本發(fā)明屬于醫(yī)用生物材料領域，涉及一種凝膠制劑，特別是一種藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑及其制備方法與應用。
背景技術：
水產(chǎn)膠原蛋白是一種天然的生物高分子材料，具有低抗原性、止血性、可生物吸收，可以對創(chuàng)傷的皮膚海綿組織提供持續(xù)而緩慢的給藥，促進肉芽生長、防止再出血，促進傷口愈合。
殼聚糖是自然界中存在的天然堿性多糖，是甲殼素的脫乙酰基產(chǎn)物，甲殼素在自然界中含量僅次于纖維素，來源廣泛。殼聚糖作為一種天然高分子材料，具有良好的生物相容性、可降解性、抗菌性、促愈性、無毒、對粘膜無刺激性，可以促進黏膜粘附，在生物醫(yī)用材料領域具有廣泛的應用。
口腔潰瘍是一種最常見的深達真皮的粘膜上皮局限性缺損，是口腔粘膜病中最常見的臨床表現(xiàn)，患病率高達20%。口腔潰瘍病理改變以口腔局部黏膜潰瘍性損害為主，發(fā)病機制極其復雜，與遺傳因素、免疫因素等很多因素有關，具有周期性及燒灼性疼痛特點，一旦形成潰瘍后可繼續(xù)感染，造成潰瘍局部組織炎癥和壞死，病程遷延，其病因未完全明確，跟免疫、遺傳、精神因素、維生素類缺乏等有關，因而治療藥物較多，效果不盡理想，目前臨床上無根治的特效方法。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提出了一種藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑。
本發(fā)明還提供了前述凝膠制劑的一種制備方法。
本發(fā)明還提供了前述凝膠制劑制備修復口腔創(chuàng)面藥物中的應用。
本發(fā)明要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現(xiàn)的，一種藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑，其特點是，該凝膠制劑由以下重量百分比的組分組成：
藍鯊魚皮膠原蛋白 1-9%；
殼聚糖 0.25-2.25%；
余量為凝膠基質。
本發(fā)明所述的藍鯊魚皮膠原蛋白采用以下方法進行制備：
（1）取藍鯊魚皮，剔除皮下肌肉和脂肪組織，再至于蒸餾水中浸泡0.5-1h，將魚皮剪成大小為3-5 mm×3-5 mm的魚皮塊，過濾抽干備用；
（2）將步驟（1）中得到的魚皮塊置于0.25-0.5 M NaOH溶液中浸泡脫脂，攪拌4-12h，置于4℃冷藏8-16h，取出后用蒸餾水沖洗干凈；
（3）將脫脂處理處理后的魚皮塊置于70%乙醇溶液中浸泡脫糖，攪拌4-6h，取出后用蒸餾水沖洗干凈；
（4）將脫糖處理過的魚皮塊粉碎，置于0.25M冰醋酸溶液中浸泡并攪拌2-6h，置于4℃冷藏12h，得魚皮提取液；
（5）取魚皮提取液過濾，收集濾液，向濾液中加入0.25-0.5M的NaOH溶液至溶液pH達6.8-7.0，至大量白色絮狀物析出，過濾取沉淀物，沉淀物用蒸餾水清洗后擠干密封，冷凍干燥，得藍鯊魚皮膠原蛋白塊狀提取物；
（6）將藍鯊魚皮膠原蛋白塊狀提取物在液氮低溫環(huán)境下進行超細粉碎處理，得粉狀藍鯊魚皮膠原蛋白。
本發(fā)明所述的藍鯊魚皮膠原蛋白的分子量為100-300 KDa。
進一步優(yōu)選地，所述的藍鯊魚皮膠原蛋白的分子量為130-200 KDa。
本發(fā)明所述的殼聚糖的脫乙酰度>95%。
本發(fā)明所述的凝膠基質包括以下重量份的原料：
山梨糖醇 30-40；
甘油 8-12；
纖維素膠 1.3-1.6；
羥苯甲酯鈉 0.13-0.17；
羥苯丙酯鈉 0.09-0.11；
檸檬酸 0.03-0.06；
水 50-56。
進一步優(yōu)選地，所述的凝膠基質包括以下重量份的原料：
山梨糖醇 33-37；
甘油 9.5-10.5；
纖維素膠 1.2-1.5；
羥苯甲酯鈉 0.14-0.15；
羥苯丙酯鈉 0.09-0.1；
檸檬酸 0.05-0.06；
水 53-55。
進一步優(yōu)選地，所述的凝膠基質包括以下重量份的原料：
山梨糖醇 35；
甘油 10；
纖維素膠 1.5；
羥苯甲酯鈉 0.15；
羥苯丙酯鈉 0.1；
檸檬酸 0.05；
水 53.2。
本發(fā)明還提供了以上技術方案所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑的制備方法，其特點是，該凝膠制劑采用如下方法制備：將粉狀藍鯊魚皮膠原蛋白與殼聚糖混合，得混合物，向混合物中加入凝膠基質，充分混合研磨，即得藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑；其中，將凝膠基質中的各組分充分混勻后再加入藍鯊魚皮膠原蛋白與殼聚糖的混合物中。
本發(fā)明所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑可用于修復口腔創(chuàng)面。
本發(fā)明以藍鯊魚皮下腳料為原料，通過簡便、高效的等電點沉淀法技術，提取出藍鯊魚皮膠原蛋白，有效利用了藍鯊下腳料，變廢為寶，提高了水產(chǎn)品加工業(yè)的附加值。本發(fā)明藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑在應用時直接涂抹于口腔潰瘍面，本發(fā)明凝膠制劑中使用的藍鯊魚皮膠原蛋白和殼聚糖均為天然可降解的生物醫(yī)用材料，通過合理的配伍，將藍鯊魚皮膠原蛋白和殼聚糖共同使用，同時發(fā)揮兩種生物材料的功效，避免了單一治療的弊端，具有優(yōu)異的生物相容性，可用于修復口腔創(chuàng)面，能夠顯著加速縮小口腔潰瘍直徑，減輕充血水腫程度，加速口腔潰瘍愈合，而且療效顯著，無不良反應，粘膜刺激性低，降解性好。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實施例19的藍鯊魚皮膠原蛋白凝膠制劑對大鼠口腔潰瘍療效的光學顯微鏡觀察結果。圖中：（a）模型組；(b) 高劑量組；(c) 中劑量組；（d）低劑量組；（e）單一膠原蛋白組；（f）凝膠組；（g）陽性對照組。
具體實施方式
以下結合具體實施例及附圖，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實施例1，一種藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑，該凝膠制劑由以下重量百分比的組分組成：
藍鯊魚皮膠原蛋白 9%；
殼聚糖 2.25%；
余量為凝膠基質。
實施例2，一種藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑，該凝膠制劑由以下重量百分比的組分組成：
藍鯊魚皮膠原蛋白 3%；
殼聚糖 0.75%；
余量為凝膠基質。
實施例3，一種藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑，該凝膠制劑由以下重量百分比的組分組成：
藍鯊魚皮膠原蛋白 1%；
殼聚糖 0.25%；
余量為凝膠基質。
實施例4，一種藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑，該凝膠制劑由以下重量百分比的組分組成：
藍鯊魚皮膠原蛋白 4%；
殼聚糖 1%；
余量為凝膠基質。
實施例5，實施例1-4任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的藍鯊魚皮膠原蛋白的制備方法如下：
（1）取藍鯊魚皮，剔除皮下肌肉和脂肪組織，再至于蒸餾水中浸泡0.5h，將魚皮剪成大小為3mm ×3mm的魚皮塊，過濾抽干備用；
（2）將步驟（1）中得到的魚皮塊置于0.25M NaOH溶液中浸泡脫脂，攪拌4h，置于4℃冷藏8h，取出后用蒸餾水沖洗干凈；
（3）將脫脂處理處理后的魚皮塊置于70%乙醇溶液中浸泡脫糖，攪拌4h，取出后用蒸餾水沖洗干凈；
（4）將脫糖處理過的魚皮塊粉碎，置于0.25M冰醋酸溶液中浸泡并攪拌2h，置于4℃冷藏12h，得魚皮提取液；
（5）取魚皮提取液過濾，收集濾液，向濾液中加入0.25M的NaOH溶液至溶液pH達6.8，至大量白色絮狀物析出，過濾取沉淀物，沉淀物用蒸餾水清洗后擠干密封，冷凍干燥，得藍鯊魚皮膠原蛋白塊狀提取物；
（6）將藍鯊魚皮膠原蛋白塊狀提取物在液氮低溫環(huán)境下進行超細粉碎處理，得粉狀藍鯊魚皮膠原蛋白。
實施例6，實施例1-4任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的藍鯊魚皮膠原蛋白的制備方法如下：
（1）取藍鯊魚皮，剔除皮下肌肉和脂肪組織，再至于蒸餾水中浸泡1h，將魚皮剪成大小為5 mm ×5 mm的魚皮塊，過濾抽干備用；
（2）將步驟（1）中得到的魚皮塊置于0.5 M NaOH溶液中浸泡脫脂，攪拌12h，置于4℃冷藏16h，取出后用蒸餾水沖洗干凈；
（3）將脫脂處理處理后的魚皮塊置于70%乙醇溶液中浸泡脫糖，攪拌6h，取出后用蒸餾水沖洗干凈；
（4）將脫糖處理過的魚皮塊粉碎，置于0.25M冰醋酸溶液中浸泡并攪拌6h，置于4℃冷藏12h，得魚皮提取液；
（5）取魚皮提取液過濾，收集濾液，向濾液中加入0.5M的NaOH溶液至溶液pH達7.0，至大量白色絮狀物析出，過濾取沉淀物，沉淀物用蒸餾水清洗后擠干密封，冷凍干燥，得藍鯊魚皮膠原蛋白塊狀提取物；
（6）將藍鯊魚皮膠原蛋白塊狀提取物在液氮低溫環(huán)境下進行超細粉碎處理，得粉狀藍鯊魚皮膠原蛋白。
實施例7，實施例1-4任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的藍鯊魚皮膠原蛋白的制備方法如下：
（1）取藍鯊魚皮，剔除皮下肌肉和脂肪組織，再至于蒸餾水中浸泡1h，將魚皮剪成大小為4 mm ×4mm的魚皮塊，過濾抽干備用；
（2）將步驟（1）中得到的魚皮塊置于0.4M NaOH溶液中浸泡脫脂，攪拌8h，置于4℃冷藏12h，取出后用蒸餾水沖洗干凈；
（3）將脫脂處理處理后的魚皮塊置于70%乙醇溶液中浸泡脫糖，攪拌5h，取出后用蒸餾水沖洗干凈；
（4）將脫糖處理過的魚皮塊粉碎，置于0.25M冰醋酸溶液中浸泡并攪拌4h，置于4℃冷藏12h，得魚皮提取液；
（5）取魚皮提取液過濾，收集濾液，向濾液中加入0.4M的NaOH溶液至溶液pH達6.9，至大量白色絮狀物析出，過濾取沉淀物，沉淀物用蒸餾水清洗后擠干密封，冷凍干燥，得藍鯊魚皮膠原蛋白塊狀提取物；
（6）將藍鯊魚皮膠原蛋白塊狀提取物在液氮低溫環(huán)境下進行超細粉碎處理，得粉狀藍鯊魚皮膠原蛋白。
實施例8，實施例1-7任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的藍鯊魚皮膠原蛋白的分子量為100KDa。
實施例9，實施例1-7任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的藍鯊魚皮膠原蛋白的分子量為300 KDa。
實施例10，實施例1-7任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的藍鯊魚皮膠原蛋白的分子量為130 KDa。
實施例11，實施例1-7任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的藍鯊魚皮膠原蛋白的分子量為200 KDa。
實施例12，實施例1-11任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的殼聚糖的脫乙酰度>95%。
實施例13，實施例1-12任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的凝膠基質包括以下重量份的原料：
山梨糖醇 30；
甘油 8；
纖維素膠 1.3；
羥苯甲酯鈉 0.13；
羥苯丙酯鈉 0.09；
檸檬酸 0.03；
水 50。
實施例14，實施例1-12任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的凝膠基質包括以下重量份的原料：
山梨糖醇 40；
甘油 12；
纖維素膠 1.6；
羥苯甲酯鈉 0.17；
羥苯丙酯鈉 0.11；
檸檬酸 0.06；
水 56。
實施例15，實施例1-12任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的凝膠基質包括以下重量份的原料：
山梨糖醇 33；
甘油 9.5；
纖維素膠 1.2；
羥苯甲酯鈉 0.14；
羥苯丙酯鈉 0.09；
檸檬酸 0.05；
水 53。
實施例16，實施例1-12任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的凝膠基質包括以下重量份的原料：
山梨糖醇 37；
甘油 10.5；
纖維素膠 1.5；
羥苯甲酯鈉 0.15；
羥苯丙酯鈉 0.1；
檸檬酸 0.06；
水 55。
實施例17，實施例1-12任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑中，所述的凝膠基質包括以下重量份的原料：
山梨糖醇 35；
甘油 10；
纖維素膠 1.5；
羥苯甲酯鈉 0.15；
羥苯丙酯鈉 0.1；
檸檬酸 0.05；
水 53.2。
實施例18，實施例13-17任何一項所述的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑的制備方法如下：將藍鯊魚皮膠原蛋白與殼聚糖混合，得混合物，向混合物中加入凝膠基質，充分混合研磨，即得藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑；其中，將凝膠基質中的各組分充分混勻后再加入藍鯊魚皮膠原蛋白與殼聚糖的混合物中。
實施例19，實驗例，藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑對大鼠實驗性口腔潰瘍的影響。
1、受試藥物
本發(fā)明實施例1-3的藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑，其中：藍鯊魚皮膠原蛋白的制備方法采用實施例7所述的方法；藍鯊魚皮膠原蛋白的分子量為150KDa；殼聚糖的脫乙酰度＞95%；凝膠基質由以下重量份的原料制成：山梨糖醇35、甘油10、纖維素膠1.5、羥苯甲酯鈉0.15、羥苯丙酯鈉0.1、檸檬酸0.05、水53.2；藍鯊魚皮膠原蛋白的復合凝膠制劑的制備方法采用實施例18所述的方法。
2、試驗動物
雄性SD大鼠，200～220 g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。
3、實驗方法
取健康 SD 雄性大鼠 48只，隨機分為7組，每組8只。分別為：模型組；受試藥物組：3個劑量組（高劑量組：藍鯊魚皮膠原蛋白9%，殼聚糖2.25%加入100 mL凝膠基質；中劑量組：藍鯊魚皮膠原蛋白3%，殼聚糖0.75%加入100 mL凝膠基質；低劑量組：藍鯊魚皮膠原蛋白1%，殼聚糖0.25%加入100 mL凝膠基質）；陰性對照：單一膠原蛋白組（藍鯊魚皮膠原蛋白3%加入100 mL凝膠基質）和凝膠對照組（凝膠基質不加任何輔料）；陽性藥對照：重組人表皮生長因子凝膠（桂林華諾威基因藥業(yè)有限公司，批號：201412102A）。
大鼠用10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，用內(nèi)徑0.4 cm，長3 cm的塑料管（一端塞棉花，以防溶液漏出）， 向管內(nèi)注滿35%冰醋酸溶液，將塞入棉花端于大鼠下嘴唇內(nèi)側粘膜表面垂直固定60s，即可觀察到下嘴唇局部有紅暈，24h后觀察，出現(xiàn)潰瘍，模型即成功建立。
造模24h后觀察口腔潰瘍面積，并開始給藥，每天給藥2次，模型組不給藥。給藥前用棉球蘸生理鹽水輕輕擦拭大鼠口腔表面，分別用小藥勺取相應的藥物約100mg涂抹于口腔潰瘍面，給藥后禁食禁水30min。每天觀察口腔潰瘍表面情況，并于給藥前、給藥后第1天，第3天、第7天、第10天和第12天，游標卡尺測定潰瘍長和寬，計算潰瘍面積（面積=長×寬×3.14 / 4）。
給藥12天后，模型組和各給藥組均取6只肉眼觀察潰瘍較輕的大鼠麻醉處死，取一部分嘴唇潰瘍及周圍組織標本，用10%甲醛液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋切片、HE染色，光鏡下觀察潰瘍組織的組織病理學變化。
5、統(tǒng)計方法
使用SPSS 17.0 軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示（± SD），組間采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗差異的顯著性，P < 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
6、實驗結果
模型組口腔潰瘍大鼠下嘴唇內(nèi)黏膜處開始出現(xiàn)局部有紅暈，形成潰瘍后表面呈灰白色，周圍有充血水腫，略微凹陷，潰瘍較嚴重，造模1-3天潰瘍直徑略有擴大，隨后口腔潰瘍逐漸減輕。
藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑給藥1天后，潰瘍面擴大不明顯；用藥3天后，潰瘍表面開始有假膜覆蓋，潰瘍直徑縮小；用藥12天后，假膜脫落，新鮮創(chuàng)面暴露，潰瘍面明顯縮小，潰瘍陸續(xù)愈合。藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑各劑量組均可縮小潰瘍直徑，給藥第3天、第7天、第10天和第12天， 潰瘍面積與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），且作用具有一定的劑量依賴關系。對潰瘍面積的影響結果見表1，對潰瘍面積的影響光學顯微鏡觀察結果見圖1。
由圖1可看出，造模后第12天，模型組口腔潰瘍部位組織損傷較重，潰瘍部位組織壞死也較明顯，可見肉芽組織和纖維化；海洋魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑各劑量組和陽性對照組口腔潰瘍部位組織損傷較輕，壞死程度顯著減輕，肉芽組織和纖維化形成明顯。單一膠原蛋白組和凝膠組口腔潰瘍部位組織有所愈合，壞死程度輕，肉芽組織和纖維化形成較明顯。
表1.藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑對實驗性大鼠口腔潰瘍面積的影響 (n = 8，±s)
注：與模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01
7、結論
結果顯示，本發(fā)明凝膠制劑可以明顯減輕大鼠口腔潰瘍面積及其壞死程度，與模型組相比，給藥第3天即存在極顯著性差異（P ＜0.01）。由病理切片結果可見，海洋魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑各劑量組口腔潰瘍部位組織損傷較輕，壞死程度顯著減輕，肉芽組織和纖維化形成明顯。實驗結果提示：本發(fā)明藍鯊魚皮膠原蛋白復合凝膠制劑具有修復口腔創(chuàng)面的作用。