專利名稱：細(xì)胞展示抗體文庫(kù)的制作方法
細(xì)胞展示抗體文庫(kù) 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了在細(xì)胞膜表面上展示抗體或抗體片段的方法；產(chǎn)生在細(xì)胞表 面上展示的抗體或抗體片段文庫(kù)的方法；在細(xì)胞表面上表達(dá)抗體或抗體片段文 庫(kù)的細(xì)胞；在細(xì)胞膜上表達(dá)抗體或抗體片段文庫(kù)的病毒載體文庫(kù)；篩選結(jié)合于 具體抗原的抗體或抗體片段的方法;篩選結(jié)合特性改進(jìn)和/或改變的抗體或抗體 片段的方法；篩選在其細(xì)胞表面上表達(dá)和展示結(jié)合于具體抗原的抗體或抗體片 段的細(xì)胞的方法;篩選在其細(xì)胞表面上表達(dá)和展示結(jié)合特性改進(jìn)和/或改變的抗 體或抗體片段的細(xì)胞的方法；和相關(guān)試劑盒。本發(fā)明還提供了配體結(jié)合(如FcYR 結(jié)合)改變和/或效應(yīng)物功能(如ADCC活性)改變的Fc變體。發(fā)明背景抗體是結(jié)合特定抗原的免疫蛋白。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物，包括人和小鼠中， 由成對(duì)的重鏈和輕鏈多肽構(gòu)建抗體。各鏈由兩個(gè)不同區(qū)域組成，稱為可變區(qū)(Fv) 和恒定區(qū)(Fc)。輕鏈和重鏈Fv區(qū)含有該分子的抗原結(jié)合決定簇，負(fù)責(zé)結(jié)合耙抗 原。Fc區(qū)確定了抗體類型(或同種型)(如IgG)，并負(fù)責(zé)結(jié)合許多Fc受體和其它 Fc配體，賦予一系列重要功能，稱為效應(yīng)物功能?？贵w的幾種關(guān)鍵特征包括但 不限于對(duì)靶點(diǎn)的特異性、介導(dǎo)免疫效應(yīng)物機(jī)制的能力和長(zhǎng)血清半衰期、使抗 體具有更好的療效。開發(fā)了用于分離具有所需結(jié)合特異性的抗體的重組篩選 法。例如，可能用組合的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生結(jié)合分子的大型表達(dá)文庫(kù)。在抗 體工程領(lǐng)域尤其如此，在此領(lǐng)域重組抗體文庫(kù)通常含有超過109個(gè)獨(dú)立克隆。 大型結(jié)合分子文庫(kù)的可用性為大多數(shù)配體提供了結(jié)合物來源。通過對(duì)展示結(jié)合分子的生物體(如噬菌體和酵母)進(jìn)行連續(xù)選擇(如淘選； 綜述參見，7Vewfe所ofec/wo/ 9: 408-414; Coomber等，2002， Af"/zoc^ Mo/ 扁178: 133-45， Kretzschmar等,2002， C群Qp/"胸ec/zo/ 13: 598-602; Fernandez-Gacio等，2003， Med C7zem 13:213-216; Lee等，2003， 7>ewA 5,otec/mo/ 21: 45-52;禾卩Kondo等，2004， j; p/ Af/craWo/ Ao加/z"o/64: 28-40)，能夠用表面展示文庫(kù)富集特定結(jié)合克隆。具體說，噬菌 體展示抗體文庫(kù)的進(jìn)展使它們成為篩選常規(guī)雜交瘤衍生的單克隆抗體的吸引 人的替代技術(shù)。由于單個(gè)噬菌體展示文庫(kù)中可含有多種不同多肽(一般超過109 種)，所以噬菌體展示文庫(kù)篩選優(yōu)于其它一些篩選方法。這便能夠在一個(gè)篩選 步驟中篩選高度復(fù)雜的文庫(kù)。噬菌體上展示小肽或單鏈蛋白可能有利，只要不一定需要或不需要胞內(nèi)加 工或翻譯后修飾(噬菌體或原核宿主不能進(jìn)行這些功能)。例如，有效展示異源 多肽可能需要各種翻譯后修飾、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)、以及將展示多肽適當(dāng)?shù)剡\(yùn)輸、糖基 化、構(gòu)型、組裝和錨定到宿主細(xì)胞表面上所需要的侶伴蛋白和專用酶的一套補(bǔ) 充物(complement);然而，這些過程均無法通過噬菌體或原核細(xì)胞過程實(shí)現(xiàn)。 而且，原核細(xì)胞不總是有效地表達(dá)功能性真核蛋白。細(xì)菌和噬菌體展示系統(tǒng)也受限于展示系統(tǒng)的小容量，因此，更適合展示小 肽，如最近開發(fā)的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上進(jìn)行小肽表面展示的方法(參見例如 Wolkowicz等，2005，丄5/o/. CTzem. ， 280: 15195-15201)。結(jié)果是，噬菌體和 哺乳動(dòng)物抗體展示文庫(kù)和方法需要在表面上只展示抗體片段。如果目的是發(fā)現(xiàn) "完整"抗體，那么必須將抗體片段克隆到完整抗體中。這不僅增加了一個(gè)額外 步驟，而且當(dāng)轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾贵w和這類文庫(kù)時(shí)，許多抗體片段對(duì)抗原的親和力降 低。而且，無法使用這類方法檢測(cè)其它抗體結(jié)構(gòu)域如Fc區(qū)與抗體受體(如Fc 受體)或其它Fc配體的結(jié)合。已經(jīng)開發(fā)了一些真核細(xì)胞如酵母的完整抗體細(xì)胞表面展示系統(tǒng)(參見例如 Boder和Wittrup， 2000， M"Ao必/"五raymo/ogy， 328:430-444)，但在哺乳動(dòng) 物細(xì)胞上進(jìn)行完整抗體展示的開發(fā)滯后。而且，這些系統(tǒng)中可以產(chǎn)生的文庫(kù)大 小有限。因?yàn)橛盟杞Y(jié)合特性從抗體文庫(kù)中分離抗體的概率與文庫(kù)的大小和多 樣性成正比，所以需要一種方法產(chǎn)生大型多樣化的文庫(kù)。如果想要從未免疫的 供體建立用于抗體發(fā)現(xiàn)的天然抗體文庫(kù)，這一點(diǎn)特別重要。目前，通過釆用常 規(guī)轉(zhuǎn)染工具如瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或電穿孔的真核細(xì)胞展示技術(shù)建立大于108個(gè)成員的文 庫(kù)是個(gè)挑戰(zhàn)。因此，需要用于真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的抗體細(xì)胞表面 展示文庫(kù)和文庫(kù)篩選方法，該文庫(kù)能保持大量不同信息，但消除了上述問題。這一系統(tǒng)對(duì)于鑒定可變區(qū)外區(qū)域如FC區(qū)域中的抗體變異特別有用。已證明， Fc區(qū)修飾，包括氨基酸缺失、取代和添加能改變Fc區(qū)與其配體和/或受體的結(jié) 合，導(dǎo)致效應(yīng)物功能伴隨性改變(參見例如(Shields等，2001, /所o/ C&m 276:6591-6604和Presta等，2002， Soc 7>aw 30:487-490和美國(guó)專利公開2004/0132101)。因此，可通過修飾Fc區(qū)提高含F(xiàn)c分子的治療有效性。在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞上進(jìn)行完整抗體細(xì)胞表面展示的系統(tǒng)能促進(jìn)快速鑒定含有效應(yīng) 物功能改變的修飾Fc區(qū)的抗體。引用或討論本文引用的參考文獻(xiàn)不應(yīng)被認(rèn)為是承認(rèn)該文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn) 有技術(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及在細(xì)胞膜胞外表面上展示的重組抗體或其片段，本文中稱為 "本發(fā)明抗體"和類似術(shù)語。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明重組抗體包含重鏈或其 片段，和任選的輕鏈或其片段，其中重鏈或輕鏈還包含使抗體或其片段耙向細(xì) 胞表面的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明重組抗體包含具有使抗體靶 向細(xì)胞表面的氨基酸序列的全長(zhǎng)重鏈，其中所述氨基酸序列融合于所述重鏈的 C末端，還可包含全長(zhǎng)輕鏈。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明重組抗體包含具有使 抗體耙向細(xì)胞表面的氨基酸序列的一部分重鏈，其中所述氨基酸序列融合于所 述重鏈部分的c末端，還可包含輕鏈或其片段。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，使抗體靶向細(xì)胞表面的所述氨基酸序列是跨膜域。在另一實(shí)施方式中，使抗體靶向細(xì)胞表面的所述氨基酸序列是GPI錨定信號(hào)序列。本發(fā)明還涉及包含編碼細(xì)胞膜外表面上展示的重組抗體或其片段的多核 苷酸的載體，在本文中稱為"本發(fā)明載體"。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明載體是 病毒載體。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明載體是腺病毒載體。本發(fā)明也涉及包含在細(xì)胞膜外表面上展示的重組抗體或其片段的文庫(kù)，在 本文中稱為"本發(fā)明文庫(kù)"。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明文庫(kù)包含重鏈可變區(qū)文 庫(kù)；它還可包含輕鏈可變區(qū)文庫(kù)；它還可包含變異Fc區(qū)的文庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施 方式中，本發(fā)明文庫(kù)是包含編碼在細(xì)胞膜外表面上展示的重組抗體或其片段的 多核苷酸的細(xì)胞文庫(kù)。本發(fā)明也提供了篩選包含在細(xì)胞膜外表面上展示的重組抗體或其片段的 本發(fā)明文庫(kù)的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，文庫(kù)篩選方法能夠鑒定結(jié)合于特定抗 原的抗體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，文庫(kù)篩選方法能夠鑒定對(duì)特定抗原結(jié) 合特性改變的抗體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，文庫(kù)篩選方法能夠鑒定與效 應(yīng)物分子(如FcyRs和/或Clq)結(jié)合特性改變的抗體或其片段。本發(fā)明提供了與效應(yīng)物分子(如FcYRs和/或Clq)結(jié)合特性改變的變異Fc 區(qū)。本發(fā)明還提供了效應(yīng)物功能改變的變異Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā) 明變異Fc區(qū)的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)降低。附圖簡(jiǎn)要說明為了說明本發(fā)明的示范性實(shí)施方式，本文提供了附圖。

圖1A-C.可用于細(xì)胞表面展示抗體或其片段的表達(dá)盒(I-VI)的非限制性例子的示意圖。圖2.表達(dá)含有跨膜域或GPI錨定信號(hào)的抗體融合多肽的染色HEK-293T 細(xì)胞的熒光強(qiáng)度概況。用FITC偶聯(lián)的抗-人IgG或生物素化EphA2-Fc融合蛋 白/FITC偶聯(lián)的抗生物素抗體對(duì)表達(dá)含重鏈的抗EphA2抗體的HEK-293T細(xì)胞 進(jìn)行染色，所述重鏈融合于i)羧基肽酶M的GPI錨定信號(hào)(CM GPI)， ii)DAF 的移碼突變型GPI錨定信號(hào)(DAF mutGPI)， iii)DAF的變異GPI錨定信號(hào)(DAF vGPI)，或iv)血栓調(diào)節(jié)蛋白的跨膜域(TM;所分析的兩種獨(dú)立分離的克隆)，然 后用流式細(xì)胞儀分析。經(jīng)類似染色(293T+FITC)以及未染色(293T)的HEK-293T 細(xì)胞用作陰性對(duì)照。表達(dá)CM GPI、 DAF vGPI或TM融合的抗EphA2抗體的 細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照細(xì)胞。表達(dá)DAF mutGPI融合的抗EphA2抗體的細(xì) 胞熒光強(qiáng)度與對(duì)照HEK-293T細(xì)胞基本相同。圖3.用不同量編碼含有DAF vGPI的抗EphA2融合抗體的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn) 染的HEK-293T細(xì)胞經(jīng)親和染色后的熒光強(qiáng)度圖。用不同量(0.05、 0.1、 0.5、 1.0、2.0、4和10嗎)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞先接觸FcYRI^A-鏈霉親和素融合蛋白，然后用FITC偶聯(lián)的抗鏈霉親和素抗體染色。隨后用流 式細(xì)胞儀分析細(xì)胞。非轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞用作陰性對(duì)照。所有轉(zhuǎn)染細(xì)胞群體 的流式細(xì)胞圖顯示出，與對(duì)照細(xì)胞相比平均熒光強(qiáng)度發(fā)生顯著改變。圖4.表達(dá)含DAF vGPI的抗EphA2融合抗體的HEK-293T細(xì)胞經(jīng)親和染 色后的熒光強(qiáng)度圖。用10嗎編碼含DAF vGPI的抗EphA2融合抗體的質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞分成等份，用不同稀釋度的FcYRIIIA-鏈霉親和素融合蛋白(1:500、 1:1000、 1:2000、 1:3000、 1:4000和l:5000)培育。 然后用FITC偶聯(lián)的抗鏈霉親和素抗體染色細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析。流式細(xì)胞 圖顯示，F(xiàn)cYRIIIA-鏈霉親和素融合蛋白用量降低時(shí)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。圖5.用于分離對(duì)FcyRIIIA結(jié)合親和力低的Fc變體的分選參數(shù)。用Fc變 體插入文庫(kù)(Fc-IL)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，并用FcYRIIIA-鏈霉親和素融合蛋 白/FITC偶聯(lián)的抗鏈霉親和素抗體染色。(A)用門R2分離熒光強(qiáng)度低(約為Ml 標(biāo)記物總量的10%)的細(xì)胞。(B)分離的細(xì)胞群體顯示出均一的低熒光強(qiáng)度。圖6.表達(dá)含有DAF vGPI的抗EphA2融合抗體的Fc變體的HEK-293細(xì) 胞經(jīng)染色的熒光強(qiáng)度圖形。用流式細(xì)胞術(shù)分析表達(dá)含有DAF vGPI的抗EphA2 融合抗體的野生型(A和D)、 K246E Fc變體(B和E)或InR236/237 Fc變體(C和 F)的HEK-293細(xì)胞。細(xì)胞用FITC偶聯(lián)抗人IgG抗體(A-C)或用FcYRIIIA-鏈霉 親和素融合蛋白/FITC偶聯(lián)抗鏈霉親和素抗體染色。各圖包含表達(dá)抗體(黑線) 和對(duì)照(灰線)的HEK-293細(xì)胞的流式細(xì)胞圖。用FITC偶聯(lián)抗人IgG抗體染色 的所有三種細(xì)胞群體的熒光強(qiáng)度水平相似，與對(duì)照細(xì)胞的觀察值顯著不同。用 FcYRIIIA-鏈霉親和素融合蛋白/FITC偶聯(lián)抗鏈霉親和素抗體染色時(shí)，只有表達(dá) 野生型或K246E Fc變體抗體的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照HEK-293細(xì)胞的 觀察值。圖7. Fc變體InR236/237、 InN238/239和InV238/239的基于ELISA的 FcYRIIIA結(jié)合曲線。用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法建立FcyRIIIA與野生型或Fc變體 InR236/237、 InN238/239和InV238/239抗EphA2抗體相互作用的結(jié)合曲線。 抗原特異性相同的IgG4同種型抗體用作陰性對(duì)照。結(jié)合曲線顯示，F(xiàn)cYRIIIA 與InR236/237、 InN238/239或InV238/239 Fc變體之間的相互作用比FcyRIIIA 與IgG4陰性對(duì)照抗體Fc區(qū)之間的相互作用弱。FcYRIIIA能與含有野生型Fc 區(qū)的陽性對(duì)照抗體強(qiáng)烈結(jié)合。圖8. Fc變體InG240/241、InR234/235、InL238/239、InE238/239、InS239/240、 InR237/238和K246R/L251E/T260R的基于ELISA的Clq結(jié)合曲線。用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法建立Clq與野生型或Fc變體InG240/241 、 InR234/235 、 InL238/239、 InE238/239、 InS239/240、 InR237/238和K246R/L251E/T260R抗 EphA2抗體相互作用的結(jié)合曲線?？乖禺愋韵嗤腎gG4同種型抗體用作陰 性對(duì)照。與野生型抗體相比，各Fc變體與Clq的結(jié)合減少。圖9. Fc變體K246R/L251E/T260R 、 InR236/237 、 InN238/239 、 InV238/239、 InG240/241、 InR234/235、 InL238/239、 InE238/239、 InS239/240 和InR237/238與THP-1細(xì)胞的結(jié)合百分?jǐn)?shù)。使表達(dá)FcyRI和Fc7Ri1、但不表 達(dá)FcyRIIIA的THP-1單核細(xì)胞接觸野生型或Fc變體K246R/L251E/T260R、 InR236/237 、 函238/239 、 InV238/239 、 InG240/241 、 InR234/235 、 InL238/239、 InE238/239、 InS239/240和InR237/238抗EphA2抗體。用FITC 偶聯(lián)抗人IgG Fab進(jìn)行細(xì)胞染色來測(cè)定各抗體結(jié)合的THP-1單核細(xì)胞的百分 數(shù)，并用流式細(xì)胞儀分析。得到的結(jié)果顯示，與野生型抗體相比，各測(cè)試Fc 變體與FcyRI和FcyRII的結(jié)合降低。圖10. Fc變體InR236/237、 InN238/239和InV238/239與NK細(xì)胞的結(jié)合 百分?jǐn)?shù)。使表達(dá)Fc/RIIIA的NK細(xì)胞與野生型或Fc變體InR236/237、InN238/239 和InV238/239抗EphA2抗體相接觸。通過FITC偶聯(lián)抗人IgG Fab進(jìn)行細(xì)胞染 色來測(cè)定各抗體結(jié)合的NK細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。抗原特 異性相同的IgG4同種型抗體用作陰性對(duì)照。得到的結(jié)果顯示，與野生型抗體 相比，各測(cè)試Fc變體與FcyRIIIA的結(jié)合降低。圖11. Fc變體InR236/237、 InN238/239、 InV235/236和InG238/239的基 于ELISA的EphA2結(jié)合曲線。用標(biāo)準(zhǔn)ELISA方法測(cè)定野生型和Fc變體 InR236/237、 InN238/239、 InV235/236和lnG238/239抗EphA2抗體與人EphA2 的結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)中將維他辛(Vitaxin)⑥(抗-avP3整聯(lián)蛋白抗體)和抗-HMGBl抗 體用作陰性對(duì)照。結(jié)果證明，各測(cè)試Fc變體與人EphA2結(jié)合的親和力類似于 野生型抗體。圖12.Fc變體InR236/237、 InN238/239、 InV238/239的體外ADCC活性。 用標(biāo)準(zhǔn)方法以50:1(左圖)或25:1(右圖)的效應(yīng)物:靶細(xì)胞比測(cè)定Fc變體 InR236/237、 InN238/239、 InV238/239的ADCC活性。野生型抗EphA2抗體 和抗-CD4抗體(R347)分別用作陽性和陰性對(duì)照。表達(dá)EphA2的A549細(xì)胞用作靶點(diǎn)。純化的人外周血單核細(xì)胞用作效應(yīng)物。在0.1-10000 ng/ml的抗體濃度 下測(cè)定細(xì)胞毒性。各測(cè)試Fc變體顯示的ADCC活性類似于陰性對(duì)照抗體。在 相同條件下野生型抗EphA2抗體顯示出強(qiáng)烈的ADCC活性。圖13.原理選擇實(shí)驗(yàn)I的證據(jù)的流式細(xì)胞圖。用aVp3-生物素培育細(xì)胞， 然后用FITC偶聯(lián)的抗人IgG-Fc和APC偶聯(lián)的鏈霉親和素染色。展示樣品如 下(A)陰性對(duì)照293A細(xì)胞，(B)用編碼在細(xì)胞表面展示的3F2抗EphA2抗體 的ts369突變腺病毒感染的293A細(xì)胞，(C)用編碼細(xì)胞表面展示的Abegrin抗 -aVp3整聯(lián)蛋白ScFvFc的ts369突變腺病毒感染的293A細(xì)胞，(D)在進(jìn)行磁珠 介導(dǎo)的選擇之前用人工文庫(kù)感染的293A細(xì)胞，(E)經(jīng)過磁珠介導(dǎo)的選擇后，用 人工文庫(kù)感染的293A細(xì)胞。采用門P6分選雙陽性細(xì)胞。圖14.原理選擇實(shí)驗(yàn)II的證據(jù)的流式細(xì)胞圖。用生物素化EphA2培育細(xì) 胞，然后用FITC偶聯(lián)的抗人IgG-Fc和APC偶聯(lián)的鏈霉親和素染色。展示樣 品如下(A)陰性對(duì)照293A細(xì)胞，(B)用編碼細(xì)胞表面展示的Abegrin抗-aVp3 整聯(lián)蛋白抗體的ts369突變腺病毒感染的293A細(xì)胞，(C)用編碼細(xì)胞表面展示 3F2抗-EphA2 ScFvFc的ts369突變腺病毒感染的293A細(xì)胞，(D)在進(jìn)行磁珠 介導(dǎo)的選擇之前用人工文庫(kù)感染的293A細(xì)胞，(E)經(jīng)過磁珠介導(dǎo)的選擇后，用 人工文庫(kù)感染的293A細(xì)胞。采用門P6分選雙陽性細(xì)胞。圖中顯示了門P6覆 蓋的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。圖15.原理選擇實(shí)驗(yàn)III的證據(jù)的流式細(xì)胞圖。用生物素化EphA2培育細(xì) 胞，然后用FITC偶聯(lián)的抗人IgG-Fc和APC偶聯(lián)的鏈霉親和素染色。展示樣 品如下(A)陰性對(duì)照293A細(xì)胞，(B)用編碼細(xì)胞表面展示的抗-PCDGF抗體的 ts369突變腺病毒感染的293A細(xì)胞，(C)用編碼細(xì)胞表面展示的10C12抗-EphA2 ScFvFc的ts369突變腺病毒感染的293A細(xì)胞，(D)在進(jìn)行磁珠介導(dǎo)的選擇之前 用人工文庫(kù)感染的293A細(xì)胞，(E)經(jīng)過磁珠介導(dǎo)的選擇后，用人工文庫(kù)感染的 293A細(xì)胞。采用門P6分選雙陽性細(xì)胞。圖中顯示了門P6覆蓋的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。定義本文所用術(shù)語"抗體"指單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、 camelised抗體、嵌合抗體、單鏈Fv(scFv)、 二硫鍵連接的Fv(sdFv)、 Fab片段、F(ab，)片段和抗-獨(dú)特型(抗-Id)抗體(包括例如，本發(fā)明抗體的抗Id抗體)和上述 抗體的表位結(jié)合片段。具體說，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子， 即含有抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子的免疫活性片段，這些片段可以或可以不融合于另 一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，包括但不限于fc區(qū)或其片段。本文所用術(shù)語"抗體"和"抗體"也包括Fc變體、全長(zhǎng)抗體和含有Fc區(qū)或其片段的Fc變體融合物。 Fc變體-融合物包括但不限于scFv-Fc融合物、可變區(qū)(如叭和VH)-Fc融合物、 scFv-scFv-Fc融合物?？贵w可以是任何類型(如IgG、 IgE、 IgM、 IgD、 IgA和 IgY)、類別(如IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl和IgA2)或亞類。本文提到的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)殘基編號(hào)是Kabat等(1991， NIH公告(NIH Publication) 91-3242，國(guó)家技術(shù)信息服務(wù)中心(National Technical Information Service),弗吉尼亞州斯普林菲爾德(Springfield， VA))所述的編號(hào)。具體說，輕 鏈可變區(qū)的殘基24-34(CDRl)、 50-56(CDR2)和89-97(CDR3)和重鏈可變區(qū)的 31-35(CDR1)、 50-65(CDR2)和95-102(CDR3)。需要注意，不同抗體之間的CDR 明顯不同(根據(jù)定義與Kabat共有序列沒有同源性)。構(gòu)架殘基的最大比對(duì)常常 需要在編號(hào)系統(tǒng)中插入"間隔物"殘基，以用于Fv區(qū)。應(yīng)理解，本文中提到的 CDR是Kabat等同上所述的CDR。此外，由于種間或等位基因差異，在不同 抗體鏈之間，任何給定的Kabat位點(diǎn)編號(hào)上某些單獨(dú)殘基的種類可能不同。本文所用的"Fc區(qū)"包括含有除第一恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以外的抗體 恒定區(qū)的多肽。因此，F(xiàn)c指IgA、 IgD和IgG的最后兩個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié) 構(gòu)域和IgE和IgM的最后三個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及這些結(jié)構(gòu)域N末 端方向上的彈性絞鏈區(qū)。就IgA和IgM而言，F(xiàn)c可包括J鏈。就IgG而言， Fc包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域Cy2和Cy3以及Cy1和CY2之間的絞鏈區(qū)。雖然Fc 區(qū)的界限可能不同，但人IgG重鏈Fc區(qū)的羧基端通常會(huì)包含殘基C226或P230 ， 其中編號(hào)方式遵照Kabat等(1991， NIH公告91-3242，國(guó)家技術(shù)信息服務(wù)中心， 弗吉尼亞州斯普林菲爾德)所述的EU索引。"如Kabat所述EU索引"指Kabat 等同上所述的人IgGl EU抗體的殘基編號(hào)方法。Fc可能指分離的這一區(qū)域， 或者在抗體、抗體片段或Fc融合蛋白中的這一區(qū)域。Fc變體蛋白可能是抗體、 Fc融合物、或者包含F(xiàn)c區(qū)的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。特別優(yōu)選包含變異Fc 區(qū)(非天然產(chǎn)生的Fc區(qū)變體)的蛋白質(zhì)。與野生型氨基酸序列相比，非天然產(chǎn)生的Fc區(qū)(本文中也稱為"變異Fc區(qū)")的氨基酸序列包括至少一個(gè)氨基酸殘基的 取代、插入和/或缺失。由于插入或取代，變異Fc區(qū)序列中任何新出現(xiàn)的氨基 酸殘基都可稱作非天然產(chǎn)生的氨基酸殘基。需要注意已經(jīng)在許多FC位置上觀察到多態(tài)性，包括但不限于Kabat270、 272、 312、 315、 356和358，因此所 述序列和現(xiàn)有技術(shù)中的序列之間可能略有差異。本文所用術(shù)語"跨膜區(qū)"指能夠跨越細(xì)胞質(zhì)膜的肽、多肽或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 域?？舍娪眠@些結(jié)構(gòu)域?qū)⒖贵w錨定在細(xì)胞膜上。"嵌合抗體"是抗體不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子的分子，如含有衍 生自非人抗體和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。本領(lǐng)域知道產(chǎn)生嵌合抗體的方 法。參見例如，Morrison, 1985，腸"ce 229:1202; Oi等，1986， 5/。rec/m—:y 4:214; Gillies等，1989， /mmw"o/. M"Ao^ 125:191-202;和美國(guó)專利號(hào) 5,807,715、 4,816,567和4,816,397， CDR-嫁接(EP 239,400; PCT
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