專利名稱：一種用于預(yù)防和治療阿爾茲海默氏病的具有免疫原性的肽組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包含肽免疫原的用于預(yù)防和治療阿爾茲海默氏病的組合物。更具體地，該肽免疫原包含一個主要的功能/調(diào)控位點，一個與具有多個二類MHC結(jié)合基序的輔助T細胞表位(Th)連接的淀粉樣蛋白β(Aβ)肽的N末端片段。該肽免疫原引發(fā)針對Aβ肽的主要功能/調(diào)控位點的定點免疫反應(yīng)并產(chǎn)生抗體，所述抗體與在阿爾茲海默氏病患者腦中形成的可溶性Aβ1-42肽及淀粉樣蛋白斑高度交叉反應(yīng)。引發(fā)的對可溶性Aβ1-42肽交叉反應(yīng)的抗體促進原纖維解聚，抑制原纖維聚集，導(dǎo)致“可溶性Aβ衍生的毒素”的免疫中和；而且與淀粉樣蛋白斑交叉反應(yīng)，促進從腦中清除這些斑塊。因此，本發(fā)明的包含該肽免疫原的組合物可用于預(yù)防和治療阿爾茲海默氏病。
背景技術(shù)：
阿爾茲海默氏病(AD)是一種慢性神經(jīng)變性疾病，其特征表現(xiàn)為患者喪失認知能力并具有嚴重的行為異常，從而導(dǎo)致患者的最終死亡。目前在美國有250萬到400萬AD患者，全世界有1700萬到2500萬AD患者。該病在西方國家已經(jīng)成為繼心臟病、癌癥和中風(fēng)之后第四位導(dǎo)致死亡的疾病。ARICEPT是一種乙酰膽堿酯酶抑制劑，已被FDA批準用于減緩阿爾茲海默氏病患者的惡化速率。然而，該藥僅對限定的時期和某些患者有效。至今還沒有明確的治療或治愈該破壞性疾病。
兩種微觀的沉淀物即神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)和老年淀粉樣蛋白斑由Alois Alzheimer鑒定為該病的病理標記。神經(jīng)原纖維纏結(jié)由兩條10nm寬稱為成對螺旋絲(PHFs)的細絲相互纏繞而成，其主要組成部分是磷酸化的tau蛋白。tau蛋白262位氨基酸絲氨酸的磷酸化是一個關(guān)鍵步驟，導(dǎo)致tau蛋白生理上的功能紊亂。PHFs存在于胞內(nèi)，并且在許多異常的樹突和軸突過程中或組成老年淀粉樣蛋白斑外圍的神經(jīng)突中有發(fā)現(xiàn)。老年淀粉樣蛋白斑由橫截面面積高達150μm的紊亂的神經(jīng)嗜細絲(neurophil filament)和一個淀粉樣沉積物的胞外核組成。腦淀粉樣蛋白斑在超微結(jié)構(gòu)上不同于PHFs，由4-8nm寬的不成對纏繞在一起的細絲組成。斑核由最初命名為A4的相對分子量(M)約為4,000的肽聚集物組成(Masters等.，Proc Natl Acad Sci USA，1985，824245-4249)。
現(xiàn)在被重新命名為淀粉樣蛋白β肽(或Aβ1-42)的A4的部分氨基酸序列顯示與從阿爾茲海默氏病或唐氏綜合癥的患者腦血管中分離的淀粉樣β蛋白相似(Glenner和Wong，Biochem Biophys Res Comm，1984；120885-890；1221131-1135)。
因許多原因已推測Aβ1-42與AD相關(guān)。首先，在外周淀粉樣變性病中，如初級輕鏈疾病或次級AA淀粉樣變性，大量的淀粉樣蛋白負荷與組織和器官功能紊亂強烈相關(guān)。第二，淀粉樣蛋白斑的密度與AD中XX癡呆值(premortem dementia score)正相關(guān)。第三，Aβ1-42沉淀物是AD和相關(guān)疾病，如唐氏綜合癥中最早出現(xiàn)的神經(jīng)病理標志物，比NFT的形成早20-30年。第四，β-淀粉樣變性對AD和相關(guān)疾病是相對特異的。第五，Aβ1-42對神經(jīng)元有毒性作用(Yankner等.，Science，1990；250279-282)。最后，在淀粉樣前體蛋白(APP)結(jié)構(gòu)基因中的錯義突變導(dǎo)致家族性AD的早期發(fā)作(Goate等.，Nature，1991；349704-706；Mullan等.，NatureGenetics，1992；1345-347)。顯然，這樣的一個突變造成Aβ1-42的驚人的超量產(chǎn)生(Citron等.，Nature，1992；360672-674)。
1987年，Kang等(Nature，1987；325733-737)和其他三個研究組(見1987 Anderton的現(xiàn)狀文獻(status reports)，Nature，1987；325658-659和Barnes，Science，1987；235846-847)獨立地克隆到編碼Aβ1-42的基因。該基因編碼695個氨基酸殘基的MW約為79,000的蛋白質(zhì)，該蛋白現(xiàn)在被命名為淀粉樣前體蛋白(APP)，并事實上在所有的組織中都有表達。APP至少有五種剪接變異體，其中四種包含β-淀粉樣蛋白肽序列。
在家族性形式的AD中已涉及四種基因。其中的三個基因，βAPP，presenilin 1和presenilin 2發(fā)生突變時，造成常染色體顯性早期形式的AD。第四個基因載脂蛋白E具有天然存在的多態(tài)形式，ApoE4，它代表該病發(fā)展的一個主要遺傳危險因子。可獲得的證據(jù)支持下述觀點幾個獨特基因的改變可導(dǎo)致Aβ1-42產(chǎn)生和其清除之間的長期不平衡，從而引起前42個殘基和隨后40個殘基肽聚集成細胞毒素斑。已有證據(jù)確切表明這些四個基因每個的缺陷通過(1)增加Aβ1-42肽的產(chǎn)生和/或沉淀或(2)通過減少ApoE4從組織中的清除來傾向于產(chǎn)生AD表型(Selkoe，JBiol Chem，1996；27118295-18298)。
從可獲得的數(shù)據(jù)顯示，似乎聚集的而非單體形式的Aβ1-42肽能在體外通過一系列推測的相關(guān)機制誘導(dǎo)細胞功能紊亂和死亡。這些包括氧化損傷(Thomas等.，Nature，1996；380168-171；Behl等.，Cell，1994；77817-827)，胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)改變(Arispe等.，Proc Natl Acad Sci USA，1993；90567-571)和細胞骨架重組(Busciglio等.，Neuron，1995；14879-888)。即使級聯(lián)反應(yīng)假說仍處在激烈的爭論中，對淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)的一些基本步驟已形成了足夠的認識。
目前正充分開展鑒定可抑制淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)的一個或另一個步驟的小分子的藥學(xué)方法。特別感興趣的是以下兩個方法試圖通過降低Aβ1-42肽從神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的分泌來干擾Aβ1-42肽的聚集，或抑制這些胞外聚集物作用于神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞以及它們的產(chǎn)生過程的毒性。第三種方法嘗試控制似乎由聚集的Aβ1-42引發(fā)的特定炎性反應(yīng)(包括小膠質(zhì)細胞性刺激，激活典型的補體級聯(lián)反應(yīng)，細胞因子釋放和反應(yīng)性星形細胞增生)，可能證明對阿爾茲海默氏病患者是有利的。
除了上述藥學(xué)方法對AD進行干涉外，也已嘗試進行了免疫干涉。Soloman等(Proc Natl Acad.Sci，1996；93452-455；Proc Natl Aca.Sci，1997；944109-4112)表明直接針對人Aβ1-42肽的N末端區(qū)一個位點的三種特異單克隆抗體可以在各種程度上與預(yù)先形成的原纖維結(jié)合，從而導(dǎo)致它們解聚，并抑制它們的神經(jīng)毒性作用。而且還發(fā)現(xiàn)這些抗體防止纖維性Aβ1-42的形成。Solomon等(WO 01/18169)也嘗試制備噬菌體展示的Aβ1-42肽的表位，并通過腹腔注射將噬菌體展示的表位或包含該表位的肽對小鼠給藥，以引發(fā)針對Aβ1-42肽的抗體。通過大鼠嗜鉻細胞瘤(phenochromocytoma)的體外實驗表明，以1∶5稀釋的抗血清防止Aβ1-42的神經(jīng)毒性。1∶5和1∶20稀釋的抗血清也表明由于廣泛破壞纖維形態(tài)體外破壞Aβ的纖維結(jié)構(gòu)。然而，在第一次注射中所用的佐劑是弗氏完全佐劑，而第二次注射中所使用的是弗氏不完全佐劑。所用的佐劑完全不適用于人。而且，即使使用這些烈性(harsh)佐劑，所產(chǎn)生的抗體水平依然太低，幾乎沒有效用。
隨后，Schenk等(Nature，1999；400173-177)表明，在AD小鼠模型中，用Aβ1-42肽免疫抑制淀粉樣蛋白斑和相關(guān)營養(yǎng)不良神經(jīng)突的形成。然而，由于Aβ1-42的低免疫原性，所用方法需要配合使用形成烈性損害的佐劑來重復(fù)給藥抗原，以獲得更高水平的抗Aβ1-42斑的抗體，其為影響斑的形成所必需的。另外，需要注意的是，用Aβ1-42免疫可能誘導(dǎo)更多的毒性淀粉樣蛋白自身的積累(Araujo，DM & Cotman，CW，Brain Res，1992；569，141-145)。
盡管存在這些缺點，在轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型中通過類似的活性免疫所進行的額外的研究已經(jīng)對AD的免疫預(yù)防和免疫治療方法提供了保證。Janus等(Nature，2000；408979-982)描述了在AD小鼠模型中Aβ1-42肽免疫降低行為損害和斑。Morgan等(Nature，2000；408982-985)描述了Aβ1-42肽疫苗在小鼠模型中抑制記憶喪失。
免疫治療有效性的直接證據(jù)來源于對外周給藥抗Aβ肽的抗體，單克隆或多克隆抗體降低了淀粉樣蛋白的負荷的觀察(WO 99/27944；Bard等.，Nature Medicine，2000；6916-919)。雖然血清水平相對不多，但這些被動給藥的抗體，單克隆抗體3D6(抗Aβ1-5)和10D5(抗Aβ1-12)或多克隆抗Aβ1-42能夠進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在該處，抗體與斑塊結(jié)合并誘導(dǎo)對預(yù)先存在的淀粉樣蛋白斑的清除。Bard等報道，當用PDAPP小鼠(即用由血小板衍生的生長因子啟動子啟動的APP小基因轉(zhuǎn)基因的小鼠)腦切片或AD患者腦組織進行體內(nèi)檢測時，抗Aβ肽的抗體啟動小神經(jīng)膠質(zhì)細胞通過FC受體介導(dǎo)的吞噬作用和隨后的肽段降解來清除斑塊。該研究證實，在AD小鼠模型中，被動給藥抗Aβ1-42肽和Aβ1-42N末端區(qū)的抗體降低了斑塊沉淀的程度；由定點疫苗引發(fā)的單克隆抗體或多克隆抗體能夠以治療相應(yīng)水平進入CNS。
盡管在AD小鼠模型中有價值的發(fā)現(xiàn)免疫干涉，但得到一個適于人的抗AD疫苗還有很長的一段路要走(Chapman，Nature，2000；408915-916)。在實用型AD疫苗完成前，在設(shè)計和配制一個可用于人的免疫原性的組合物所必需的廣泛工作中存在主要障礙。需要通過實驗數(shù)據(jù)來進行指導(dǎo)的一些問題是(1)在Aβ中，抗體識別的特異靶位點是什么？(2)免疫原以何種方式呈現(xiàn)？(3)一個引發(fā)治療水平的抗體的免疫原在完成前，需要包括的其他位點是什么？(4)使用適于人的臨床上可接受的佐劑的有效疫苗遞送系統(tǒng)是什么？已有文獻中已公開的和需要進行的工作之間存在一個主要差距。合適的特異靶位點(即多聚Aβ1-42斑或單體可溶性Aβ1-42肽)是什么及該特異位點如何進行加工以用于免疫干涉。盡管在過去的二十年中發(fā)表了5,000篇關(guān)于Aβ1-42的文獻，淀粉樣蛋白級聯(lián)反應(yīng)假說仍處于熱烈的爭論中，Aβ1-42以何種形式用于干涉的論題仍存在爭議。如Terry及其同事所述，該論題的中心問題是纖維性淀粉樣蛋白負荷與神經(jīng)機能障礙之間聯(lián)系不大(The Neuropathology of Alzheimer Disease and the Structure Basisof its Alteratiohs，Terry等編輯.，Alzheimer Disease，187-206頁，Lippincott Williams和Wilkins，1999)。
在AD患者中，淀粉樣蛋白沉淀經(jīng)常在遠離神經(jīng)元損壞的地方形成。與病理性癡呆最有關(guān)系的是喪失突觸末端。然而，突觸末端的喪失與淀粉樣蛋白負荷的相關(guān)性很差。如果該病顯示與淀粉樣蛋白負荷相關(guān)性不大，那么Aβ的作用是什么？Klein等的題為“Targeting small A(1-42oligomersthe solution to an Alzheimer’s disease conumdrum？的文章(Trends in Neurosciences，2001；24219-224)表明原纖維不是Aβ的唯一毒性形式，而且可能不是與Aβ最相關(guān)的神經(jīng)毒素。也稱為Aβ1-42衍生的擴散型配體(ADDLs)的小的寡聚體和初原纖維，也可以具有強烈的毒性神經(jīng)活性。
進行成功免疫干涉的AD疫苗需要設(shè)計一個引發(fā)定點高親和力抗體的免疫原，所引發(fā)的抗體可以與腦組織中的老年斑結(jié)合，從而促進通過神經(jīng)膠質(zhì)細胞對這些斑的清除，和免疫中和可溶性Aβ衍生的毒素。
多年來已經(jīng)認識到產(chǎn)生高親和力的抗具有弱免疫原性的位點特異的肽的定點抗體的問題。如WO 99/27944中所證實，免疫學(xué)家和疫苗學(xué)家經(jīng)常求助于經(jīng)典的半抗原[肽]-載體蛋白偶聯(lián)物的方法。為了開發(fā)抗AD的定點疫苗，F(xiàn)renkel等嘗試通過如上所述“EFRH”-噬菌體給藥來進行抗Aβ1-42斑的免疫反應(yīng)(Proc Natl Acad.Sci 2000；9711455-11459，WO01/18169)。
一些方法使用Aβ1-42肽聚集物或Aβ1-42肽片段-載體蛋白偶聯(lián)物(WO99/27944)和用絲狀噬菌體展示的“EFRH肽”作為試劑來誘導(dǎo)針對患者中淀粉樣蛋白沉淀的免疫反應(yīng)，這些方法是麻煩而且無效的。例如，在第四次用1011噬菌體展示的EFRH表位進行免疫后，在豚鼠免疫血清中＞95％的抗體是抗該噬菌體的。僅有一小部分(＜5％)抗體是抗可溶性Aβ1-42肽的(Frenkel等.，Vaccine 2001，192615-2619，WO 01/18169)。
在EP 526,511和WO 99/27944中描述了更簡便的方法，它們公開了給藥Aβ1-42肽來治療那些已確診的AD患者，及在AD患者中產(chǎn)生“有利的”免疫應(yīng)答的條件下對患者給藥Aβ1-42或其他免疫原。然而，在WO99/27944的綜述中表明其中公開的疫苗設(shè)計存在主要缺陷。
特別是，問題在于缺少藥用和有效的疫苗遞送系統(tǒng)。WO99/27944公開了將Aβ1-42或Aβ1-42的活性片段連接到諸如霍亂毒素的載體分子上作為活性疫苗組分。見WO 99/27944第四頁。盡管第五頁教導(dǎo)了包含免疫原的藥物組合物不應(yīng)該含有弗氏完全佐劑[CFA]，但表明Aβ1-42疫苗在治療患有AD的轉(zhuǎn)基因小鼠的有效性方面的實例使用了大劑量的在CFA中的聚集的Aβ1-42肽。盡管重復(fù)列舉了與公開的免疫原性試劑一起使用以增強免疫應(yīng)答的優(yōu)選的佐劑，但實驗數(shù)據(jù)表明只有使用CFA/ICFA的制劑才能提供足夠高滴度的抗體。見WO 99/27944第25頁。在實施例1中，驗證了PDAPP小鼠中抗AD的Aβ1-42的預(yù)防效果。然而，給藥的制劑包括每只小鼠給藥100μg乳化在弗氏完全佐劑[CFA]中的聚集的Aβ42(見WO99/27944第34頁)，隨后多次注射激發(fā)劑量的乳化在弗氏不完全佐劑中的相同的Aβ1-42肽。在實施例IX中，對不同佐劑在小鼠中的免疫應(yīng)答進行了研究。當佐劑MPL，明礬，QS21和CFA/ICFA與據(jù)稱有效的免疫原AN1792(即聚集的人Aβ42)一起使用時，對Aβ1-4的抗體水平與接受CFA/ICFA疫苗的小鼠相比在統(tǒng)計學(xué)意義水平上降低。見WO 99/27944表9和59-64頁。
在使用Aβ1-42肽片段(氨基酸1-5，1-12，13-28和33-42的人A Aβ1-42肽)的情形中，將每個片段連接到作為蛋白載體的羊抗小鼠IgG。在稍后的公開內(nèi)容中，抗體對Aβ肽片段的功效僅在使用單克隆抗體進行被動免疫時才能表現(xiàn)出來(Bard等.，Nature Medicine 2000；6916-919)。這些與羊抗小鼠IgG連接的片段的效力還沒有表現(xiàn)出來。因此，表現(xiàn)出效力的唯一免疫原是溶于CFA/ICFA中的聚集的Aβ1-42肽。
直到目前，所有表現(xiàn)出效力的疫苗制劑都使用CFA/IFA作為佐劑。至此，針對Aβ1-42的肽免疫原已通過將各種Aβ1-42片段連接到羊抗小鼠免疫球蛋白上，將合成的Aβ13-28通過間-馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯連接到抗CD3的抗體上，或單獨的聚集的Aβ1-42肽來進行制備。這些免疫原，即單獨的Aβ42肽或Aβ1-42肽-載體蛋白偶聯(lián)物，在第一次免疫時用弗氏完全佐劑乳化，隨后在弗氏不完全佐劑中激發(fā)(Johnson-Wood等.，Proc Natl Acad Sci USA，1997；941550-1555；Seubert等.，Nature，1992；359325-327；Schenk等.，Nature，1999；400173-177；Janus等.，Nature 2000；408979-982；和Morgan等.，Nature，2000；408982-985)。WO 99/27944中公開的制劑或其他使用CFA和ICFA作為佐劑的制劑導(dǎo)致?lián)p害，而且對于用于人類而言過于烈性。因此，在現(xiàn)有技術(shù)中所描述的針對AD的疫苗組合物沒有一種是適于人的。
綜上所述，盡管綜述了考慮到Kline的先前公開(EP 526,511)提示Aβ1-42肽治療AD方面的潛力，但在WO99/27944中并沒有真正提供沒有問題解決的疫苗制劑以解決這個核心問題。
使用肽-載體蛋白偶聯(lián)物和Aβ1-42聚集物的另一個不利之處是這些分子非常復(fù)雜，難于表征，而且對于生產(chǎn)過程也難于開發(fā)有效的質(zhì)量控制程序。另一個不利之處是當對人體給藥時，Aβ1-42或其片段是自身分子。因此，它們在人體內(nèi)缺少免疫原性或完全不具有免疫原性。這樣有必要開發(fā)臨床上可接受的疫苗制劑來對人給藥。
已知混雜的Th表位可用來引發(fā)有效的T細胞輔助作用，而且可以與弱免疫原性的B細胞表位結(jié)合以提供有效的免疫原。精心設(shè)計的混雜的Th/B細胞表位嵌合肽已顯示對于在表達多樣MHC單元型的遺傳上多樣的群體的多數(shù)成員中引發(fā)Th應(yīng)答和得到的抗體應(yīng)答是有用的。已知了來源于許多病原體的混雜Th，如麻疹病毒F蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原。表1和2列出了許多已知的混雜Th，它們已顯示在產(chǎn)生增強短的具有弱免疫原性的肽-十肽激素LHRH(US 5,759,551，和6,025,468)方面是有效的。
有效的Th表位長度大小約為15-40個氨基酸殘基，一般具有共同的結(jié)構(gòu)特征，而且可含有特異的標志序列。例如，Th的共同特征是包含兩性螺旋，具有疏水氨基酸殘基的α螺旋結(jié)構(gòu)占據(jù)螺旋的一面，而帶電荷的和極性殘基占據(jù)外圍表面(Cease等.，Proc Natl Acad Sci USA，1987；844249-4253)。表位通常包含附加的一級氨基酸模式，如后面為2-3個疏水殘基的Gly或帶電荷的殘基，然后依次為帶電荷的或極性殘基。該模式被稱為Rothbard序列。Th表位一般遵守1，4，5，8規(guī)則，即帶正電荷的殘基在帶電荷的殘基后第4，5，和8位是疏水殘基。因為所有這些結(jié)構(gòu)都是由共同的疏水性，帶電荷和極性氨基酸組成，在單個Th表位中可同時存在每種結(jié)構(gòu)(Partidos等.，J Gen Virol，1991；721293)。多數(shù)情況下，如果不是所有，混雜的T細胞表位符合上述的至少一個周期。這些特征可以結(jié)合到設(shè)計理想的人工Th位點中，包括組合的Th表位。關(guān)于設(shè)計組合的Th位點，對于MHC結(jié)合基序而言可變的位點以及優(yōu)選的氨基酸的列表是可獲得的(Meister等.，Vaccine，1995；13581-591)。另外，對于稱為結(jié)構(gòu)合成抗原文庫的組合庫肽，已公開了一種生產(chǎn)組合Th的方法(Wang等.，WO 95/11998)。因此，1，4，5，8規(guī)則可與已知的組合MHC結(jié)合基序一同應(yīng)用以指定組合Th位點中的不變的和簡并的位點，和選擇適于簡并位點的殘基以極大地擴大人工Th的免疫應(yīng)答的范圍。見WO 99/66957表2和WO 95/11998。
王等(US 5,759,551)建議使用免疫刺激元件來實現(xiàn)自身蛋白糊精的免疫原性。王等建議給藥具有免疫原性的合成糊精肽作為疫苗來治療非胰島素依賴的糖尿病(NIDDM)，該病是一種由糊精過量產(chǎn)生引起的淀粉樣(amyloidogenic)疾病(見US 5,759,551的19列，9-39行)。糊精是由胰島中的β細胞產(chǎn)生的37個氨基酸殘基的肽激素。糊精的過量產(chǎn)生將導(dǎo)致產(chǎn)生淀粉樣疾病的不溶性淀粉樣蛋白在胰腺中的沉積。類似于糊精的過量產(chǎn)生，Aβ1-42肽的過量產(chǎn)生將導(dǎo)致在AD患者腦中沉積不溶性淀粉樣蛋白。然而，糊精和Aβ1-42肽之間存在有限的序列同源性。糊精32-35的僅一段短序列的氨基酸殘基VGSN對應(yīng)于Aβ24-27?？紤]到Soloman等和Schenk等的研究，它們表明序列EFRH是至關(guān)重要的，所產(chǎn)生的抗糊精肽的抗體既不與可溶性Aβ1-42肽發(fā)生交叉反應(yīng)，也不促進對腦中的淀粉樣蛋白斑進行清除。
本發(fā)明的目標是開發(fā)一種能夠產(chǎn)生抗Aβ1-42肽N末端功能位點并與AD患者腦中老年斑進行高度交叉反應(yīng)的高水平高親和力抗體的免疫原。期待通過與Aβ1-42肽和老年斑結(jié)合產(chǎn)生的抗體加速從腦中清除這些斑塊，促進原纖維解聚，抑制原纖維聚集，和對“可溶性Aβ衍生的毒素”[也稱為Aβ衍生的擴散性配體或ADDLs]進行免疫中和。
本發(fā)明的另一個目標是開發(fā)一種適于人或牲畜的用于預(yù)防和治療阿爾茲海默氏病的疫苗遞送載體。
附圖簡述

圖1a，1b，1c，1d，1e和1f是顯示使用1∶100稀釋的免疫和免疫前血清，用抗生物素蛋白-生物素化的抗體復(fù)合物(ABC)方法，來自2個AD腦的連續(xù)切片的免疫過氧化物酶染色的照片，放大倍數(shù)為10X。圖1a和1d顯示抗體與硫磺素(thioflavine)S陽性血管(標記為″BV″)上老年斑和Aβ斑(均標記為″P″)均有很好的結(jié)合?？贵w是用在ISA51油包水乳液中制備的Aβ1-28-εK-MVF Th1-16(SEQ ID NO74)在豚鼠中產(chǎn)生的。圖1b和1e所示的是針對CFA/ICFA中的相同肽免疫原產(chǎn)生的抗體的交叉反應(yīng)。圖1c和1f所示的是使用免疫前血清的腦切片。
圖2a，2b，2c，2d和2e所示的是使用1∶100稀釋的免疫和免疫前血清AD腦的連續(xù)切片的免疫過氧化物酶染色的照片，放大倍數(shù)為40X。圖2a和2d所示的是抗體與形成核的斑(P)有強烈的染色反應(yīng)，該抗體是用配制在ISA51油包水乳液中的Aβ1-28-εK-MVF Th1-16(SEQ ID NO74)在豚鼠中進行免疫而產(chǎn)生的。圖2b是利用CFA/ICFA制劑中相同的免疫原AD豬腦切片的染色模式的照片?？寡逯饕c血管(BV)上的斑塊進行反應(yīng)。圖2c是用免疫前血清的豚鼠腦切片的照片，顯示沒有染色。圖2e所示的是用Aβ1-28肽單獨在CFA/ICFA進行免疫所產(chǎn)生的高免疫血清所得到的腦切片，盡管ELISA中該血清與Aβ1-28強烈反應(yīng)，但染色反應(yīng)表現(xiàn)為令人驚訝的弱染色模式。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及一種包含合成肽的免疫組合物，該合成肽能夠誘導(dǎo)抗Aβ肽的主要功能/調(diào)控位點并與阿爾茲海默氏病(AD)患者腦中的可溶性Aβ1-42肽和斑塊具有高度交叉反應(yīng)的抗體。當對AD患者或傾向于患AD的人給藥時，期望該免疫原性組合物促進腦中淀粉樣蛋白斑的清除和可溶性Aβ衍生的毒素的免疫中和，以預(yù)防和治療AD。特別是，本發(fā)明的肽免疫原包含連接到選自10-28個氨基酸殘基包含Aβ1-42肽的EFRH(SEQ IDNO65)的短N-末端Aβ1-42肽片段上或Aβ1-42肽片段的免疫功能類似物上的選自SEQ ID NOS1-64和它們的免疫功能類似物的Th表位。優(yōu)選的Aβ1-42肽片段選自SEQ ID NOS66-69或它們的免疫功能類似物。
本發(fā)明還提供一種在藥用疫苗制劑中包含免疫有效量的肽組合物的免疫原性組合物，所述疫苗制劑包含佐劑或乳化劑，其選自liposyn，皂甙，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，Montanide ISA51，ISA35，ISA206和ISA 720以及其他有效的佐劑和乳化劑。
本發(fā)明還提供一種通過在足以誘導(dǎo)針對Aβ1-42肽的功能/調(diào)控位點的抗體的條件下，對哺乳動物給藥一種或多種免疫原性肽一段時間，來誘導(dǎo)腦中淀粉樣蛋白斑的加速清除和可溶性Aβ衍生的毒素的免疫中和，以預(yù)防和治療哺乳動物的阿爾茲海默氏病的方法。本發(fā)明疫苗的一個典型實例是在疫苗中包含5-1000μg肽免疫原的肽組合物，所述疫苗在藥用佐劑和/或載體中被配制為油包水的乳劑。給藥疫苗的典型方法是在是0，4和8周間隔的免疫時間，以0.5-2mL每劑量肌肉注射疫苗制劑。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種由輔助T細胞(Th)表位組成的約30-約60個氨基酸的免疫原性的合成肽，所述表位與每個片段包含Aβ1-42肽的氨基酸殘基1的選自10-28個氨基酸的N-末端Aβ1-42肽片段相連接。見SEQ ID NO65，其中D，天冬氨酸，被指定為氨基酸殘基1。優(yōu)選地，N末端Aβ1-42肽片段選自SEQ ID NOs66-69或Aβ1-42肽N末端片段的肽類似物。任選地，可以包括分離免疫原性結(jié)構(gòu)域的氨基酸間隔臂。如果基本上保留了肽半抗原的免疫反應(yīng)性，或者產(chǎn)生對N末端Aβ肽片段、可溶性Aβ1-42肽和斑塊的免疫反應(yīng)性，被間隔臂分離的免疫原性結(jié)構(gòu)域元件可以以任何順序進行共價連接。
影響合成多肽對于N末端Aβ1-42片段免疫原的免疫原性的一個重要因素是通過T輔助細胞表位(Th)將其呈遞給免疫系統(tǒng)。通過對于靶Aβ肽而言是外源的、位于單獨的Th肽結(jié)構(gòu)域元件上的外源Th表位，最可靠地將這種Th提供給肽免疫原。通過重組DNA表達來產(chǎn)生作為雜合多肽的這類肽免疫原。作為包含適于宿主的來自Aβ肽的靶半抗原B細胞位點和T輔助表位(Th)的合成肽免疫原，它們也可以被更簡單和更便宜地提供。除了抗體結(jié)合位點，這類肽與輔助T細胞受體和II類MHC分子反應(yīng)(Babbitt等.，Nature，1985；317359)，從而刺激針對靶抗體結(jié)合位點的緊密的位點特異的抗體反應(yīng)。以前通過對于聚集的全長Aβ肽而言固有的Th將這種Th提供給可用的Aβ1-42肽免疫原(WO 99/66957；WO1999/27944；Janus等.，2000，Morgan等.，2000)，也可由載體蛋白提供。全合成的肽免疫原與Aβ1-42肽聚集物，載體偶聯(lián)物和重組多肽相比，具有以下優(yōu)點，因為為了容易控制質(zhì)量，對產(chǎn)物進行化學(xué)定義。合成的肽免疫原是穩(wěn)定的。不需要精細的下游加工過程，也不需要精細的制造工具。免疫應(yīng)答是位點特異的，并且集中在Aβ靶而不是載體。因此，避免了不利的應(yīng)答如表位抑制。
合成的定位于Aβ肽免疫原的N末端功能位點的免疫原性可通過以下兩個方面進行優(yōu)化(1)將N末端Aβ1-42肽片段與選擇的多數(shù)種群都有應(yīng)答反應(yīng)的外源混雜Th位點結(jié)合；(2)將Aβ肽片段與通過組合化學(xué)擴大了所有組成成分的Th結(jié)合，從而容納遺傳多樣的群體的變化的免疫反應(yīng)性。
已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的肽組合物在刺激產(chǎn)生抗Aβ肽主要功能/調(diào)控位點的抗體方面是有效的，所述抗體對AD患者腦中的可溶性Aβ1-42和斑塊具有交叉反應(yīng)性?；谠陔嗍蠛歪翎糁蝎@得的免疫原性數(shù)據(jù)，和獲自通過獲得的特異免疫血清對存在于人AD腦切片中的淀粉樣蛋白斑進行免疫過氧化物酶染色的數(shù)據(jù)，期待適當配制的本發(fā)明的肽免疫原對人體是有效的。值得注意的是從狒狒中獲得的數(shù)據(jù)特別有意義，因為該種屬的免疫應(yīng)答與人的免疫應(yīng)答十分相似。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種新型的肽組合物，用于產(chǎn)生對Aβ肽主要功能/調(diào)控位點特異的高滴度多克隆抗體，該抗體可與阿爾茲海默氏病(AD)患者腦中的可溶性Aβ1-42和斑塊具有交叉反應(yīng)性。用該肽組合物產(chǎn)生的抗體是高度位點特異的，并與Aβ肽和腦中的淀粉樣蛋白斑結(jié)合。因此，本發(fā)明提供了一種用于促進腦中淀粉樣蛋白斑的清除和可溶性Aβ衍生的毒素的免疫中和從而預(yù)防和治療AD的有效方法。
選自10到28個氨基酸的N末端Aβ1-42肽片段，其中每個片段包含Aβ1-42肽的EFRH(SEQ ID NO65)，它們是短的線性肽，其本身沒有免疫原性。該短的Aβ1-42肽片段可通過化學(xué)偶聯(lián)一個載體蛋白如鑰孔血藍蛋白(KLH)或通過重組DNA表達與載體多肽如乙肝病毒表面抗原融合而被免疫強化。這類的“Aβ肽-載體蛋白”疫苗的缺點是所產(chǎn)生的抗體的主要部分是針對載體蛋白的非功能抗體。
本發(fā)明的免疫原是完全合成的肽免疫原，包含10到28個氨基酸的Aβ1-42肽N末端片段，每個片段包含共價連接到混雜Th表位的Aβ1-42肽的EFRH，所述表位選自SEQ ID NOs1到64。本發(fā)明的免疫原引發(fā)產(chǎn)生位點特異的，與Aβ1-42肽及其聚集物結(jié)合的，并與腦中淀粉樣蛋白斑有交叉反應(yīng)的抗體，從而促進腦中淀粉樣蛋白斑的清除和可溶性Aβ衍生的毒素的免疫中和。因此，本發(fā)明的免疫原可用于預(yù)防和治療AD。
本發(fā)明中所用的輔助T細胞表位(Th)包含多個II類MHC結(jié)合基序。提供了共價連接到N末端Aβ1-42肽片段上的Th的具體實例。用本發(fā)明的免疫原肽免疫的動物的抗血清結(jié)果表明在遺傳上多樣的宿主群體中產(chǎn)生了有效的定位Aβ肽反應(yīng)抗體。
一般來說，本發(fā)明的合成免疫原性肽大約為20-100個氨基酸長，并包含(i)選自SEQ ID Nos1到64的輔助T細胞(Th)表位；(ii)約10到約28個氨基酸殘基的Aβ1-42肽N末端片段，其中每個片段包含Aβ1-42肽的EFRH；和(iii)任選地，由至少一個氨基酸組成的間隔臂以隔離免疫原性結(jié)構(gòu)域。
優(yōu)選地，Aβ1-42肽的N末端片段選自SEQ ID NOS66-69和其免疫有效類似物。Th肽共價連接在任選具有間隔臂(如Gly-Gly，ε-N Lys)的Aβ1-42肽的靶N末端片段的N-或C-末端。
本發(fā)明的肽免疫原由以下公式之一表示(A)n-(Aβ1-42肽的N末端片段)-(B)o-(Th)m-X；或(A)n-(Th)m-(B)o-(Aβ1-42肽的N末端片段)-X；其中每個A獨立是一種氨基酸；每個B是選自氨基酸，gly-gly，(α，ε-N)lys，Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO73)的連接序列；每個Th包含一個組成輔助T細胞表位的氨基酸序列或其免疫增強類似物或片段；(Aβ1-42肽的N末端片段)是一種合成的肽B細胞靶位點抗原，是約10到約28個氨基酸殘基的片段，其中每個片段包含Aβ1-42肽的EFRH或其免疫功能類似物；X是氨基酸的α-COOH或α-CONH2；n是0到約10；m是1到約4；及o是0到約10。
本發(fā)明中的肽免疫原包含約20-約100個氨基酸殘基，優(yōu)選地為約25-約60個氨基酸殘基。優(yōu)選地，(Aβ1-42肽N末端片段)選自SEQ ID Nos66-69，并且優(yōu)選Th表位選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。優(yōu)選地，m＝1，n＝1，和o＝1或2。
當A代表一種氨基酸時，它可以是非天然存在的或天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸包括，但不限于ε-N賴氨酸、β-丙氨酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥基脯氨酸，甲狀腺素，γ-氨基丁酸，高絲氨酸，瓜氨酸等。天然存在的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸。當m大于1而且2個或多個A代表氨基酸時，那么每個氨基酸可獨立地相同或不同。(A)n可以包括一個間隔臂，如Gly-Gly，ε-N Lys。
B是一個間隔臂，是一種如上所述的可天然存在的或非天然存在的氨基酸。每個B獨立相同或不同。B的氨基酸也可在混雜的Th表位和Aβ1-42肽N末端片段(如序列SEQ ID NOs66-69)或其免疫功能類似物之間提供一個間隔臂，如Gly-Gly，ε-Lys或賴氨酸。此外通過從B細胞表位，即Aβ1-42肽N末端片段或其免疫功能類似物，物理分離Th表位，，Gly-Gly或ε-Lys間隔臂可以打斷任何通過Th表位和Aβ1-42肽N末端片段或其免疫功能類似物連接而產(chǎn)生的人工二級結(jié)構(gòu)，從而消除Th和/或B細胞應(yīng)答的干擾。B的氨基酸也可以形成一個間隔臂，其作為加強Th與Aβ1-42肽N末端片段之間分離的柔性鉸鏈。在免疫球蛋白重鏈鉸鏈區(qū)可發(fā)現(xiàn)編碼柔性鉸鏈的實例。柔性鉸鏈序列一般都富含脯氨酸。一個特別有用的鉸鏈序列由Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO77)提供，其中Xaa是任何氨基酸，優(yōu)選天冬氨酸。B的氨基酸提供的構(gòu)象隔離可使提呈的肽免疫原與適當?shù)腡h細胞和B細胞更有效地相互作用，從而加強對Th表位和抗體引發(fā)的表位或它們的免疫功能類似物的免疫應(yīng)答。
Th是包含Th表位的氨基酸(天然或非天然氨基酸)序列。Th表位可以是連續(xù)或不連續(xù)的表位。在不連續(xù)的Th表位中，并非Th的每個氨基酸都是必須的。Th表位或其類似物或片段能夠加強或刺激對Aβ1-42肽N末端片段的免疫應(yīng)答。免疫顯性和混雜的表位與具有廣泛趨異的MHC類型的動物和人種群發(fā)生高度和廣泛的交叉反應(yīng)(Partidos等.，1991；美國5,759,551)。主題肽的Th表位有約10-約50個氨基酸，優(yōu)選地約10到約30個氨基酸。當存在多個Th表位(即m≥2)時，每個Th表位可以相同或不同。Th片段包含足以加強或刺激對Aβ1-42肽N末端片段的免疫應(yīng)答的Th表位的連續(xù)部分(contiguous portion)。
本發(fā)明的Th表位衍生自外源病原體的那些，包括但不限于列于表1的那些(SEQ ID Nos1-21)。另外，Th表位包括理想的人工Th和公開于WO 99/66957和列于此處表2的SEQ ID Nos 22-64的人工理想的組合Th。包含組合Th的肽是在一個單獨的固相肽合成中用Aβ1-42肽N末端片段，A和B來同時產(chǎn)生的。Th表位也包括其免疫功能類似物，只要基本不改變Th刺激功能，可對1-約10個氨基酸殘基進行保守的替代、添加、刪除和插入。
在本發(fā)明的合成肽中，Th表位通過間隔臂B共價連接到Aβ1-42肽N末端片段或其免疫功能類似物的N末端或C末端。只要可引發(fā)對Aβ1-42肽交叉反應(yīng)的免疫應(yīng)答，Aβ1-42肽N末端片段的免疫功能類似物可以包含從1到約4個氨基酸殘基的保守替代、添加、刪除或插入。保守替代、增加和插入可用上述的天然或非天然氨基酸來完成。
本發(fā)明優(yōu)選的肽免疫原是那些包含選自SEQ ID NOs66-69的Aβ1-42肽片段的N末端片段或其免疫功能類似物；間隔臂(如Gly-Gly，ε-Lys)；Th表位，其選自HBsTh(SEQ ID NO1)；HBcTh(SEQ ID NO20)；MVF Th(SEQ ID NOS8，9)；PT Th(SEQ ID NOs4，5，7)；TT Th(SEQ ID NOs3，4，6)；CT Th(SEQ ID NOs12，21)；DT Th(SEQ ID NO13，14)，MVF Th衍生的人工Th，其選自SEQ ID Nos38-40，47-51；HBV Th衍生的人工Th，其選自SEQ ID NOS52-54。見表1和2。
包含帶有2個或多個Th表位的主題肽免疫原混合物的肽組合物可以在更廣泛的群體中增強免疫效率，因而提高對Aβ1-42肽及它們的片段的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的肽免疫原可通過普通熟練技術(shù)人員所熟知的化學(xué)合成方法來制備。參見，例如Fields等合成肽(Synthetic Peptides)的第三章用戶指南(A User′s Guide)，Grant編輯，W.H.Freeman & Co.，紐約，1992，77頁。因此，用t-Boc或F-moc化學(xué)保護α-NH2，利用側(cè)鏈被保護的氨基酸，在例如Applied Biosystems肽合成儀430A或431型上用自動化的Merrifield固相合成技術(shù)合成肽。制備包含Th表位組合庫肽的肽構(gòu)建體可通過在給定的變異位點偶聯(lián)各種氨基酸混合物來完成。當所需的肽免疫原完全組裝后，根據(jù)標準程序?qū)渲M行處理，以從樹脂上清除肽，并將氨基酸側(cè)鏈的功能基團解封閉。通過HPLC純化游離的肽，并進行生化表征，如通過氨基酸分析或通過測序。肽的純化和表征方法對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是熟知。
本發(fā)明的免疫原也可以通過直接在分枝的多聚-賴氨酰核心樹脂上合成所需的肽構(gòu)建體來制備成分枝的多聚物(Wang，等.，Science，1991；254285-288)。
備選地，更長的合成肽免疫原可通過眾所周知的重組DNA技術(shù)進行合成。在眾所周知的標準手冊中提供了這類技術(shù)的詳細方案。為了構(gòu)建編碼本發(fā)明肽的基因，將氨基酸序列反翻譯以獲得編碼該氨基酸序列的核酸序列，優(yōu)選用該基因?qū)⒈槐磉_的生物最偏愛的密碼子。然后，典型地通過合成編碼該肽和如果需要的任何調(diào)控元件的寡核苷酸來制備合成的基因。將合成的基因插入到合適的克隆載體上，并轉(zhuǎn)染宿主細胞。然后在適于選擇性表達系統(tǒng)和宿主的合適條件下將該肽進行表達。用標準方法純化和表征肽。
本發(fā)明的肽組合物的效力可通過用包含本發(fā)明肽的免疫原性組合物注射動物，如豚鼠來確定。見表4，SEQ ID NOS70-75。對Aβ1-42肽N末端片段和可溶性Aβ1-42肽的體液免疫應(yīng)答進行了監(jiān)測。以下的實施例提供了所用流程的詳細描述。
本發(fā)明的另一個方面提供了在藥用遞送系統(tǒng)中包含免疫有效量的一個或多個本發(fā)明的肽免疫原的肽組合物。因此，利用藥用佐劑、載體或其它常規(guī)用于疫苗制備的成分，可將該主題肽組合物制備成疫苗。本發(fā)明中所應(yīng)用的成分是佐劑或乳化劑，包括明礬、liposyn、皂苷、角鯊烯、L121、emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)、多乙氧基醚、QS21、Montanide ISA51、ISA35、ISA206和ISA 720及其它有效的佐劑和乳化劑。組合物可以配制成瞬時釋放或持久釋放形式。組合物也可以配制來誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫，如捕獲在微顆粒中或與微顆粒共同給藥。這類制劑對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是容易獲得的。
本發(fā)明的免疫原可通過任何常規(guī)途徑，如皮下、口腔、肌內(nèi)、胃腸外或腸內(nèi)途徑給藥。免疫原可以單劑量或多劑量進行給藥。合適的免疫方案對于推移本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言容易確定和實現(xiàn)。
本發(fā)明的肽組合物包含有效量的一個或多個本發(fā)明的肽免疫原和藥用載體。這種合適的劑量單位形式的組合物每千克體重一般包含約0.25μg到500μg免疫原。當以多劑量遞送時，有效量可被方便地分為每一劑量單位。例如，起始劑量如每千克體重0.0025-0.5mg；優(yōu)選每千克體重1-50μg的肽免疫原通過注射進行給藥，優(yōu)選肌內(nèi)注射，然后進行類似劑量的重復(fù)(激發(fā))給藥。如在疫苗和治療領(lǐng)域所公認的，劑量依賴于患者的年齡、體重和一般健康狀況。
合成的Aβ1-42肽免疫原的免疫應(yīng)答可通過捕獲在O’Hagan等所描述的類型(Vaccine，1991；9768-771)的可生物降解的微顆粒中或其上進行遞送來提高?？蓪⒚庖咴芊庥诰哂谢虿痪哂凶魟┑目缮锝到獾奈㈩w粒中以增強免疫應(yīng)答，和為了持續(xù)或間歇應(yīng)答和為了口服給藥提供控制時間的釋放(O’Hagan等.，1991；和，Eldridge等.，1991；28287-294)。
提供的下述實施例是用來闡明本發(fā)明。本發(fā)明的范圍并不限定為所提供的具體的肽免疫原和組合物。實施例闡明了本發(fā)明的肽免疫原對于早在最初免疫4周后引發(fā)針對Aβ1-10和Aβ1-14片段的定點抗體以及對可溶性Aβ1-42肽有交叉反應(yīng)的抗體是有用的。
實施例1合成本發(fā)明Aβ肽免疫原的典型方法列于表4(SEQ ID NOS70-76)的肽免疫原是利用Fmoc化學(xué)在AppliedBiosystems自動肽合成儀(430，431和433A型)上用Merrifield固相合成技術(shù)單個合成的。包含組合庫Th即理想的人工Th位點如MvF衍生的Th1-8(SEQ ID NOs38-40)的肽免疫原的制備可通過在具體設(shè)計的特定位點提供化學(xué)偶聯(lián)的所需氨基酸混合物來完成。當完成所需肽的組裝后，用三氟乙酸根據(jù)標準程序處理樹脂以將肽從樹脂上清除下來，并對氨基酸側(cè)鏈的保護基團進行解封閉。清除下來的、提取并洗滌后的肽通過HPLC進行純化，并通過質(zhì)譜和反向HPLC表征。
實施例2評估本發(fā)明Aβ肽的免疫原性通過以下略述的實驗免疫方案和通過確定免疫原性的血清學(xué)試驗，按照說明在幾組豚鼠上評估Aβ衍生的肽免疫原。
標準實驗設(shè)計免疫原(1)單個肽免疫原；或(2)等摩爾肽免疫原混合物，按照每個實施例的說明。
劑量除非特別說明，每次免疫為0.5ml中100μg，。
途徑除非特別說明，肌內(nèi)，佐劑除非特別說明，完全弗氏佐劑(CFA)/不完全佐劑(IFA)；或油包水乳劑。在CFA/IFA組中，第0周使用CFA，隨后的幾周使用IFA。
給藥時間表0、3、6周，或者特別說明。
采血時間表0、5、8周，或特別說明。
物種Duncan-Hartley豚鼠或特別說明試驗對每個免疫血清的抗肽活性進行特定的ELISAs檢測。固相底物為Aβ肽片段，如Aβ1-14或全長Aβ1-42(SEQ ID NOs67和65)，收集血液，加工成血清，并在用靶肽進行ELISA之前儲存。
用包被有作為免疫吸收劑的SEQ ID NOs67或65的Aβ1-42肽片段的96孔平底微滴定平板通過ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)來檢測所引發(fā)的抗體抗Aβ肽及抗可溶性Aβ1-42肽的免疫反應(yīng)性。等分的(100μL)濃度為5μg/mL的肽免疫原溶液在37℃溫育1小時。平板用3％明膠/PBS溶液37℃溫育1小時進行封閉。然后將封閉的平板干燥并用于試驗。待測免疫血清最初在樣品稀釋緩沖液進行1∶100稀釋，隨后進行10倍系列稀釋，將等分的(100μL)的待測血清加到肽包被的平板上。平板在37℃溫育1小時。
平板用0.05％PBS/吐溫緩沖液洗滌6次。加入100μL適當稀釋在結(jié)合稀釋緩沖液(conjugate dilution buffer)(包含0.5M NaCl和正常羊血清的磷酸鹽緩沖液)中的辣根過氧化物酶標記的羊抗物種特異抗體。在如上述洗滌前，將平板在37℃溫育1小時。然后加入等分的(100μL)鄰-苯二胺底物溶液。顯色5-15分鐘后加入50μL 2N H2SO4中止酶的顯色反應(yīng)。在平板讀數(shù)儀上讀取每個孔中內(nèi)容物的A492nm值。根據(jù)吸收值的線性回歸分析對ELISA滴度進行計算，設(shè)定A492nm截斷值為0.5。稀釋的正常對照樣品的值小于0.15，因此嚴格選擇截斷值。
實施例3表征Aβ1-42及其N末端片段相對免疫原性以優(yōu)化基于定位Aβ1-42肽的合成疫苗的設(shè)計為了設(shè)計一個產(chǎn)生高水平高親和力抗Aβ肽并與AD患者腦中的可溶性Aβ1-42肽和斑塊高度交叉反應(yīng)的抗體的完全合成的疫苗，首先表征Aβ1-42及其N末端片段的相對免疫原性。在第一次研究中，為了測定Aβ1-42肽中各個區(qū)段的相對免疫性能，使用適于人使用的溫和佐劑—明礬。比較了Aβ1-42肽及其N末端片段，Aβ1-28的相對免疫原性。免疫原性的評估是根據(jù)實施例2描述的程序進行的。出人意料地是，Aβ1-28比Aβ1-42肽具有更強的免疫原性，這表明在C末端片段Aβ29-42中存在免疫抑制現(xiàn)象(表5)。
隨后，比較了Aβ1-28和Aβ1-42更短的N末端片段——Aβ1-14的免疫原性。為了配制疫苗，使用了適于人使用的更有效的佐劑(Montanide ISA51，Seppic，巴黎，法國)來制備油包水乳劑。基于列于表6中所獲得的數(shù)據(jù)，3個Aβ肽(即Aβ1-14，Aβ1-28和Aβ1-42)的相對免疫原性大小的順序是Aβ1-28＞Aβ1-42＞Aβ1-14。令人驚訝的是，丟失Aβ1-42C末端14mer使其免疫原性得到提高而不是降低?？笰β的抗體應(yīng)答主要針對N末端區(qū)，特別是Aβ1-14N末端片段，如ELISA數(shù)據(jù)所示(表6)。然而，Aβ1-28片段從C末端的進一步縮短而形成的Aβ1-14片段降低了免疫原性。
如Solomor報道，短Aβ1-14片段包含主要的功能/調(diào)控位點，EFRH，位于Aβ1-42肽的3-6位。通過抗體封閉該表位可以調(diào)節(jié)聚集以及已形成聚集體的再增溶間的動態(tài)平衡(Soloman等.，Proc Natl Acad.Sci，1996；93452-455；Proc Natl Aca.Sci，1997；944109-4112)。多數(shù)抗Aβ1-28和Aβ1-42的抗體抗含該表位的Aβ1-42肽的N末端片段(表6)。然而，Aβ1-14片段本身具有弱免疫原性。該實驗結(jié)果表明在Aβ15-28片段中存在內(nèi)源的Th表位。該內(nèi)源Th表位解釋了在豚鼠中Aβ1-28和Aβ1-42肽的較低的免疫原性。
在Aβ15-28片段中存在Th表位是理想的。然而，當面對有限的人MHC分子、許多合適劑量和允許用于人的佐劑類型的有限的情況下，能夠產(chǎn)生更有效的免疫原作為能成功用于人的疫苗是理想的。因此，我們嘗試將一個外源或外部的Th如來源于HBV的Th(SEQ ID NO1)連接到Aβ1-28肽C末端(SEQ ID NO66)。外源Th表位顯著增強Aβ1-28片段的免疫原性，如表6所示。針對所構(gòu)建的帶有Aβ1-28片段的免疫原的抗體應(yīng)答仍保持針對肽免疫原(SEQ ID NO70)的功能N末端片段，使得該構(gòu)建體比單獨的Aβ1-28片段或Aβ1-42片段是更好的免疫原。該肽免疫原(SEQ ID NO70)表示具有下述分子式的肽免疫原(A)n(Aβ肽N末端片段)-(B)o-(Th)m其中A是α-NH2，帶有是Aβ1-42N末端片段的Aβ1-28；B是甘氨酸；Th是來源于外源病原體HBsAg Th(SEQ ID NO1)的輔助T細胞表位，其中n為1，m為1，o為2。
實施例4AβN末端片段的下限以為了開發(fā)針對AD的基于Aβ的合成疫苗由于包含EFRH殘基的主要功能/調(diào)控位點位于Aβ1-42肽的3-6位(Soloman等.Proc Natl Acad.Sci，1996；93452-455；Proc Natl Aca.Sci，1997；944109-4112)，所以它對于研究作為Aβ上的最佳的B細胞靶位點的Aβ1-42肽的最短N-末端片段以整合到本發(fā)明的合成免疫原中是有用的。
將幾個短的無免疫原性的AβN末端片段，Aβ1-10、Aβ1-12、Aβ1-14和Aβ1-28每一個整合到用典型的理想人工Th(SEQ ID NO51)所設(shè)計的免疫原中。通過εN-Lys間隔臂進行連接。由于預(yù)計短的Aβ片段的免疫原性低，所以將涉及的構(gòu)建與強佐劑一起配制。將3個合成的構(gòu)建體配制在完全和不完全弗氏佐劑中，并基于實施例2中所述的程序檢測其免疫原性。如表7所示，所有4個肽免疫原具有高度免疫原性，ELISA Log10滴度從4.3到5.6[即104.3到105.6]，且在初次免疫僅四周后就對全長Aβ1-42肽具有非常高的交叉反應(yīng)性。更重要的是，發(fā)現(xiàn)每個連接到理想人工Th(SEQ ID NO51)上的與Aβ1-10，Aβ1-12和Aβ1-14一樣小的片段在與公開的人工Th表位連接后具有高免疫原性(表7)。這些肽免疫原設(shè)計為符合以下公式
(A)n-(Aβ肽N末端片段)-(B)o-(Th)m其中A是αNH2，其中N末端片段是Aβ1-10，Aβ1-12，Aβ1-14或Aβ1-28；B是ε-N賴氨酸，一個間隔臂，通過其ε-氨基基團與下一個氨基酸連接；Th是來源于理想人工Th，MVF Th1-16(SEQ ID NO51)的輔助T細胞表位，其中n為1，m為1，o為1。
發(fā)現(xiàn)進一步縮短AβN末端片段的長度至少于10mer時，將導(dǎo)致更有限的因此不理想的免疫原性。似乎小于10個氨基酸的肽對于II類MHC分子的受體識別是有問題的(Immunology，第五版，Roitt等.，編輯，1998，Mosby International Ltd.，倫敦，88-89頁)。
基于Aβ的研究，有用的來源于Aβ1-42的B細胞位點的長度為約10-約28個殘基。
實施例5連接在人工Th表位上的合成肽免疫原靶向的定點免疫反應(yīng)性將Aβ肽的無免疫原性的N末端片段如Aβ1-14通過εN-賴氨酸間隔臂連接到命名為MVF Th 1-16(SEQ ID NO51)的人工Th肽上，或通過標準化學(xué)偶聯(lián)程序連接到常規(guī)的載體蛋白KLH上。根據(jù)實施例2中所述的程序，在豚鼠中評估兩個免疫原性的構(gòu)建體對Aβ肽的相對“定位”免疫原性和得到的抗體對其各自載體，人工Th表位或KLH載體蛋白的各自反應(yīng)活性。單獨短的Aβ1-14肽作為對照免疫原，將兩個具有免疫原性的構(gòu)建體在包含佐劑ISA51的油包水乳劑—適于人用的制劑中配制。如表8所示，如同所預(yù)料的，N末端Aβ1-14片段本身無免疫原性。發(fā)現(xiàn)合成的包含Aβ1-14片段和人工Th(SEQ ID NO73)的免疫原具有高免疫原性，引發(fā)抗Aβ1-14的定點抗體。也發(fā)現(xiàn)早在初次免疫后4周，抗體對可溶性Aβ1-42肽高度交叉反應(yīng)(初次免疫后4周和6周的Log10滴度分別為4.094和4.126)。當用MVF Th1-16(SEQ ID NO 51)包被的平板通過ELISA來檢測這些Aβ反應(yīng)性的高滴度免疫血清時，發(fā)現(xiàn)它們都是陰性(初次免疫后4周和6周的Log10滴度分別為0.038和0.064)，這表明沒有無關(guān)抗體產(chǎn)生。如表8所示獲得的數(shù)據(jù)清楚地證實本發(fā)明的肽免疫原的高特異定位的性質(zhì)。
發(fā)現(xiàn)具有載體蛋白KLH的免疫原對常規(guī)肽—載體蛋白偶聯(lián)物有高度免疫反應(yīng)性(如初次免疫后4周和6周的Log10滴度分別為4.903和5.018)。然而，所引發(fā)的抗體對可溶性Aβ1-42肽僅有較弱的交叉反應(yīng)(如初次免疫后4周和6周的Log10滴度分別為3.342和2.736)。大約比SEQ IDNO73小10X到100X倍。出乎意料的是，本發(fā)明的肽免疫原是高度定位和聚焦的。僅產(chǎn)生針對Aβ肽N末端片段的抗聚集和解聚位點，而不針對無關(guān)載體位點的在功能上重要的抗體。
實施例6評估Aβ肽免疫原對老年斑的交叉反應(yīng)性用具有斑塊和纏結(jié)的Aβ患者的腦和包含淀粉樣蛋白斑的硫磺素S陽性血管(TSBV)來評估在豚鼠和狒狒中得到的抗Aβ肽免疫原的免疫血清對多聚老年斑的交叉反應(yīng)性。通過利用抗生物素蛋白—生物素化的抗體復(fù)合物(ABC)方法的免疫過氧化物酶染色，或通過利用羅丹明偶聯(lián)的物種特異的抗IgG的Fab片段的免疫熒光染色來檢測斑塊和TSBV反應(yīng)活性。所有豚鼠血清以1∶100稀釋度進行檢測，通過一些樣本來確定滴定終點。所有狒狒血清以1∶50稀釋度進行檢測。免疫和免疫前血清的評估根據(jù)Dr.Gaskin所述的規(guī)程溫和地進行(Gaskin等.，J.Exp Med.165245，1987)。
圖1中，在10X放大倍數(shù)下最初檢測了2個AD患者腦系列連續(xù)切片。切片(a)，(b)和(c)來源于AD腦1，(d)，(e)和(f)來源于AD腦2。從豚鼠中收集免疫前正常血清和初次免疫6周后的免疫血清，通過用免疫過氧化物酶染色對富含斑塊和神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)的AD顳皮層的恒溫箱切片進行染色來檢測。圖1a和1d載玻片所示的第一次研究中所用的免疫血清是從用在ISA51油包水乳劑中制備的Aβ1-28-εK-MvF Th1-16(SEQ IDNO74)免疫的動物中獲得的。結(jié)果表明在硫磺素S陽性血管(TSBV)上對老年斑和淀粉樣蛋白斑都有顯著的結(jié)合。圖1b和1d載玻片所示的是抗在CFA/ICFA中制備的等價免疫原產(chǎn)生的免疫血清的交叉反應(yīng)性。出人意料地是，與用ISA51配制的疫苗所獲得的結(jié)果相反，觀察到抗CFA/ICFA疫苗產(chǎn)生的血清在血管(TSBV)中優(yōu)先與Aβ1-28斑結(jié)合。這表明用ISA51配制的疫苗所引發(fā)的抗體與在CFA/ICFA中配制的疫苗所產(chǎn)生的抗體不同。而且，用根據(jù)本發(fā)明配制的疫苗所產(chǎn)生的抗體對腦組織中老年斑有期望的更高的交叉反應(yīng)性。免疫前血清在相應(yīng)的連續(xù)切片中沒有顯色反應(yīng)，如圖1c和1f中載玻片所示。
圖2a到2e所示的是40X放大倍數(shù)下，用免疫前血清和免疫血清以1∶100稀釋度對AD腦1的系列連續(xù)切片進行免疫過氧化物酶染色的照片。從用在ISA51油包水乳劑中制備的Aβ1-28-εK-MVF Th 1-16(Seq ID NO74)免疫的動物中獲得的血清強烈地染色形成核圖案的斑塊，如圖2a和2d載玻片所示。此外，令人驚訝的是，用制備的抗相應(yīng)CFA/ICFA制劑的免疫血清進行的染色提供了不同的染色圖案，如圖2b所示，因為主要在血管上與斑有反應(yīng)性，而不與腦組織中的斑有反應(yīng)性。免疫前血清不染色切片，如圖2c所示。用在CFA/ICFA中的單獨的Aβ1-42肽免疫產(chǎn)生的超免疫血清在切片中得到一個令人驚訝的弱染色圖案，如圖2e所示，盡管其在ELISA檢測中與Aβ1-28有強烈反應(yīng)。
用實施例3、4和5中所述的各種疫苗制劑免疫豚鼠所獲得的11種混合(pooled)免疫血清和免疫前血清對AD腦組織進行了類似的免疫染色。這些血清也通過Aβ1-14ELISA評估其對功能位點的抗體反應(yīng)性，并通過Aβ1-42ELISA評估對可溶性Aβ1-42的抗體反應(yīng)性(表9)。一般來說，用待測血清進行的所有3次試驗是趨于平行的。如表9所示，通過ELISA檢測，免疫前血清和抗在ISA51油包水乳劑中單獨配制的短肽Aβ1-14產(chǎn)生的血清的抗肽活性低，并且忽略了對斑塊的交叉反應(yīng)性。用在明礬和ISA51中單獨配制的Aβ1-28肽和在ISA51中配制的連接到KLH上的Aβ1-14接種動物所獲得的血清有適度的反應(yīng)活性。然而，來自用本發(fā)明的合成的Aβ/Th免疫原免疫的動物的血清對功能Aβ1-14位點，可溶性Aβ，AD患者腦組織切片中的斑塊和TSBV產(chǎn)生顯著的定點反應(yīng)性。因此，從這些研究所獲得的結(jié)果證實，包含Aβ1-42N末端片段，氨基酸為1-28到大約1-10，并連接到外源Th表位上的肽免疫原的優(yōu)異的并且有用的免疫原性。而且，結(jié)果表明外源Th表位的存在可以將本發(fā)明的肽免疫原的免疫原性提高到一個令人驚訝的程度上。在適于人用的臨床上可接受的疫苗制劑中的本發(fā)明的肽免疫原產(chǎn)生對AD患者腦組織中的老年斑有交叉反應(yīng)性的抗體。
實施例7典型Aβ肽疫苗在狒狒中的免疫反應(yīng)性作為對AD的免疫治療效果的預(yù)報因子將在ISA51油包水乳劑中以25μg/0.5mL，100μg/0.5mL和400μg/0.5mL劑量水平配制的典型的合成免疫原Aβ1-28-ε-K-MvF Th1-16(SEQID NO74)在初次免疫后0、3和6周的時間提供給3只狒狒Y299，X398和X1198。收集免疫前血清和初次免疫后(wpi)5和8周的血清。為了進行比較，第四只狒狒X798以100μg/0.5mL劑量給藥在批準用于人的標準佐劑-明礬中配制的游離Aβ1-28和Aβ1-42肽的等摩爾混合物。免疫前血清作為陰性對照。
收集所有4只免疫動物的血清，通過Aβ1-14ELISA評估其對功能位點的抗體反應(yīng)活性，通過Aβ1-42ELISA評估其對可溶性Aβ1-42的反應(yīng)活性(在0，5和8wpi收集血清)。通過實施例6中所述的免疫染色方法評估抗血清(僅8wpi)對老年斑和硫磺素S陽性血管中斑塊的交叉反應(yīng)性。代替使用抗狒狒Ig，所用的抗體檢測物質(zhì)是識別所有人同型體并與狒狒IgG有交叉反應(yīng)的來源于抗人IgG的Fab片段。
所有3次試驗中代測血清也具有平行趨勢。如表10所示，免疫前血清呈陰性。用來源于用在明礬中配制的Aβ1-28和Aβ1-42接種的動物X798的血清發(fā)現(xiàn)適度的ELISA反應(yīng)性。然而，該血清的反應(yīng)活性在識別老年斑時很弱。相反，用來自用本發(fā)明的典型組合物(SEQ ID NO74)以用ISA51配制的100μg/0.5mL和400μg/0.5mL的劑量免疫的動物最初免疫后8周收集的血清發(fā)現(xiàn)對Aβ1-14功能位點、可溶性Aβ1-42及AD患者腦切片中的斑塊和TSBV的顯著定點反應(yīng)活性。因此，從該狒狒研究中獲得的結(jié)果證實本發(fā)明的免疫原在適于人的疫苗制劑中的用途。由于狒狒中的免疫應(yīng)答與人非常類似，與現(xiàn)有技術(shù)的肽疫苗相比，免疫原性的提高(對Aβ功能位點的特異抗體滴度提高10-100X倍)是非常有意義的。
類似地，包含2到3種本發(fā)明的合成免疫原的混合物可以以每劑量約25到1000μg配制成疫苗，以在遺傳上多樣的人群中引發(fā)功能抗Aβ1-14的抗體，從而預(yù)防和治療AD。由于在本發(fā)明的肽免疫原中存在混雜的Th表位，從而可進行廣泛MHC識別，因此期待在人中的廣泛免疫原性。
表1病原體衍生的混雜T輔助細胞表位(Th)
a美國5,759,551bFerrari等.，J Clin Invest，1991；88214cStagg等.，Immunology，1993；711
表2人工理想的Th和組合庫理想的人工Tha.MVF Th和Th表位衍生自
b.HbsAg Th，原型和衍生物
表3Aβ1-42肽和它的N-末端片段的氨基酸序列
表4
表5
表6
表7
表8
表9
a系列稀釋@1∶100
表10
序列表<110>王長怡<120>作為疫苗用于預(yù)防和治療阿爾茲海默氏病的免疫原性肽組合物<130>1151-4167<140>09/865,294<141>2001-05-25<160>77<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>15<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>1Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp1 5 10 15<210>2<211>30<212>PRT<213>百日咳桿菌(Bordetella pertussis)<400>2Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met Ser Gly Leu Ala1 5 10 15Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr20 25 30<210>3<211>17<212>PRT<213>破傷風(fēng)桿菌(Clostridium tetani)<400>3Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
1 5 10 15Leu<210>4<211>22<212>PRT<213>破傷風(fēng)桿菌(Clostridium tetani)<400>4Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys1 5 10 15Val Ser Ala Ser His Leu20<210>5<211>15<212>PRT<213>百日咳桿菌(Bordetella pertussis)<400>5Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu1 5 10 15<210>6<211>27<212>PRT<213>破傷風(fēng)桿菌(Clostridium tetani)<400>6Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu1 5 10 15Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys20 25<210>7
<211>24<212>PRT<213>Pertusaria trachythallina<400>7Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala Leu Thr Val Ala1 5 10 15Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu20<210>8<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>8Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val1 5 10 15<210>9<211>20<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>9Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile Thr His Val Asp1 5 10 15Thr Glu Ser Tyr20<210>10<211>17<212>PRT<213>破傷風(fēng)桿菌(Clostridium tetani)<400>10Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys1 5 10 15
Thr<210>11<211>16<212>PRT<213>破傷風(fēng)桿菌(Clostridium tetani)<400>11Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn His Val1 5 10 15<210>12<211>25<212>PRT<213>沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)<400>12Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Cys Thr Leu Gly Ala1 5 10 15Thr Thr Gly Tyr Leu Lys Gly Asn Ser20 25<210>13<211>23<212>PRT<213>白喉(Diphtheria)<400>13Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val Ala Ala Leu Ser1 5 10 15Ile Leu Pro Gly His Gly Cys20<210>14<211>39
<212>PRT<213>白喉(Diphtheria)<400>14Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala1 5 10 15Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala20 25 30Thr Asn Phe Val Glu Ser Cys35<210>15<211>21<212>PRT<213>惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)<400>15Asp His Glu Lys Lys His Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe1 5 10 15Asn Val Val Asn Ser20<210>16<211>17<212>PRT<213>曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)<400>16Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp Glu Lys His Arg1 5 10 15His<210>17<211>14
<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>17Gly Leu Gln Gly Lys His Ala Asp Ala Val Lys Ala Lys Gly1 5 l0<210>18<211>19<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>18Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp Ala Met Val Glu1 5 10 15Asp Val Asn<210>19<211>20<212>PRT<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<400>19Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr Arg Val Val Ser1 5 10 15Asn Ala Asn Lys20<210>20<211>20<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>20Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala1 5 10 15
Leu Tyr Arg Glu20<210>21<211>12<212>PRT<213>沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)<400>21Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Lys Glu1 5 10<210>22<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>22Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu Glu Gly Val1 5 10 15<210>23<211>16<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>23Asp Leu Ser Asp Leu Lys Gly Leu Leu Leu His Lys Leu Asp Gly Leu1 5 10 15<210>24<211>16<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>24Glu Ile Ser Glu Ile Arg Gly Ile Ile Ile His Arg Ile Glu Gly Ile1 5 10 15
<210>25<211>16<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>25Asp Val Ser Asp Val Lys Gly Val Val Val His Lys Val Asp Gly Val1 5 10 15<210>26<211>16<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>26Asp Phe Ser Asp Phe Lys Gly Phe Phe Phe His Lys Phe Asp Gly Phe1 5 10 15<210>27<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>27Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile1 5 10 15<210>28<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>28Met Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Met Glu Thr Met1 5 10 15<210>29<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)
<400>29Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Leu Glu Gly Val1 5 10 15<210>30<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>30Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile1 5 10 15<210>31<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>31Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr Ile1 5 10 15<210>32<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>32Met Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Leu Glu Gly Met1 5 10 15<210>33<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>33Leu Thr Glu Met Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Met Glu Thr Val1 5 10 15
<210>34<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>34Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile1 5 10 15<210>35<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>35Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr Ile1 5 10 15<210>36<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>36Met Ser Glu Met Lys Gly Val Ile Val His Lys Met Glu Gly Met1 5 10 15<210>37<211>15<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>37Leu Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Leu Glu Thr Val1 5 10 15<210>38<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)
<400>38Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly1 5 10 15Ile Leu Phe<210>39<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>39Ile Ser Met Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Met Glu Thr1 5 10 15Met Leu Phe<210>40<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>40Ile Ser Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Leu Glu Gly1 5 10 15Val Leu Phe<210>41<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>41Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly
l 5 10 15Ile Leu Phe<210>42<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>42Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr1 5 10 15Ile Leu Phe<210>43<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>43Ile Ser Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Leu Glu Gly1 5 10 15Met Leu Phe<210>44<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>44Ile Ser Met Thr Glu Met Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Met Glu Thr1 5 10 15Val Leu Phe
<210>45<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>45Ile Ser Leu Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Leu Glu Thr1 5 10 15Val Leu Phe<210>46<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>46Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr1 5 10 15Ile Leu Phe<210>47<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>47Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly1 5 10 15Ile Leu Phe<210>48
<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>48Ile Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr1 5 10 15Ile Leu Phe<210>49<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>49Ile Ser Met Ser Glu Met Lys Gly Val Ile Val His Lys Met Glu Gly1 5 10 15Met Leu Phe<210>50<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>50Ile Ser Leu Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Leu Glu Thr1 5 10 15Val Leu Phe<210>51<211>19<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)
<400>51Ile Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg I1e Glu Thr1 5 10 15Ile Leu Phe<210>52<211>15<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>52Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp1 5 10 15<210>53<211>18<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>53Lys Lys Lys Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser1 5 10 15Leu Asp<210>54<211>14<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>54Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu1 5 10<210>55<211>18
<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>55Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr Leu Pro Gln Ser1 5 10 15Leu Asp<210>56<211>18<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>56Arg Arg Arg Ile Lys Ile Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Pro Leu Ser1 5 10 15Ile Arg<2l0>57<211>18<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>57Lys Lys Lys Val Arg Val Val Thr Lys Val Val Thr Val Pro Ile Ser1 5 10 15Val Asp<210>58<211>18<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>58
Lys Lys Lys Phe Phe Phe Phe Thr Lys Phe Phe Thr Phe Pro Val Ser1 5 10 15Phe Asp<210>59<211>18<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>59Lys Lys Lys Leu Phe Leu Leu Thr Lys Leu Leu Thr Leu Pro Phe Ser1 5 10 15Leu Asp<210>60<211>18<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>60Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr1 5 10 15Ile Asp<210>61<211>17<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>61Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr1 5 10 15
Ile<210>62<211>18<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>62Lys Lys Lys Met Met Thr Met Thr Arg Met Ile Thr Met Ile Thr Thr1 5 10 15Ile Asp<210>63<211>16<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>63Phe Ile Thr Met Asp Thr Lys Phe Leu Leu Ala Ser Thr His Ile Leu1 5 10 15<210>64<211>19<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>64Lys Lys Lys Phe Ile Thr Met Asp Thr Lys Phe Leu Leu Ala Ser Thr1 5 10 15His Ile Leu<210>65<211>42<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)<400>65Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40<210>66<211>28<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>66Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys20 25<210>67<211>14<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>67Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His1 5 10<210>68<211>12<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>68
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val1 5 10<210>69<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>69Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr1 5 10<210>70<211>45<212>PRT<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)<400>70Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Gly Phe Phe20 25 30Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp35 40 45<210>71<211>30<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>71Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Lys Ile Ser Ile Thr Glu1 5 10 15Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe20 25 30
<210>72<211>32<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>72Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val Lys Ile Ser Ile1 5 10 15Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe20 25 30<210>73<211>34<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>73Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Gh Val His His Lys Ile1 5 10 15Ser Ile Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile20 25 30Leu Phe<210>74<211>48<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>74Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 10 15Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Lys Ile Ser Ile20 25 30
Thr Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Ile Glu Thr Ile Leu Phe35 40 45<210>75<211>34<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>75Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Ile1 5 10 15Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Lys Ile Glu Gly Ile20 25 30Leu Phe<210>76<211>34<212>PRT<213>麻疹病毒(Measles virus)<400>76Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Lys Ilel 5 10 15Ser Ile Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Ile Glu Thr Ile20 25 30Leu Phe<210>77<211>6<212>PRT<213>人工<220>
<223>合成的肽接頭
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(3)..(3)<223>X＝任何氨基酸<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(5)..(5)<223>X＝任何氨基酸<400>77Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro1 權(quán)利要求
1.一種長約20-100個氨基酸的肽免疫原，包含(i)一種選自SEQ ID Nos1-64的輔助T細胞(Th)表位；(ii)一個Aβ1-42肽N末端片段，SEQ ID NO65，由10-28個氨基酸殘基組成，其中每個片段包含Aβ1-42肽或Aβ1-42肽N末端片段的免疫功能類似物的氨基酸殘基1；和(iii)任選地，一個由至少一種氨基酸組成的間隔臂以隔離免疫結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的肽免疫原，其中所述間隔臂選自一種氨基酸，Gly-Gly，(α，ε-N)-Lys和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO73)。
3.權(quán)利要求2的肽免疫原，其中所述間隔臂是Gly-Gly。
4.權(quán)利要求2的肽免疫原，其中所述間隔臂是ε-N-Lys。
5.權(quán)利要求1的肽免疫原，其中所述Aβ1-42肽的N末端片段選自SEQ IDNOs66-69和其免疫功能類似物。
6.權(quán)利要求2，3或4任一項的肽免疫原，其中所述Aβ1-42肽的N末端片段選自SEQ ID NOs66-69和其免疫功能類似物。
7.權(quán)利要求1的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。
8.權(quán)利要求2，3或4任一項的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。
9.一種選自SEQ ID NOs70，71，72，73和74的肽免疫原。
10.權(quán)利要求9的肽免疫原，包含SEQ ID NO73。
11.權(quán)利要求9的肽免疫原，包含SEQ ID NO74。
12.由下述公式之一表示的肽免疫原(A)n-(Aβ1-42肽的N-末端片段)-(B)o-(Th)m-X；或(A)n-(Th)m-(B)o-(Aβ1-42肽的N-末端片段)-X；其中每個A獨立是一種氨基酸；每個B選自一種氨基酸，gly-gly，(α，ε-N)-lys，和Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO73)的連接序列；Th包含一種組成輔助T細胞表位的氨基酸序列，選自SEQ ID NOs1-64和其免疫增強類似物；(Aβ1-42肽的N-末端片段)是10-約28個氨基酸殘基，并且其中每個片段包含Aβ1-42肽的EFRH和其免疫功能類似物；X是一種氨基酸的α-COOH或α-CONH2；n是0-約10；m是1-約4；和o是0-約10。
13.權(quán)利要求12的肽免疫原，其中所述間隔臂是Gly-Gly。
14.權(quán)利要求12的肽免疫原，其中所述間隔臂是ε-N-Lys。
15.權(quán)利要求12的肽免疫原，其中所述Aβ1-42肽的N-末端片段選自SEQ IDNOs66-69和其免疫有效類似物。
16.權(quán)利要求13或14任一項的肽免疫原，其中所述Aβ1-42肽的N-末端片段選自SEQ ID NOs66-69和其免疫功能類似物。
1 7.權(quán)利要求12的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。
18.權(quán)利要求13或14任一項的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。
19.權(quán)利要求15的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。
20.權(quán)利要求16的肽免疫原，其中Th選自SEQ ID NOs1，3，4，5，6，7，8，9，20，38-40，47-51和52-54。
21.一種包含權(quán)利要求1的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
22.一種包含權(quán)利要求2的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
23.一種包含權(quán)利要求3的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
24.一種包含權(quán)利要求4的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA 720。
25.一種包含權(quán)利要求5的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
26.一種包含權(quán)利要求6的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
27.一種包含權(quán)利要求7的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
28.一種包含權(quán)利要求8的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
29.一種包含權(quán)利要求9的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
30.一種包含權(quán)利要求10的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
31.一種包含權(quán)利要求11的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
32.一種包含權(quán)利要求12的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
33.一種包含權(quán)利要求13的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
34.一種包含權(quán)利要求14的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
35.一種包含權(quán)利要求15的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
36.一種包含權(quán)利要求16的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
37.一種包含權(quán)利要求17的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
38.一種包含權(quán)利要求18的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
39.一種包含權(quán)利要求19的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
40.一種包含權(quán)利要求20的肽免疫原和一種藥用佐劑和/或載體的組合物，所述藥用佐劑和/或載體選自明礬，liposyn，皂苷，角鯊烯，L121，emulsigen monophosphyryl lipid A(MPL)，多乙氧基醚，QS21，MontanideISA51，ISA35，ISA206和ISA720。
41.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求21的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
42.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求22的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
43.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求23的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
44.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求24的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
45.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求25的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
46.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求26的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
47.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求27的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
48.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求28的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
49.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求29的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
50.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求30的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
51.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求31的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
52.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求32的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
53.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求33的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
54.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求34的組合物來預(yù)防阿爾茲海默氏病的方法。
55.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求35的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
56.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求36的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
57.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求37的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
58.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求38的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
59.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求39的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
60.一種通過對哺乳動物給藥權(quán)利要求40的組合物來預(yù)防或治療阿爾茲海默氏病的方法。
61.一種通過給藥權(quán)利要求21的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
62.一種通過給藥權(quán)利要求22的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
63.一種通過給藥權(quán)利要求23的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
64.一種通過給藥權(quán)利要求24的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
65.一種通過給藥權(quán)利要求25的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
66.一種通過給藥權(quán)利要求26的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
67.一種通過給藥權(quán)利要求27的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
68.一種通過給藥權(quán)利要求28的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
69.一種通過給藥權(quán)利要求29的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
70.一種通過給藥權(quán)利要求30的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
71.一種通過給藥權(quán)利要求31的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
72.一種通過給藥權(quán)利要求32的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
73.一種通過給藥權(quán)利要求33的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
74.一種通過給藥權(quán)利要求34的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
75.一種通過給藥權(quán)利要求35的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
76.一種通過給藥權(quán)利要求36的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
77.一種通過給藥權(quán)利要求37的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
78.一種通過給藥權(quán)利要求38的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
79.一種通過給藥權(quán)利要求39的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
80.一種通過給藥權(quán)利要求40的組合物生產(chǎn)抗Aβ1-42肽的抗體的方法，所述抗體與可溶性Aβ肽和從那里形成的腦組織斑交叉反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組合物，其包含用于預(yù)防和治療阿爾茲海默氏病的肽免疫原。更具體地，該肽免疫原包含一個主要的功能/調(diào)控位點，與具有多個II類MHC結(jié)合基序的輔助T細胞表位(Th)連接的淀粉樣蛋白β(Aβ)肽的N－末端片段。該肽免疫原引發(fā)抗Aβ肽的主要功能/調(diào)控位點的定點免疫反應(yīng)并產(chǎn)生抗體，所述抗體與阿爾茲海默氏病患者腦中形成的可溶性Aβ
文檔編號C07K7/06GK1568329SQ02810621
公開日2005年1月19日 申請日期2002年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月25日
發(fā)明者王長怡 申請人:美國聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司