本發(fā)明涉及一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，具體屬于熒光輔助凝膠電泳技術(shù)，以黃芪多糖部分酸水解后差異性糖片段的含量為鑒定依據(jù)的蒙古黃芪和膜莢黃芪的鑒別方法。
背景技術(shù)：
：黃芪，古名黃耆，素有“補(bǔ)益之長”的美譽(yù)，收載于歷版的《中國藥典》，是豆植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補(bǔ)氣固表，利尿托毒，斂瘡生肌等功效，有“十藥九芪”之說，備受歷代中醫(yī)的青睞。且以黃芪為原料的中成藥多達(dá)200余種國內(nèi)市場(chǎng)對(duì)黃芪的需求極大，其中約有50％用于生產(chǎn)黃芪飲片，近50％用于中成藥和提取物及制劑。蒙古黃芪和膜莢黃芪因其化學(xué)成分有差異而導(dǎo)致其藥效有所不同，雖然在植物地上部分形態(tài)特征和生物學(xué)特征方面也有明顯區(qū)別，但其藥用部分黃芪根外形比較相近，肉眼難以區(qū)別。因此，近年來藥材市場(chǎng)上出現(xiàn)了兩種黃芪混雜現(xiàn)象，擾亂了中藥材市場(chǎng)。臨床研究表明，糖類成分是黃芪發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要物質(zhì)。將糖類成分作為黃芪質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的研究前景和意義。國內(nèi)外學(xué)者也嘗試以總多糖含量對(duì)不同種屬的黃芪進(jìn)行比較，然而，所測(cè)定的指標(biāo)缺乏黃芪種屬的專屬性特征，難以用于黃芪種屬的鑒別。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有的蒙古黃芪和膜莢黃芪鑒別方法專屬性低、難以鑒別黃芪種屬的技術(shù)問題，提供一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，包括如下步驟：1)原料預(yù)處理：將干燥的黃芪粉碎成粉末后過100目篩得到黃芪細(xì)粉，備用；2)提取粗多糖：取上述黃芪細(xì)粉加水后在100℃的溫度下回流提取1h，降至室溫后離心取上清液；殘?jiān)偌铀貜?fù)提取1次，取上清，合并上清液；濃縮，將合并的上清液用95％的乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為80％，3000r/min離心10min，合并沉淀，冷凍干燥得多糖粗粉；3)純化多糖：將步驟2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉與水的質(zhì)量比為1:200，向多糖粗粉溶液中加入濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液，所述濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液的加入量均為多糖粗粉溶液體積的10％，振搖后靜置30min，離心得到純化多糖，凍干，備用；4)多糖酸水解：取步驟3)得到的純化多糖10mg，加入0.5mol/l三氟乙酸500μl，混勻，隨后將混合液置于90℃保溫1h，反應(yīng)結(jié)束后，用氮吹干燥儀干燥多糖酸水解產(chǎn)物，然后加入適量甲醇清洗水解產(chǎn)物，繼續(xù)氮?dú)獯蹈桑?)多糖酸水解產(chǎn)物、三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化：取三糖標(biāo)準(zhǔn)品6mg、二糖標(biāo)準(zhǔn)品2mg以及步驟4)中得到的多糖酸水解產(chǎn)物，分別加入200μl的nacnbh3溶液，再分別加入200μl的ants衍生化試劑，渦旋，混勻；37℃恒溫反應(yīng)15h后，將三種產(chǎn)物用氮?dú)獯蹈?，溶?ml6mol/l的尿素溶液，制成三糖標(biāo)準(zhǔn)品、二糖標(biāo)準(zhǔn)品及多糖酸水解產(chǎn)物的衍生化樣品，其中三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品用6mol/l的尿素溶液分別稀釋成不少于6個(gè)濃度梯度的衍生化樣品；6)衍生化樣品電泳分析：取步驟5)中多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品，采用垂直板凝膠電泳分離每個(gè)衍生化樣品，分離膠為濃度為30％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，電泳緩沖液為ph8.0-9.0、濃度0.1-0.2mol/l的tris-boric，上樣量為1-3μl，凝膠在uv300nm條件下成像，獲得多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖；7)繪制三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖導(dǎo)入quantityone軟件，經(jīng)過處理后，得到多糖酸水解產(chǎn)物及三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值，以三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；8)蒙古黃芪和膜莢黃芪的鑒別：將多糖酸水解產(chǎn)物的光密度值帶入步驟7)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃芪多糖中三糖和二糖的含量，并根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪：當(dāng)二糖含量＜1.0mg/ml，且二糖含量/三糖含量＜0.3時(shí)，為蒙古黃芪；當(dāng)二糖含量＞1.0mg/ml，且二糖含量/三糖含量＞0.3時(shí)，為膜莢黃芪。進(jìn)一步地，步驟2)中所述黃芪細(xì)粉與水的質(zhì)量比為1:100。進(jìn)一步地，步驟2)中所述殘?jiān)c水的質(zhì)量比為1:80。進(jìn)一步地，步驟6)中分離膠和濃縮膠的配制溶劑為ph8.0～9.0、濃度0.1～0.2mol/l的tris-boric緩沖液。進(jìn)一步地，步驟6)中的電泳分離過程分兩步進(jìn)行，首先采用60-80v的分離電壓電泳分離40-60min，隨后采用100-200v的分離電壓電泳分離100-120min。本發(fā)明的有益效果是：1)本發(fā)明將黃芪中的多糖部分酸水解，利用熒光輔助凝膠電泳技術(shù)分析，找出蒙古黃芪和膜莢黃芪糖成分的差異，用于黃芪種屬的鑒別。該方法不僅操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)成本低，而且不同種屬黃芪多糖部分酸水解后形成的糖組分差異明顯，可用于黃芪藥材種屬的鑒別。2)本發(fā)明采用的熒光輔助凝膠電泳(pace)技術(shù)，是一種十分便捷的多糖水解產(chǎn)物分離技術(shù)，具有分辨率高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、可多個(gè)樣品同時(shí)分析等特點(diǎn)；由于糖類化合物不帶紫外或熒光基團(tuán)，本發(fā)明在進(jìn)行pace分析之前，使用衍生化試劑8-氨基萘-1，3，6-三磺酸鈉(ants)對(duì)多糖水解產(chǎn)物做衍生化處理，使多糖水解產(chǎn)物攜帶紫外基團(tuán)和熒光基團(tuán)，使檢測(cè)的靈敏度大大提高。附圖說明圖1為不同種屬黃芪多糖部分酸水解產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖2為不同種屬黃芪多糖部分酸水解產(chǎn)物的指紋圖譜；圖3為差異性糖片段的t檢驗(yàn)分析圖；圖4為不同種屬的黃芪多糖部分酸水解產(chǎn)物的pls-da圖；圖5為pls-da分析模型驗(yàn)證圖；圖6為差異性糖片段的載荷圖；圖7為不同種屬的黃芪多糖部分酸水解產(chǎn)物的差異性糖片段數(shù)目圖；圖8為二糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖9為三糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1本實(shí)施例中的一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，包括如下步驟：1)原料預(yù)處理：將干燥的黃芪粉碎成粉末后過100目篩得到黃芪細(xì)粉，備用；2)提取粗多糖：取上述黃芪細(xì)粉約5g，精密稱定后置于1000ml圓底燒瓶中，加水500ml，在100℃的溫度下回流提取1h，降至室溫后離心取上清液；殘?jiān)偌铀?00ml，重復(fù)提取1次，取上清，合并上清；濃縮，將合并的上清液用95％的乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為80％，3000r/min離心10min，合并沉淀，冷凍干燥得多糖粗粉；3)純化多糖：將步驟2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉與水的質(zhì)量比為1:200，向多糖粗粉溶液加入濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液，所述濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液的加入量均為多糖粗粉溶液體積的10％，振搖后靜置30min，離心得到純化多糖，凍干，備用；4)多糖酸水解：取步驟3)得到的純化多糖10mg，加入0.5mol/l三氟乙酸500μl，混勻，隨后將混合液置于90℃保溫1h，反應(yīng)結(jié)束后，用氮吹干燥儀干燥多糖酸水解產(chǎn)物，以去除其中殘留的三氟乙酸，然后加入適量甲醇清洗水解產(chǎn)物，繼續(xù)氮?dú)獯蹈桑?)多糖酸水解產(chǎn)物、三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化：取三糖標(biāo)準(zhǔn)品6mg、二糖標(biāo)準(zhǔn)品2mg以及步驟4)中得到的多糖酸水解產(chǎn)物，分別加入200μl的nacnbh3溶液，再分別加入200μl的ants衍生化試劑，渦旋，混勻；37℃恒溫反應(yīng)15h后，將三種產(chǎn)物用氮?dú)獯蹈?，溶?ml6mol/l的尿素溶液，制成三糖標(biāo)準(zhǔn)品、二糖標(biāo)準(zhǔn)品及多糖酸水解產(chǎn)物的衍生化樣品，其中三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品用6mol/l的尿素溶液分別稀釋成不少于6個(gè)濃度梯度的衍生化樣品；6)衍生化樣品電泳分析：取步驟5)中的多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品，采用垂直板凝膠電泳分離每個(gè)衍生化樣品；分離膠為濃度為30％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，所述分離膠和濃縮膠的配制溶劑均為ph8.2、濃度0.1mol/l的tris-boric緩沖液；電泳緩沖液為ph8.2、濃度0.1mol/l的tris-boric，上樣量為1μl；首先采用60v的分離電壓電泳分離60min，隨后采用200v的分離電壓電泳分離120min；凝膠在uv300nm條件下成像，獲得多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖；7)繪制三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖導(dǎo)入quantityone軟件，經(jīng)過處理后，得到多糖酸水解產(chǎn)物及三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值，以三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；8)蒙古黃芪和膜莢黃芪的鑒別：將多糖酸水解產(chǎn)物的光密度值帶入步驟7)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃芪多糖中三糖和二糖的含量，并根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪：當(dāng)二糖含量＜1.0mg/ml，且二糖含量/三糖含量＜0.3時(shí)，為蒙古黃芪；當(dāng)二糖含量＞1.0mg/ml，且二糖含量/三糖含量＞0.3時(shí)，為膜莢黃芪。本實(shí)施例中計(jì)算所得二糖含量＝0.945mg/ml，二糖含量/三糖含量＝0.289，鑒別結(jié)果為蒙古黃芪。實(shí)施例2本實(shí)施例中的一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，包括如下步驟：1)原料預(yù)處理：將干燥的黃芪粉碎成粉末后過100目篩得到黃芪細(xì)粉，備用；2)提取粗多糖：取上述黃芪細(xì)粉約5g，精密稱定后置于1000ml圓底燒瓶中，加水500ml，在100℃的溫度下回流提取1h，降至室溫后離心取上清液；殘?jiān)偌铀?00ml，重復(fù)提取1次，取上清，合并上清；濃縮，將合并的上清液用95％的乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為80％，3000r/min離心10min，合并沉淀，冷凍干燥得多糖粗粉；3)純化多糖：將步驟2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉與水的質(zhì)量比為1:200，向多糖粗粉溶液加入濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液，所述濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液的加入量均為多糖粗粉溶液體積的10％，振搖后靜置30min，離心得到純化多糖，凍干，備用；4)多糖酸水解：取步驟3)得到的純化多糖10mg，加入0.5mol/l三氟乙酸500μl，混勻，隨后將混合液置于90℃保溫1h，反應(yīng)結(jié)束后，用氮吹干燥儀干燥多糖酸水解產(chǎn)物，以去除其中殘留的三氟乙酸，然后加入適量甲醇清洗水解產(chǎn)物，繼續(xù)氮?dú)獯蹈桑?)多糖酸水解產(chǎn)物、三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化：取三糖標(biāo)準(zhǔn)品6mg、二糖標(biāo)準(zhǔn)品2mg以及步驟4)中得到的多糖酸水解產(chǎn)物，分別加入200μl的nacnbh3溶液，再分別加入200μl的ants衍生化試劑，渦旋，混勻；37℃恒溫反應(yīng)15h后，將三種產(chǎn)物用氮?dú)獯蹈?，溶?ml6mol/l的尿素溶液，制成三糖標(biāo)準(zhǔn)品、二糖標(biāo)準(zhǔn)品及多糖酸水解產(chǎn)物的衍生化樣品，其中三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品用6mol/l的尿素溶液分別稀釋成不少于6個(gè)濃度梯度的衍生化樣品；6)衍生化樣品電泳分析：取步驟5)中的多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品，采用垂直板凝膠電泳分離每個(gè)衍生化樣品；分離膠為濃度為30％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，所述分離膠和濃縮膠的配制溶劑均為ph8.5、濃度0.2mol/l的tris-boric緩沖液；電泳緩沖液為ph8.5、濃度0.2mol/l的tris-boric，上樣量為1μl；首先采用70v的分離電壓電泳分離50min，隨后采用150v的分離電壓電泳分離110min；凝膠在uv300nm條件下成像，獲得多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖；7)繪制三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖導(dǎo)入quantityone軟件，經(jīng)過處理后，得到多糖酸水解產(chǎn)物及三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值，以三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；8)蒙古黃芪和膜莢黃芪的鑒別：將多糖酸水解產(chǎn)物的光密度值帶入步驟7)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃芪多糖中三糖和二糖的含量，并根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪：當(dāng)二糖含量＜1.0mg/ml，且二糖含量/三糖含量＜0.3時(shí)，為蒙古黃芪；當(dāng)二糖含量＞1.0mg/ml，且二糖含量/三糖含量＞0.3時(shí)，為膜莢黃芪。本實(shí)施例中計(jì)算所得二糖含量＝1.06mg/ml，二糖含量/三糖含量＝0.35，鑒別結(jié)果為膜莢黃芪。實(shí)施例3本實(shí)施例中的一種鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，包括如下步驟：1)原料預(yù)處理：將干燥的黃芪粉碎成粉末后過100目篩得到黃芪細(xì)粉，備用；2)提取粗多糖：取上述黃芪細(xì)粉約5g，精密稱定后置于1000ml圓底燒瓶中，加水500ml，在100℃的溫度下回流提取1h，降至室溫后離心取上清液；殘?jiān)偌铀?00ml，重復(fù)提取1次，取上清，合并上清；濃縮，將合并的上清液用95％的乙醇調(diào)節(jié)至含醇量為80％，3000r/min離心10min，合并沉淀，冷凍干燥得多糖粗粉；3)純化多糖：將步驟2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉與水的質(zhì)量比為1:200，向多糖粗粉溶液加入濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液，所述濃度為10.6％的亞鐵氰化鉀溶液和濃度為21.9％的乙酸鋅溶液的加入量均為多糖粗粉溶液體積的10％，振搖后靜置30min，離心得到純化多糖，凍干，備用；4)多糖酸水解：取步驟3)得到的純化多糖10mg，加入0.5mol/l三氟乙酸500μl，混勻，隨后將混合液置于90℃保溫1h，反應(yīng)結(jié)束后，用氮吹干燥儀干燥多糖酸水解產(chǎn)物，以去除其中殘留的三氟乙酸，然后加入適量甲醇清洗水解產(chǎn)物，繼續(xù)氮?dú)獯蹈桑?)多糖酸水解產(chǎn)物、三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化：取三糖標(biāo)準(zhǔn)品6mg、二糖標(biāo)準(zhǔn)品2mg以及步驟4)中得到的多糖酸水解產(chǎn)物，分別加入200μl的nacnbh3溶液，再分別加入200μl的ants衍生化試劑，渦旋，混勻；37℃恒溫反應(yīng)15h后，將三種產(chǎn)物用氮?dú)獯蹈?，溶?ml6mol/l的尿素溶液，制成三糖標(biāo)準(zhǔn)品、二糖標(biāo)準(zhǔn)品及多糖酸水解產(chǎn)物的衍生化樣品，其中三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化樣品用6mol/l的尿素溶液分別稀釋成不少于6個(gè)濃度梯度的衍生化樣品；6)衍生化樣品電泳分析：取步驟5)中的多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品，采用垂直板凝膠電泳分離每個(gè)衍生化樣品；分離膠為濃度為30％的聚丙烯酰胺凝膠，濃縮膠為濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，所述分離膠和濃縮膠的配制溶劑均為ph9.0、濃度0.15mol/l的tris-boric緩沖液；電泳緩沖液為ph9.0、濃度0.15mol/l的tris-boric，上樣量為1μl；首先采用80v的分離電壓電泳分離40min，隨后采用100v的分離電壓電泳分離100min；凝膠在uv300nm條件下成像，獲得多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖；7)繪制三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線：將多糖酸水解產(chǎn)物衍生化樣品、三糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生化樣品的電泳圖導(dǎo)入quantityone軟件，經(jīng)過處理后，得到多糖酸水解產(chǎn)物及三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值，以三糖標(biāo)準(zhǔn)品和二糖標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；8)蒙古黃芪和膜莢黃芪的鑒別：將多糖酸水解產(chǎn)物的光密度值帶入步驟7)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃芪多糖中三糖和二糖的含量，并根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪：當(dāng)二糖含量＜1.0mg/ml，且二糖含量/三糖含量＜0.3時(shí)，為蒙古黃芪；當(dāng)二糖含量＞1.0mg/ml，且二糖含量/三糖含量＞0.3時(shí)，為膜莢黃芪。本實(shí)施例中計(jì)算所得二糖含量＝1.225mg/ml，二糖含量/三糖含量＝0.287，鑒別結(jié)果為蒙古黃芪。上述實(shí)施例中的二糖標(biāo)準(zhǔn)品和三糖標(biāo)準(zhǔn)品來自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為100287-201102、100274。本發(fā)明鑒別黃芪種屬的標(biāo)準(zhǔn)是通過以下實(shí)驗(yàn)獲得的。實(shí)驗(yàn)中采用的蒙古黃芪取自甘肅隴西及山東文登等地，膜莢黃芪取自山西渾源及黑龍江等地，2類黃芪各取12個(gè)樣本。按照本發(fā)明的方法對(duì)選取的黃芪樣本進(jìn)行處理，然后采用凝膠電泳法進(jìn)行分離，得到每個(gè)黃芪樣品的電泳圖，如圖1所示，圖中，s為含有6個(gè)聚合度的糖標(biāo)準(zhǔn)品，1-12號(hào)為蒙古黃芪樣品，13-24號(hào)為膜莢黃芪樣品，dp表示單糖聚合度，dp1-dp6分別為一糖、二糖、三糖、二糖、五糖和六糖。將圖1中的電泳圖導(dǎo)入quantityone軟件，經(jīng)過處理后，得到與電泳圖相對(duì)應(yīng)的指紋圖譜，如圖2所示，圖中，1-12號(hào)為蒙古黃芪樣品，13-24號(hào)為膜莢黃芪樣品。將圖2中的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入spss16.0進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，得到圖3，由圖3可知，二糖具有顯著性差異，即二糖是區(qū)分黃芪種屬的主要差異性片段，圖中*代表顯著性差異的多糖片段。將圖2中的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入smica-p13.0進(jìn)行分析，分析結(jié)果如圖4、圖5和圖6，圖4為不同種屬的黃芪多糖部分酸水解產(chǎn)物的pls-da圖，由圖4可知，蒙古黃芪和膜莢黃芪可以得到很明顯的分離；圖5為pls-da分析模型的驗(yàn)證圖，圖中r2為解釋模型值，q2為預(yù)測(cè)模型值，由圖5可知pls-da模型驗(yàn)證成立，該模型可用于黃芪種屬鑒別中差異性糖片段的尋找；圖6為差異性糖片段的載荷圖，由圖6可知散點(diǎn)離中心較遠(yuǎn)，不同種屬的黃芪間差異較大。對(duì)差異性糖片段數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到圖7，由圖7可知，三糖和二糖是區(qū)分黃芪種屬的主要差異性片段。將圖2指紋圖譜中的光密度值分別帶入二糖標(biāo)準(zhǔn)品和三糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黃芪樣品中的二糖及三糖含量，圖8和圖9分別為二糖標(biāo)準(zhǔn)品和三糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，圖中，y為光密度值，x為濃度值，r2為相關(guān)系數(shù)，計(jì)算結(jié)果如表1所示；黃芪樣品編號(hào)二糖含量(mg/ml)三糖含量(mg/ml)二糖含量/三糖含量10.8733.3100.26420.8093.0880.26230.9853.3840.29140.9453.2700.28950.6813.0130.22660.7833.0580.25670.8642.9580.29280.7482.6620.28190.8572.8660.299100.6852.9910.229110.7952.9780.267120.7742.6600.291131.0263.1670.324141.1023.1580.349151.2983.1970.406161.0963.0360.361171.1123.0380.366181.3723.3300.412191.0162.5090.405201.1342.9610.383211.0282.7630.372221.1232.8940.388231.2312.9590.416241.0352.9740.348表1表1為24個(gè)黃芪樣品的二糖及三糖的含量及其比值；由表1可知，1-12號(hào)蒙古黃芪樣品中的二糖含量均小于1.0mg/ml，且二糖含量與三糖含量的比值均小于0.3；13-24號(hào)膜莢黃芪樣品中的二糖含量均大于1.0mg/ml，且二糖含量與三糖含量的比值均大于0.3。因此，本發(fā)明可以將二糖、三糖的含量作為鑒別黃芪種屬的標(biāo)準(zhǔn)，即當(dāng)二糖含量＜1.0mg/ml，且二糖含量/三糖含量＜0.3時(shí)，為蒙古黃芪；當(dāng)二糖含量＞1.0mg/ml，且二糖含量/三糖含量＞0.3時(shí)，為膜莢黃芪。當(dāng)前第1頁12