本發(fā)明涉及敲除dcf1基因在制備緩解阿爾茲海默癥狀藥物中的應(yīng)用。

發(fā)明背景

ad(alzheimerdisease)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其臨床表現(xiàn)主要是進(jìn)行性癡呆，病理特征是在腦組織中出現(xiàn)老年斑(senileplaques，sp)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles，nft)、神經(jīng)元減少。伴隨著老齡化社會(huì)到來(lái)，ad的發(fā)病率不斷升高。據(jù)統(tǒng)計(jì):全球約有2千多萬(wàn)ad病人，并正以每年460萬(wàn)人的速度增加。極大的降低了該人群的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命，已造成嚴(yán)重的社會(huì)影響。淀粉樣前體蛋白(amyloidprecursorprotein，app)經(jīng)過(guò)蛋白裂解酶的剪切后能夠分泌出β-淀粉樣蛋白42(amyloid-βprotein42，aβ42)和β-淀粉樣蛋白4(0amyloid-βprotein40，aβ40)，而aβ42能夠?qū)е掳柶澓ＤY(ad)，ad的發(fā)生主要表現(xiàn)為aβ42肽沉積到腦中，形成老年斑。

目前臨床針對(duì)ad的藥物干預(yù)大多采用改善認(rèn)知功能，延緩疾病進(jìn)展的方法。第一類是作用于神經(jīng)遞質(zhì)的藥物：加強(qiáng)中樞膽堿能活動(dòng)，可以改善老年人的學(xué)習(xí)記憶能力。膽堿治療目的是促進(jìn)和維持殘存的膽堿能神經(jīng)元的功能。第二類是腦代謝賦活藥物：此類藥物的作用較多而復(fù)雜，主要是擴(kuò)張腦血管，增加腦皮質(zhì)細(xì)胞對(duì)氧、葡萄糖、氨基酸和磷脂的利用，促進(jìn)腦細(xì)胞的恢復(fù)，改善腦細(xì)胞功能。這些藥物的藥效維持能力較為有限，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，治療效果亦會(huì)減弱，并且會(huì)出現(xiàn)較強(qiáng)的藥物依賴情況，副作用較大。

樹(shù)突狀細(xì)胞因子(dendriticcellfactor1，dcf1)，也稱為跨膜蛋白59(transmembraneprotein59，tmem59)，屬于一種單次跨膜蛋白。目前ad相關(guān)研究顯示，在ad患者和模型小鼠的大腦內(nèi)，都可以檢測(cè)出β-淀粉樣蛋白沉淀，這種異常的蛋白沉積與ad患者和模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶力障礙密切相關(guān)。研究顯示，淀粉樣蛋白的沉積在神經(jīng)元退化和凋亡，神經(jīng)通路退化中扮演著重要角色。app蛋白是i型跨膜蛋白，由位于細(xì)胞膜外的n末端長(zhǎng)片段和細(xì)胞內(nèi)的c末端較短片段構(gòu)成，廣泛存在于全身很多組織細(xì)胞膜的突觸上。app在ad中起著至關(guān)重要的作用。迄今為止，國(guó)內(nèi)外的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)dcf1基因可以抑制app的糖基化從而使不成熟的app滯留在高爾基體內(nèi)。但是，在完整的動(dòng)物模型中去研究dcf1和ad的關(guān)系還未見(jiàn)諸報(bào)端。鑒于現(xiàn)有的ad治療藥物并不能起到人們預(yù)期的效果，而基因治療可能是取得突破的關(guān)鍵治療手段，我們用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的小鼠和引進(jìn)的ad模型小鼠雜交，得到了敲除dcf1基因的ad模型小鼠。

因此，以dcf1基因?yàn)榘悬c(diǎn)應(yīng)用于ad的治療，期望其能夠減少ad疾病中淀粉樣蛋白的產(chǎn)生和聚集，緩解神經(jīng)元損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退化，從而達(dá)到緩解并改善ad患者的癥狀。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種dcf1基因在制備緩解阿爾茲海默疾病癥狀藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種敲除dcf1基因在制備減少β-淀粉樣蛋白42的產(chǎn)生和聚集藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種敲除dcf1基因在制備緩解神經(jīng)元損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退化藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之四在于提供一種敲除dcf1基因在制備改善阿爾茲海默疾病中學(xué)習(xí)記憶能力障礙藥物中的應(yīng)用。

ad動(dòng)物模型為：b6.cg-tg(appswe,psen1de9)(購(gòu)于南京模式動(dòng)物研究所)

此雙轉(zhuǎn)基因小鼠簡(jiǎn)稱app-ps1小鼠，表達(dá)嵌合的小鼠/人淀粉樣前體蛋白(mo/huapp695swe)和突變的人類早老素1(ps1-de9)。這些小鼠廣泛應(yīng)用于大腦神經(jīng)性疾病的研究中，特別是阿爾茨海默癥中淀粉樣蛋白斑的形成。本發(fā)明通過(guò)使用實(shí)驗(yàn)室獨(dú)有的dcf1基因敲除小鼠(dcf1^-/-小鼠)和ad模型小鼠雜交數(shù)代后，得到app-ps1-dcf1^-/-小鼠。利用同窩app-ps1小鼠作為對(duì)照進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察dcf1的敲除對(duì)于ad小鼠學(xué)習(xí)記憶力的影響情況。

本發(fā)明新穎之處在于首次提出用dcf1基因治療ad疾病，并且發(fā)現(xiàn)小鼠中敲除dcf1基因可以有效緩解ad疾病。本發(fā)明中以ad小鼠模型為載體，應(yīng)用動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)dcf1的敲除對(duì)ad小鼠模型空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示dcf1的敲除可以有效改善ad小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力障礙。

本發(fā)明主要是運(yùn)用野生型，dcf1敲除以及ad模型鼠作為對(duì)照，以敲除dcf1基因的ad模型鼠為研究對(duì)象。通過(guò)小鼠鼠腦冰凍切片硫代黃素染色發(fā)現(xiàn)敲除dcf1后可以減少老年斑沉積；從行為學(xué)方面，觀察小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，證明dcf1敲除后可以增強(qiáng)ad小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；進(jìn)而發(fā)現(xiàn)和證明dcf1的敲除可以緩解阿爾茲海默癥。同時(shí)也為研發(fā)新的ad治療藥物提供了基因靶點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為dcf1敲除后，ad模型小鼠海馬與皮層區(qū)域老年斑減少。實(shí)驗(yàn)組為app-ps1-dcf1^-/-小鼠大腦海馬區(qū)冰凍切片硫代黃素s染色，對(duì)照組為app-ps1小鼠。分別對(duì)疾病發(fā)生過(guò)程中的三個(gè)不同的年齡段進(jìn)行考察，每個(gè)年齡段的每種基因型各取3只小鼠，每只小鼠取三個(gè)連續(xù)切片，統(tǒng)計(jì)硫代黃素著色斑塊面積占白色矩形框內(nèi)腦片總面積的比值(mean±sem)a圖展示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同年齡段的小鼠全腦老年斑沉積情況；b圖是實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組不同年齡段的小鼠硫代黃素著色斑塊面積占白色矩形框內(nèi)腦片總面積的比值的統(tǒng)計(jì)情況；c圖是實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠大腦海馬dg區(qū)形成的單個(gè)老年斑的放大圖片。(***表示與對(duì)照組比較p<0.001；**表示與對(duì)照組比較p<0.01；*表示與對(duì)照組比較p<0.05；其中樣本量n＝3)。

圖2為dcf1敲除后，ad模型小鼠水迷宮和y迷宮行為學(xué)顯示，dcf1的敲除緩解了ad癥狀。實(shí)驗(yàn)組為12個(gè)月的app-ps1-dcf1^-/-小鼠，對(duì)照組為app-ps1小鼠以及wt，dcf1^-/-小鼠。a圖和b圖顯示敲除dcf1后，12月齡ad模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力回到野生型的水平，在野生型中單獨(dú)敲除dcf1對(duì)小鼠沒(méi)有影響；c圖是第九天測(cè)試時(shí)候各個(gè)基因型代表性軌跡圖；d圖是各個(gè)基因型在y迷宮中的代表性軌跡圖；e圖是各個(gè)基因型在新異壁中的停留時(shí)間統(tǒng)計(jì)圖，顯示了敲除dcf1后，ad小鼠在新異壁中的停留時(shí)間增長(zhǎng)。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。

1.冰凍切片的制作：

(a)試劑和材料準(zhǔn)備4％pfa：0.2mpb250ml，nacl4.5g，加200mlddh2o，放入37℃搖床，待pfa完全溶解，定容至500ml，保存于4℃冰箱，一般可保存2-3個(gè)月。0.9％nacl：稱取9gnacl，加900mlddh2o，定容至1l，保存于4℃。20％蔗糖溶液：稱取100g蔗糖，加0.2mpb25ml，nacl4.5g，加200mlddh2o，待蔗糖溶解，定容至500ml。30％蔗糖溶液：稱取150g蔗糖，加0.2mpb25ml，nacl4.5g，加200mlddh2o，待蔗糖溶解，定容至500ml。鉻明膠溶液配制：0.5％明膠+0.1％鉻明礬，稱取2.5g明膠，加500mlddh2o，60℃水浴鍋溶解明膠后，再加入0.5g鉻明礬，待完全溶解后，0.22μm濾膜過(guò)濾。載玻片的準(zhǔn)備：將全新的免洗玻片放入無(wú)水乙醇中浸泡過(guò)夜，第二天用干凈的絲綢布將玻片撈出擦拭干凈，置于玻片鐵架上，然后浸入預(yù)熱60℃的鉻明膠溶液1分鐘，取出后用力甩干玻片上多余液體，37℃烘干，此步驟做三次，將玻片放在干燥無(wú)灰塵的地方保持，待用。

(b)小鼠心臟灌流(1)用2％戊巴比妥鈉溶液，按照100μl/30g腹腔注射小鼠。(2)待小鼠處于麻醉狀態(tài)時(shí)，將小鼠四肢固定于白色泡沫板上。(3)用眼科剪將小鼠腹腔、胸腔及心包膜打開(kāi)，并暴露出心臟。(4)左心室進(jìn)針，止血鑷固定針尖，剪破右心耳，進(jìn)針不能太深，不然會(huì)穿到右心室，進(jìn)入肺循環(huán)，灌注速度也不要太快，不然也會(huì)灌到肺循環(huán)那邊。(5)推動(dòng)裝有預(yù)冷生理鹽水的注射器，將體循環(huán)中血液排盡，當(dāng)出口處無(wú)明顯血液顏色，肝臟表面發(fā)白時(shí)，換成預(yù)冷的4％pfa進(jìn)行灌注，結(jié)束后小鼠四肢會(huì)變得冰冷僵硬。

(c)鼠腦固定脫水(1)用眼科剪和眼科鑷取出完整鼠腦，若灌流效果出色，小鼠腦袋呈現(xiàn)發(fā)白狀，無(wú)血色，放在4％pfa中繼續(xù)固定4-6小時(shí)。(2)用1×pbs清洗鼠腦，去除多余4％pfa、然后浸泡至裝有20％蔗糖溶液的50ml離心管中，待鼠腦下沉至管底，移走20％蔗糖溶液，加入30％蔗糖溶液。(3)待鼠腦在30％蔗糖溶液中沉入管底，取出鼠腦，用濾紙吸干鼠腦表面，然后將腦袋置于橡膠翻口塞中，用otc包埋劑浸沒(méi)腦袋，需做好鼠腦方位標(biāo)記，方便切片時(shí)確定鼠腦前后位置，一般標(biāo)記嗅球所在方位，放在-80℃冰箱迅速凍結(jié)成塊，以待切片之用。

(d)切片(1)將置于-80℃的鼠腦標(biāo)本拿出，置于-20℃的冰凍切片機(jī)1小時(shí)，目的是使樣本溫度升至-20℃。(2)樣品托上抹一層otc包埋劑，將樣本從橡膠翻口塞取出，置于其上，平放于切片機(jī)內(nèi)，一定要注意標(biāo)記樣本的方位，方便后續(xù)切片。(3)切片機(jī)保持-20℃恒溫，切片不受外界溫度和環(huán)境影響，切片時(shí)，首先找到目標(biāo)位置，調(diào)節(jié)防卷板的前后位置，找到最佳貼片位置，載玻片附貼組織切片時(shí)切勿上下移動(dòng)，一般切片厚度20μm，貼好的玻片在切片機(jī)的玻璃蓋上放置30分鐘后放入玻片盒，37℃烘箱過(guò)夜后可用于免疫組化，暫時(shí)不用的切片可置于-80℃冰箱長(zhǎng)期保存。

2.硫代黃素s染色：

(a)所需試劑：(1)用pbs配置05％的硫代黃素s染色液；(2)01％tritonx-100-pbs通透劑；(3)用超純水配置50％的脫色液。

(b)染色步驟：(1)將冰凍切片拿出恢復(fù)至室溫，pbs西三次每次5min；(2)用0.1％tritonx-100-pbs通透30min；(3)用硫代黃素s染色液染色12h；(4)用脫色液脫色30min。(5)用熒光封片劑封片。

(c)觀察方法：使用蔡司激光共聚焦顯微鏡觀察和拍攝全腦橫截面圖片。

參見(jiàn)圖1，本實(shí)驗(yàn)證明了在ad模型小鼠中dcf1基因的敲除減少了老年斑的聚集從而緩解了ad疾病。a為不同年齡段app-ps1小鼠和app-ps1-dcf1^-/-小鼠全腦老年斑檢測(cè)，其中白色方框區(qū)域用來(lái)統(tǒng)計(jì)老年斑面積。b為老年斑面積占區(qū)域內(nèi)腦片面積的百分比統(tǒng)計(jì)圖?？梢?jiàn)敲除了dcf1以后，app-ps1小鼠的老年斑在6個(gè)月和9個(gè)月分別有顯著性緩解(p<0.05)，17個(gè)月也有顯著性緩解(p<0.01)。c為敲除dcf1以后app-ps1小鼠海馬dg區(qū)單個(gè)老年斑面積明顯減小。

3.行為學(xué)觀察：

(a)水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.架設(shè)好攝像頭與實(shí)驗(yàn)裝置，調(diào)整好光度，水溫調(diào)整在20℃-22℃。

2.取實(shí)驗(yàn)小鼠提前放入實(shí)驗(yàn)房間適應(yīng)環(huán)境30min。

3.設(shè)置好noldus行為學(xué)分析軟件，把實(shí)驗(yàn)區(qū)域劃平均分為四個(gè)象限，在第一象限放置平臺(tái)，平臺(tái)低于水面1.5cm，在軟件換面捕捉區(qū)域劃分出平臺(tái)區(qū)域。

4.取實(shí)驗(yàn)鼠放入水中，自由活動(dòng)1min，如果實(shí)驗(yàn)鼠在1min內(nèi)找到平臺(tái)，記錄實(shí)驗(yàn)鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，實(shí)驗(yàn)鼠在平臺(tái)上待30s后放回鼠籠中；如果實(shí)驗(yàn)鼠在1min內(nèi)沒(méi)找到平臺(tái)，引導(dǎo)實(shí)驗(yàn)鼠到達(dá)平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)鼠在平臺(tái)上待30s后放回鼠籠中。

5.按步驟4重復(fù)測(cè)試完所有實(shí)驗(yàn)鼠，實(shí)驗(yàn)時(shí)間控制在9:00-19:00。

6.第二天到第八天重復(fù)步驟4、5.

7.取出平臺(tái)，取實(shí)驗(yàn)鼠放入水中，自由活動(dòng)2min。記錄實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)入第一象限的時(shí)間、穿過(guò)平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)。

(b)y-迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.架設(shè)好攝像頭與實(shí)驗(yàn)裝置，調(diào)整好光度。

2.取實(shí)驗(yàn)用小鼠提前放在實(shí)驗(yàn)房間適應(yīng)環(huán)境30min。

3.設(shè)置好noldus行為學(xué)分析軟件，把實(shí)驗(yàn)區(qū)域劃分為為新異臂和原始區(qū)，兩者之間用擋板隔開(kāi)。

4.取實(shí)驗(yàn)鼠放入原始區(qū)，實(shí)驗(yàn)鼠在原始區(qū)自由活動(dòng)5min。

5.拿開(kāi)擋板，實(shí)驗(yàn)鼠自由活動(dòng)5min，記錄實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)入新異臂的次數(shù)和在新異臂活動(dòng)的時(shí)間。

6.取出實(shí)驗(yàn)鼠放回鼠籠中，清除實(shí)驗(yàn)鼠在y-迷宮中產(chǎn)生的垃圾，均勻噴灑75％酒精，擦拭干凈實(shí)驗(yàn)裝置。用擋板隔開(kāi)新異臂和原始區(qū)，靜置3min，使75％酒精完全揮發(fā)掉。

7.重復(fù)步驟4、5、6，依次測(cè)試完所有實(shí)驗(yàn)鼠。實(shí)驗(yàn)時(shí)間控制在9:00-19:00。

參見(jiàn)圖2，a代表在水迷宮訓(xùn)練期間，敲除dcf1以后，app-ps1小鼠表現(xiàn)出明顯的緩解，空間學(xué)習(xí)能力提升。b代表在水迷宮測(cè)試期間，敲除dcf1以后，app-ps1小鼠表現(xiàn)出緩解，空間記憶能力提升。c圖是訓(xùn)練期間各個(gè)基因型具有代表性的游泳軌跡圖。d圖是y迷宮測(cè)試時(shí)各個(gè)基因型具有代表性的運(yùn)動(dòng)軌跡圖。e圖是y迷宮測(cè)試，敲除了dcf1的app-ps1小鼠呈現(xiàn)出學(xué)習(xí)識(shí)別能力的提升。