本發(fā)明涉及一種富硒黃芪提取物、提取方法和應(yīng)用，屬于天然植物提取技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃芪本身就具有保肝，利尿，抗衰老，降壓，提高機(jī)體免疫力等功能。硒，是人體必須的微量元素，具有防癌抗癌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等生物學(xué)特性，享有自由基清道夫、生命火種、抗癌之王等美譽(yù)。
富硒黃芪是黃芪新品種。經(jīng)檢測，普通黃芪根平均硒含量118微克/千克，富硒黃芪根平均硒含量798微克/千克，達(dá)到6倍以上。實踐證明，富硒黃芪病菌少，無麻點，光澤度高；富硒黃芪培育方法可操作性強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，硒含量穩(wěn)定。
雖然近年來黃芪在調(diào)節(jié)免疫方面越來越受關(guān)注，但對富硒黃芪的研究與開發(fā)還尚缺乏。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種富硒黃芪的提取物，這種提取物具有較高的調(diào)節(jié)免疫活性；同時，本發(fā)明利用了新的提取方法，使提取物的活性得到提高。
技術(shù)方案是：
一種富硒黃芪提取物，它是由富硒黃芪經(jīng)過提取而得到的。
富硒黃芪提取物的提取方法，包括如下步驟：
第1步，將富硒黃芪加入至乙醇溶液中進(jìn)行加熱回流提取，得到提取液；
第2步，將上述提取液過濾除渣之后，濾過液減壓濃縮，再將濃縮液中加入石油醚進(jìn)行萃取，得到第一萃余相；
第3步，在第一萃余相中加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到第二萃余相；
第4步，將第二萃余相送入聚酰胺柱進(jìn)行上柱操作，再經(jīng)水洗至無色后，繼用65～75％乙醇洗脫，收集洗脫液，干澡至恒重，得到提取物。
所述的第1步中，富硒黃芪與乙醇溶液的固液比是1：5～8，乙醇溶液是由50～70vol.％的乙醇溶液中加入NaOH調(diào)節(jié)pH至8～10得到，提取溫度是65～75℃。
所述的第2步中，減壓濃縮至濾液體積減小為1/5～1/3，石油醚的體積是濃縮液體積的1/5～1/7。
所述的第3步中，乙酸乙酯的體積是第一萃余相的體積1/3～1/5。
所述的第4步中，聚酰胺柱的樹脂的粒度是30-60目。
富硒黃芪提取物在制備用于提高哺乳動物免疫力藥物中的應(yīng)用。
有益效果
本發(fā)明提出了一種富硒黃芪的提取物，這種提取物具有較高的調(diào)節(jié)免疫活性；同時，本發(fā)明利用了新的提取方法，使提取物的活性得到提高。提取方法中，采用石油醚的作用是去除一部分酯類物質(zhì)，采用乙酸乙酯的作用可以有效地排除一些活性較低的提取物成分，經(jīng)過聚酰胺柱純化后進(jìn)一步得到了高活性提取物。
本課題選用甘肅省渭源縣康榮中藥材科技有限公司培育的新品種富硒黃芪為研究對象，通過觀察其對免疫抑制模型大鼠IgG、IgM、IgA以及免疫分子的影響，與普通黃芪進(jìn)行對比，初步探討富硒黃芪對免疫功能的作用，為黃芪新品種的應(yīng)用和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
具體實施方式
選用甘肅省渭源縣康榮中藥材科技有限公司培育的新品種富硒黃芪為研究對象，通過提取之后，獲得了一種具有較高免疫效果的富硒黃芪提取物，并通過觀察其對免疫抑制模型大鼠IgG、IgM、IgA以及免疫分子的影響，與普通黃芪進(jìn)行對比，富硒黃芪對免疫功能的作用更為明顯。
提取試驗中，富硒黃芪、普通黃芪購自甘肅省渭源縣康榮中藥材專業(yè)合作社。
實施例1
第1步，將富硒黃芪加入至乙醇溶液中進(jìn)行加熱回流提取，富硒黃芪與乙醇溶液的固液比是1：6，乙醇溶液是由60vol.％的乙醇溶液中加入NaOH調(diào)節(jié)pH至9得到，提取溫度是70℃，提取時間1h，得到提取液；
第2步，將上述提取液過濾除渣之后，濾過液減壓濃縮，減壓濃縮至濾液體積減小為1/4，再將濃縮液中加入石油醚進(jìn)行萃取，石油醚的體積是濃縮液體積的1/6，得到第一萃余相；
第3步，在第一萃余相中加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯的體積是第一萃余相的體積1/4，得到第二萃余相；
第4步，將第二萃余相送入30-60目聚酰胺柱進(jìn)行上柱操作，再經(jīng)水洗至無色后，繼用70％乙醇洗脫，收集洗脫液，干澡至恒重，得到提取物。
另外，將本實施例中得到的乙酸乙酯萃取物減壓濃縮至干后，得到乙酸乙酯提取物，同樣用于藥效試驗。
實施例2
與實施例1的區(qū)別在于：未采用乙酸乙酯去除低活性提取物。
第1步，將富硒黃芪加入至乙醇溶液中進(jìn)行加熱回流提取，富硒黃芪與乙醇溶液的固液比是1：6，乙醇溶液是由60vol.％的乙醇溶液中加入NaOH調(diào)節(jié)pH至9得到，提取溫度是70℃，提取時間1h，得到提取液；
第2步，將上述提取液過濾除渣之后，濾過液減壓濃縮，減壓濃縮至濾液體積減小為1/4，再將濃縮液中加入石油醚進(jìn)行萃取，石油醚的體積是濃縮液體積的1/6，得到第一萃余相；
第3步，將第一萃余相送入30-60目聚酰胺柱進(jìn)行上柱操作，再經(jīng)水洗至無色后，繼用70％乙醇洗脫，收集洗脫液，干澡至恒重，得到提取物。
實施例3
與實施例1的區(qū)別在于：未采用D101樹脂柱進(jìn)行吸附純化。
第1步，將富硒黃芪加入至乙醇溶液中進(jìn)行加熱回流提取，富硒黃芪與乙醇溶液的固液比是1：6，乙醇溶液是由60vol.％的乙醇溶液中加入NaOH調(diào)節(jié)pH至9得到，提取溫度是70℃，提取時間1h，得到提取液；
第2步，將上述提取液過濾除渣之后，濾過液減壓濃縮，減壓濃縮至濾液體積減小為1/4，再將濃縮液中加入石油醚進(jìn)行萃取，石油醚的體積是濃縮液體積的1/6，得到第一萃余相；
第3步，在第一萃余相中加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯的體積是第一萃余相的體積1/4，得到第二萃余相；
第4步，將第二萃余相送入D101樹脂柱進(jìn)行上柱操作，再經(jīng)水洗至無色后，繼用70％乙醇洗脫，收集洗脫液，干澡至恒重，得到提取物。
對照例1
本對照例與實施例1的區(qū)別是提取普通黃芪提取物。
第1步，將普通黃芪加入至乙醇溶液中進(jìn)行加熱回流提取，富硒黃芪與乙醇溶液的固液比是1：6，乙醇溶液是由60vol.％的乙醇溶液中加入NaOH調(diào)節(jié)pH至9得到，提取溫度是70℃，提取時間1h，得到提取液；
第2步，將上述提取液過濾除渣之后，濾過液減壓濃縮，減壓濃縮至濾液體積減小為1/4，再將濃縮液中加入石油醚進(jìn)行萃取，石油醚的體積是濃縮液體積的1/6，得到第一萃余相；
第3步，在第一萃余相中加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，乙酸乙酯的體積是第一萃余相的體積1/4，得到第二萃余相；
第4步，將第二萃余相送入30-60目聚酰胺柱進(jìn)行上柱操作，再經(jīng)水洗至無色后，繼用70％乙醇洗脫，收集洗脫液，干澡至恒重，得到提取物。
藥效試驗
近幾年，隨著中醫(yī)藥科研事業(yè)的發(fā)展，中醫(yī)藥在免疫方面的研究越來越多。目前，用來誘導(dǎo)大鼠免疫抑制模型的常用藥物有環(huán)磷酰胺、氫化可的松、地塞米松、長春新堿等，其中環(huán)磷酰胺是應(yīng)用最廣泛，也是研究最多的一種建模藥物。環(huán)磷酰胺屬于烷化劑，可以與DNA形成交聯(lián)，抑制DNA合成，從而抑制細(xì)胞增殖，具有較強(qiáng)的免疫抑制作用。此外，還有研究表明環(huán)磷酰胺可抑制動物的體液免疫和細(xì)胞免疫，造成動物的免疫抑制。當(dāng)免疫細(xì)胞受到抗原刺激后，它們在脾臟進(jìn)行增殖分化，而胸腺則是T細(xì)胞成熟的重要場所，因此脾臟和胸腺的相對重量和免疫功能有關(guān)。
富硒黃芪提取物對免疫抑制大鼠模型免疫球蛋白的影響
1材料與方法
1.1實驗材料
1.1.1實驗藥品
富硒黃芪、普通黃芪購自甘肅省渭源縣康榮中藥材專業(yè)合作社。提取物是由上述實施例中制備得到的富硒黃芪和普通黃芪提取物，冷藏備用。使用前均用蒸餾水稀釋成1ml/0.1kg體質(zhì)量。注射用環(huán)磷酰胺(安道生)由Baxter Oncology(德國)提供。
1.1.2實驗動物
120只SPF級SD大鼠，體重(180±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研試驗中心提供。實驗動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(甘)2011-0001。
1.1.3實驗儀器
醫(yī)用低速離心機(jī)(金壇市恒豐儀器廠，型號LX-820)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號FA2004N)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號KQ-5200)。
1.2實驗方法
1.2.1免疫抑制大鼠模型的建立取110只SD大鼠，雌雄各半，腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)，每次80mg/kg，1次/d，連用3d，構(gòu)建免疫抑制模型大鼠；另取10只大鼠為空白對照，腹腔注射等體積蒸餾水。第3次注射24h后(如造模成功，記作停藥0天)，分別從模型組和空白組中各取2只大鼠，采用股動脈采血方法取3ml血液，用于測定血液WBC(如造模成功，本次檢測結(jié)果記做藥物實驗0天)，WBC顯著降低則判定為造模成功，若未顯著降低則繼續(xù)注射CTX，直至造模成功。
1.2.2動物分組與給藥 從造模成功后的模型大鼠中選取60只體況接近的免疫抑制模型大鼠，雌雄各半，按性別、體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組10只。分別為：模型組、實施例1～3富硒黃芪提取物組、普通黃芪提取物組(200mg·kg－1)，乙酸乙酸提取物組(400mg·kg－1)，實驗另設(shè)10只健康大鼠為空白組。實驗組每只大鼠按100mg/kg-1·d-1劑量灌服相應(yīng)藥物，模型組及空白組每只大鼠灌服等體積的蒸餾水，1次/d，連續(xù)7d。
1.2.3取材 給藥第7天后，各組大鼠禁食8小時，頸椎脫位法處死后股動脈取血，分離血清，-20℃保存，備檢；取各組大鼠脾臟、胸腺組織，觀察體積大小及重量變化。
1.2.4指標(biāo)檢測
(1)取全血20微升，采用全自動血球計數(shù)儀檢測外周血白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞百分比
(2)用酶聯(lián)免疫法檢測各組大鼠血清中免疫球蛋白IgG、IgM及IgA的含量。
1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理
采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，將實驗數(shù)據(jù)所得結(jié)果用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)”表示，組間比較行單因素方差分析(One-Way-Anova)，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
2結(jié)果
2.1富硒黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠外周血血常規(guī)的影響
與空白組比較，模型組大鼠外周血血象各數(shù)顯著降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，各干預(yù)組大鼠外周血血象數(shù)據(jù)有所升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。
表1富硒黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠外周血血常規(guī)的影響(x±S)
注：與空白對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05；
與實施例2組比較，△P＜0.05；與實施例3組比較，×P＜0.05。
與空白對照組比較，▼P>0.95。
2.2富硒黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠免疫球蛋白IgG、IgM及IgA表達(dá)水平的影響
與空白組比較，模型組大鼠免疫球蛋白表達(dá)水平顯著降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，個干預(yù)組大鼠免疫球蛋白表達(dá)水平有所升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。
表2黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠免疫球蛋白IgG、IgM及IgA表達(dá)水平的影響(x±S)
注：與空白對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。
與實施例2組比較，△P＜0.05；與實施例3組比較，×P＜0.05。
與空白對照組比較，▼P>0.95。
本實驗研究中，環(huán)磷酰胺模型組大鼠注射環(huán)磷酰胺第3天即出現(xiàn)蜷縮弓背，毛蓬豎，少光澤，閉目、體重減輕等體征，與正常小鼠有明顯區(qū)別。解剖觀察動物的胸腺，脾臟明顯縮小，與正常組小鼠有明顯區(qū)別，同時模型組數(shù)據(jù)表明，環(huán)磷酰胺可引起大鼠白細(xì)胞計數(shù)及其淋巴細(xì)胞百分比、血清免疫球蛋白水平下降，指標(biāo)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，說明大鼠的免疫功能受到明顯抑制，可認(rèn)為造免疫抑制小鼠模型成功。實驗結(jié)果表明，富硒黃芪提取物能顯著提高環(huán)磷酰胺所致兔疫抑制模型大鼠的兔疫功能，且這種作用較普通黃芪更為顯著。通過以上試驗結(jié)果可以看出，通過石油醚對乙醇提取物進(jìn)行提取之后，可以有效地去除一部分酯類物質(zhì)，提高藥效；通過采用聚酰胺柱進(jìn)行純化之后，明顯相對于其它的樹脂具有較好的純化效果；同時乙酸乙酸的二級萃取也可以去除一部分低活性成分，乙酸乙酯提取部的活性與空白組無顯著差異。
富硒黃芪提取物對免疫抑制大鼠細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ及TNF-α的影響
1材料與方法
1.1實驗材料
1.1.1實驗藥品與試劑
富硒黃芪、黃芪購自甘肅省渭源縣康榮中藥材專業(yè)合作社。提取物是由上述實施例中制備得到的富硒黃芪和普通黃芪提取物，冷藏備用。使用前均用蒸餾水稀釋成1ml/0.1kg體質(zhì)量。注射用環(huán)磷酰胺(安道生)由Baxter Oncology(德國)提供。酶聯(lián)免疫試劑盒：白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)，均有南京建成生物工程研究所提供。
1.1.2實驗動物
110只SPF級SD大鼠，體重(180±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研試驗中心提供。實驗動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(甘)2011-0001。
1.1.3實驗儀器
醫(yī)用低速離心機(jī)(金壇市恒豐儀器廠，型號LX-820)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號FA2004N)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號KQ-5200)。
1.2實驗方法
1.2.1免疫抑制大鼠模型的建立 取110只SD大鼠，雌雄各半，腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)，每次80mg/kg，1次/d，連用3d，構(gòu)建免疫抑制模型大鼠；另取10只大鼠為空白對照，腹腔注射等體積蒸餾水。第3次注射24h后(如造模成功，記作停藥0天)，分別從模型組和空白組中各取2只大鼠，采用股動脈采血方法取3ml血液，用于測定血液WBC(如造模成功，本次檢測結(jié)果記做藥物實驗0天)，WBC顯著降低則判定為造模成功，若未顯著降低則繼續(xù)注射CTX，直至造模成功。
1.2.2動物分組與給藥 從造模成功后的模型大鼠中選取60只體況接近的免疫抑制模型大鼠，雌雄各半，按性別、體質(zhì)量隨機(jī)分為6組，每組10只。分別為：模型組、實施例1～3富硒黃芪提取物組、普通黃芪提取物組(200mg·kg－1)，乙酸乙酸提取物組(400mg·kg－1)，實驗另設(shè)10只健康大鼠為空白組。實驗組每只大鼠按100mg/kg-1·d-1劑量灌服相應(yīng)藥物，模型組及空白組每只大鼠灌服等體積的蒸餾水，1次/d，連續(xù)7d。
1.2.3取材 給藥第7天后，各組大鼠禁食8小時，頸椎脫位法處死后股動脈取血，分離血清，-20℃保存，備檢。
1.2.4指標(biāo)檢測
(1)處死后取出胸腺、脾臟，記錄重量變化，按“胸腺(mg)/體質(zhì)量(g)、脾臟(mg)/體質(zhì)量(g)”計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。
(2)用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測大鼠血清IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ等免疫細(xì)胞因子含量。
1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理
采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，將實驗數(shù)據(jù)所得結(jié)果用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)”表示，組間比較行單因素方差分析(One-Way-Anova)，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
2結(jié)果
2.1富硒黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響
與空白組比較，模型組大鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)顯著降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，各干預(yù)組大鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)有所升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。
表3黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響(x±S)
注：與空白對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。
與實施例2組比較，△P＜0.05；與實施例3組比較，×P＜0.05。
與空白對照組比較，▼P>0.95。
2.2富硒黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ表達(dá)水平的影響
與空白組比較，模型組大鼠免疫細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IFN-γ)含量顯著降低，免疫細(xì)胞因子TNF-α含量顯著升高，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，各干預(yù)組大鼠免疫細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IFN-γ)含量有所升高，免疫細(xì)胞因子TNF-α含量有所降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。
表4富硒黃芪提取物對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制大鼠免疫細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4含量的影響(x±S)
注：與空白對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。
與實施例2組比較，△P＜0.05；與實施例3組比較，×P＜0.05。
與空白對照組比較，▼P>0.95。