：基線病灶長徑總和有縮小但未達(dá)PR或有增加但未達(dá)PD；PD：基線病灶長徑總和增加超過20％或出現(xiàn)新病灶。

3)隨訪

從治療開始后，對每例患者進(jìn)行隨訪記錄，并每3個(gè)月復(fù)查一次以確定患者的進(jìn)展情況，復(fù)查內(nèi)容包括血常規(guī)、血生化、腫瘤標(biāo)記物、肝腎功能、血電解質(zhì)、甲狀腺功能和影像學(xué)評估等。到腫瘤緩解穩(wěn)定或進(jìn)展后進(jìn)入生存隨訪，每半年一次。根據(jù)患者的治療時(shí)間與初次進(jìn)展時(shí)間及死亡時(shí)間計(jì)算患者的無進(jìn)展生存期(DFS)及總生存期(OS)。

(二)安全性評估：

本實(shí)驗(yàn)研究的安全性評估主要監(jiān)測DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療相關(guān)的不良反應(yīng)，即在治療的過程中及治療后的隨訪中，觀察記錄患者出現(xiàn)的治療相關(guān)毒副作用，并根據(jù)美國國立癌癥研究所不良事件通用術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)(NCI-CTCAE)第4.0版進(jìn)行分級。DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療相關(guān)的不良反應(yīng)主要包括：發(fā)熱、疲勞、貧血、肝腎功能異常、過敏反應(yīng)、白細(xì)胞減少及甲狀腺功能減退等。

(三)結(jié)果分析：

1)DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療的臨床客觀反應(yīng)評估結(jié)果

通過CT影像學(xué)對患者目標(biāo)病灶進(jìn)行評價(jià)，確定患者治療的有效緩解情況。參見圖3A所示，31例晚期難治性惡性腫瘤患者中，20例獲得有效緩解(64.5％)，其中1例獲得CR(3.2％)，6例獲得PR(19.4％)，13例獲得SD(41.9％)。其余11例出現(xiàn)進(jìn)展(35.5％)。參見3C所示，在各類腫瘤患者中，肝癌與腎癌患者的治療效果較好。其中一位64歲男性肝細(xì)胞性肝癌患者，經(jīng)多次TACE和RFA治療后，患者病灶較前仍有進(jìn)展，經(jīng)過8個(gè)療程DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療后，患者肝內(nèi)病灶消失。另一例33歲多發(fā)性肺、左鎖骨上淋巴結(jié)及椎體轉(zhuǎn)移的腎癌患者，經(jīng)過8個(gè)療程DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療后，患者多處轉(zhuǎn)移病灶明顯縮小或消失，特別是肺部的多發(fā)轉(zhuǎn)移灶大部分消失，一些病灶明顯縮小(圖4)。這些結(jié)果表明DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療晚期難治性惡性腫瘤患者安全有效。

2)患者的總生存期與無進(jìn)展生存期分析結(jié)果

根據(jù)對每例患者進(jìn)行的隨訪記錄，統(tǒng)計(jì)所有患者的總生存期與無進(jìn)展生存期。參見圖3B所示，截止目前的隨訪時(shí)間，31例患者的中位總生存時(shí)間為288天，中位無進(jìn)展生存時(shí)間為162天，其中8例患者死亡，11例患者病情進(jìn)展。

3)安全性評估結(jié)果：

參見圖5所示，17例在治療過程中出現(xiàn)治療相關(guān)不良反應(yīng)(54.8％)，主要為發(fā)熱、疲勞及白細(xì)胞減少等。其中，15例患者表現(xiàn)1或2級不良反應(yīng)(88.2％)，只有2例表現(xiàn)3或4級不良反應(yīng)(11.8％)，表明DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療晚期難治性惡性腫瘤患者是安全的。

實(shí)施例4：DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

為了驗(yàn)證DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物治療在臨床應(yīng)用中的有效性，本發(fā)明進(jìn)一步在體外檢測DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物對患者自體腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

(一)材料和方法：

1)自體腫瘤細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

收集腎癌患者新鮮腫瘤組織置于凈化臺(tái)內(nèi)，在平皿中用無鈣、鎂PBS清洗2-3次。組織塊剪碎后放入三角燒瓶中，加入比組織量多30-50倍的10％Ⅳ型膠原酶消化液，并置于37℃水浴鍋輕微震蕩1-2小時(shí)。待組織分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞后，終止消化。1500r/min離心5min，其棄上清后加入RPMI 1640培養(yǎng)基清洗，并通過100um的細(xì)胞濾網(wǎng)濾去尚未充分消化尚未組織塊。1500r/min離心后棄上清，加入一定量的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸離心下來的單個(gè)腫瘤細(xì)胞，并用含20％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37℃、5.0％CO₂培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

2)自體DC-CIK細(xì)胞體外殺傷實(shí)驗(yàn)

用0.25％胰蛋白酶消化液消化上述患者自體腫瘤細(xì)胞，1500r/min離心后重懸細(xì)胞，并用移液管將細(xì)胞吹打均勻。用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液濃度后，配制成實(shí)驗(yàn)需要的細(xì)胞濃度10x 10⁴細(xì)胞/ml。使用RTCA系統(tǒng)進(jìn)行體外殺傷檢測。首先在E-Plate 16的孔中加入50μl培養(yǎng)基后放到RTCA Station上檢測基線水平。然后取出E-Plate 16檢測板，在孔中加入100μl混合均勻的細(xì)胞懸液，使每孔中細(xì)胞數(shù)目為10x 10³細(xì)胞/well。將E-Plate 16置于超凈臺(tái)中室溫放置30min后放到培養(yǎng)箱中的RTCA Station上，進(jìn)行細(xì)胞增殖的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測。第二天，將50ul DC-CIK細(xì)胞和抗PD-1抗體組合物或單純DC-CIK細(xì)胞懸液按照3:1、10:1、30:1的效靶比加入E-Plate 16檢測板內(nèi)，另設(shè)一孔不加效應(yīng)細(xì)胞的靶細(xì)胞孔作為對照組。將E-Plate16檢測板置于RTCA檢測臺(tái)上實(shí)時(shí)監(jiān)測，比較兩組細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。最后殺傷效果的計(jì)算公式為：殺傷率＝(對照組CI值-實(shí)驗(yàn)組CI值)/對照組CI值。

3)DC-CIK細(xì)胞殺傷活性以及腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1水平變化的檢測

利用Cytomics FC500流式細(xì)胞儀分析抗PD-1抗體對DC-CIK細(xì)胞分泌IFN-γ水平的影響，以判斷細(xì)胞的殺傷活性。同時(shí)檢測腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1的水平，分析腫瘤細(xì)胞對DC-CIK細(xì)胞殺傷活性的影響。對于DC-CIK細(xì)胞殺傷活性分析，細(xì)胞經(jīng)50ng/mL PMA，500ng/mL ionomycin和10ng/mL brefeldin A刺激4h后，收集細(xì)胞于抗CD3/IFN-γ抗體中孵育30min后，上機(jī)檢測。對于腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1水平分析，將細(xì)胞于抗PD-L1抗體中孵育30min后，上機(jī)檢測。

(二)結(jié)果分析：

1)自體DC-CIK細(xì)胞體外殺傷自體腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果

參見圖6B所示，TC19代表治療后達(dá)到PR的腎癌患者，TC17代表治療后為SD的腎癌患者，TC13代表治療后出現(xiàn)PD的腎癌患者。選取24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)RTCA系統(tǒng)檢測的殺傷結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，治療后獲得有效緩解患者的自體DC-CIK細(xì)胞對自體腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷作用，而且加入抗PD-1抗體后能顯著增強(qiáng)DC-CIK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。對于未獲得疾病緩解的患者，其自體DC-CIK細(xì)胞無論有加用抗PD-1抗體，都不具有明顯殺腫瘤作用。

2)DC-CIK細(xì)胞殺傷活性以及腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-L1分析結(jié)果

進(jìn)一步探討獲得有效緩解患者的自體DC-CIK細(xì)胞經(jīng)抗PD-1抗體處理后表現(xiàn)更強(qiáng)抗腫瘤活性的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，自體腫瘤細(xì)胞在受到DC-CIK細(xì)胞殺傷的同時(shí)，會(huì)上調(diào)PD-L1的表達(dá)，進(jìn)而負(fù)反饋性通過PD-1/PD-L1通路抑制DC-CIK細(xì)胞的免疫活性。參見圖6C所示，獲得有效緩解的兩例患者TC19與TC17，其腫瘤細(xì)胞在受到自體DC-CIK細(xì)胞殺傷后明顯上調(diào)了PD-L1的表達(dá)水平，分別從21.9％和3.9％，增加到97％(98.1％)和34.2％(41％)。而未獲得疾病緩解的患者TC13，未受到自體DC-CIK細(xì)胞的明顯殺傷而沒有明顯上調(diào)PD-L1的表達(dá)，僅從2.7％，增加到4.4％(5.6％)。此外，參見圖6D所示，對DC-CIK細(xì)胞殺傷活性的檢測結(jié)果表明，TC19與TC17患者自體DC-CIK細(xì)胞在殺傷過程中受到腫瘤細(xì)胞上調(diào)的PD-L1負(fù)性免疫調(diào)節(jié)而減少了IFN-γ的分泌，分別從18.5％和11.8％，減少到10.7％和6.8％。而經(jīng)抗PD-1抗體處理后，DC-CIK細(xì)胞不受PD-L1的影響，繼續(xù)分泌更多的IFN-γ，分別從20.8％和12.5％，增加到39.6.7％和21.9％，從而發(fā)揮更強(qiáng)的殺傷腫瘤細(xì)胞的活性。TC13患者自體的DC-CIK細(xì)胞則不明顯分泌IFN-γ的分泌。