本發(fā)明涉及一種流感病毒四價(jià)亞單位疫苗及其應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

流行性感冒病毒(influenzavirus)，簡稱流感病毒，是一種造成人類及動(dòng)物患流行性感冒的RNA病毒，流感病毒屬于正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)。流感病毒會(huì)造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速的傳播，在世界各地常會(huì)有周期性的大流行。流行性感冒病毒在免疫力較弱的老人或小孩及一些免疫失調(diào)的病人會(huì)引起較嚴(yán)重的癥狀，如肺炎或是心肺衰竭等。

流感病毒主要由囊膜和核衣殼構(gòu)成，囊膜由纖突、雙層類脂膜和基質(zhì)蛋白(M)構(gòu)成。纖突分為兩類：一類呈棒狀，由血凝素(HA)分子的三聚體構(gòu)成；另一類呈蘑菇狀，由神經(jīng)氨酸酶(NA)分子的四聚體構(gòu)成。雙層類脂膜為病毒粒子出芽時(shí)從宿主細(xì)胞膜獲得的?；|(zhì)蛋白緊密排列在囊膜內(nèi)側(cè)，是維持病毒形態(tài)的結(jié)構(gòu)蛋白?；|(zhì)蛋白內(nèi)部包圍著核衣殼，核衣殼由8個(gè)呈螺旋形排列的RNA-核蛋白復(fù)合物(RNP)構(gòu)成，每個(gè)RNP由一個(gè)單股負(fù)鏈RNA外面包被著核蛋白(NP)形成，流感病毒基因組的8個(gè)負(fù)鏈RNA就形成了8個(gè)RNP。按照核蛋白NP和基質(zhì)蛋白M抗原性的不同，流感病毒被分為A、B、C三型，也有學(xué)者稱為甲、乙、丙三型。它們沒有共同的抗原，但都能感染人，其中以A型流感病毒的流行規(guī)模最大。各型流感病毒又根據(jù)其病毒粒子表面的血凝素(HA，簡寫為H)和神經(jīng)氨酸酶(NA，簡寫為N)抗原性的不同而被分為多種亞型，其中A型流感病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的H亞型有18種，N亞型有11種，H和N亞型可以形成不同的組合，如H1N1、H5N1、H3N2、H9N2亞型等。

四次大流感的暴發(fā)和每年季節(jié)性流感的傳播嚴(yán)重威脅著人類健康并造成重大經(jīng)濟(jì)損失，不時(shí)突現(xiàn)的高致病性禽流感時(shí)刻警示人類新一輪大流感暴發(fā)的潛在可能。流感病毒的血凝素蛋白(hemagglutinin，HA)是病毒囊膜表面一個(gè)主要的抗原蛋白。HA蛋白最基本的功能是識(shí)別受體和膜融合，在病毒粒子包裝和出芽過程中也起到一定的作用。HA分子與流感病毒的宿主范圍、毒力、傳播能力，以及人類新流行毒株或大流行毒株的出現(xiàn)有密切的關(guān)系，也是藥物和疫苗設(shè)計(jì)主要的靶分子。

流感病毒疫苗接種是當(dāng)前人類預(yù)防流感的首選措施。然而，由于流感病毒血清型眾多，一旦流感病毒疫苗株和流行株的抗原性不匹配，就會(huì)導(dǎo)致疫苗失效，無法提供相應(yīng)的保護(hù)，無法對(duì)所有類型的流感病毒提供交叉保護(hù)。目前已經(jīng)批準(zhǔn)上市的疫苗都是病毒裂解疫苗，即滅活疫苗，如GSK公司生產(chǎn)的Quadrivalent和賽諾非巴斯德公司生產(chǎn)的都是多價(jià)的流感病毒裂解疫苗。該類疫苗需要先制備流感病毒活病毒，因此生產(chǎn)過程存在安全風(fēng)險(xiǎn)，而且生產(chǎn)成本也大大增加。目前尚無批準(zhǔn)上市的流感病毒亞單位疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)季節(jié)性流感病毒H3N2、2009年大流感的H1N1病毒和B型流感病毒B35和B51，我們設(shè)計(jì)了四價(jià)流感病毒亞單位疫苗，分別選取流感病毒株A/California/04/2009(H1N1)、A/HongKong/2014(H3N2)、B/Brisbane/60/2008(B35)和B/Massachusetts/2/2012(B51)，分別構(gòu)建其HA胞外區(qū)的桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒，通過昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分別獲得了可溶性的蛋白H1HA、H3HA、B35HA和B51HA，并利用分子篩和離子柱純化獲得了高純度的三聚體目的蛋白，通過免疫小鼠實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了該四價(jià)疫苗的有效性。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種四價(jià)蛋白質(zhì)疫苗，包括四種蛋白，所述蛋白質(zhì)分別命名為H1HA、H3HA、B35HA和B51HA，其氨基酸序列份為SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示；這四個(gè)蛋白分別是在H1N1亞型流感病毒株血凝素、H3N2亞型流感病毒株血凝素、B型流感病毒株B35亞型血凝素、B型流感病毒株B51亞型血凝素的胞外區(qū)的前面加上了GP67信號(hào)肽序列，后面加上凝血酶酶切位點(diǎn)、fibritin的三聚體標(biāo)簽和6×His標(biāo)簽。

所述蛋白質(zhì)疫苗還包括佐劑，包括鋁佐劑、MF59佐劑。

所述蛋白質(zhì)疫苗的制備方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒

擴(kuò)增編碼流感病毒株A/California/04/2009(H1N1)、A/HongKong/2014(H3N2)、B/Brisbane/60/2008(B35)和B/Massachusetts/2/2012(B51)的胞外區(qū)的核苷酸序列，加上GP67分泌信號(hào)肽，引導(dǎo)目的蛋白有效地分泌到細(xì)胞外；并加上一端編碼凝血酶(Thrombin)酶切位點(diǎn)、來自于T4噬菌體次要纖維蛋白fibritin的三聚體標(biāo)簽和6×His標(biāo)簽的核苷酸序列，使得目的蛋白的C端帶有凝血酶(Thrombin)酶切位點(diǎn)、來自于T4噬菌體次要纖維蛋白fibritin的三聚體標(biāo)簽和6×His標(biāo)簽；將所得片段連入到pFastBac^TM1載體上，形成重組質(zhì)粒(見圖1)；

(2)轉(zhuǎn)化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10BAC^TM E.coli感受態(tài)，得到陽性重組菌；

(3)提取Bacmid

從陽性重組菌中提取Bacmid；

(4)轉(zhuǎn)染

將Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9或Sf21細(xì)胞，獲得P1代重組桿狀病毒；

(5)擴(kuò)毒

將P1代重組桿狀病毒擴(kuò)毒得到P3代重組桿狀病毒；

(6)蛋白表達(dá)純化

P3代重組桿狀病毒感染Sf9或Sf21細(xì)胞，從細(xì)胞中分離純化得到目的蛋白；

(7)將4種目的蛋白按照特定比例，與佐劑混合，四價(jià)亞單位疫苗。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述四價(jià)疫苗在預(yù)防流感病毒方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供編碼所述四種蛋白的基因序列。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供表達(dá)四種蛋白的質(zhì)粒和細(xì)胞系統(tǒng)。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明獲得了一種流感病毒四價(jià)亞單位疫苗，該疫苗對(duì)小鼠有良好的保護(hù)作用，有預(yù)防流感病毒的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來快速制備獲得高純度的三聚體蛋白質(zhì)疫苗，所得疫苗免疫原性強(qiáng)，生產(chǎn)周期短，并且不存在任何的安全隱患，可以預(yù)防多種亞型的流感病毒。

附圖說明

圖1、表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。

圖2、流感病毒H1HA蛋白的分子篩純化結(jié)果；峰圖上蛋白編號(hào)為從4到23。

圖3、流感病毒H3HA蛋白的分子篩純化結(jié)果；圖中橫坐標(biāo)上40ml之后，次要刻度線標(biāo)記的蛋白的編號(hào)從左向右是1至20。

圖4、流感病毒B35HA蛋白的分子篩純化結(jié)果；圖中橫坐標(biāo)上40ml之后，次要刻度線標(biāo)記的蛋白的編號(hào)從左向右是1至40。

圖5、流感病毒B51HA蛋白的分子篩純化結(jié)果；圖中橫坐標(biāo)上40～70ml之間，次要刻度線標(biāo)記的蛋白的編號(hào)從左向右是1至19。

圖2～5中，沉淀表示收集蛋白時(shí)離心獲得的細(xì)胞沉淀；M代表蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；數(shù)字分別代表峰圖上相應(yīng)位置的蛋白組分。

圖6、小鼠免疫血清對(duì)H1N1病毒的中和效果；

圖7、小鼠免疫血清對(duì)H3N2病毒的中和效果；

圖8、小鼠免疫血清對(duì)B35病毒的中和效果；

圖9、小鼠免疫血清對(duì)B51病毒的中和效果；

圖6～9中，橫坐標(biāo)是不同組別免疫小鼠的血清，Al-5-3表示四種HA胞外區(qū)蛋白各5μg與鋁佐劑混勻后在第0、14和28天共三次免疫小鼠后分離的血清，Al-PBS-3表示PBS與鋁佐劑混勻后在第0、14和28天共三次接種小鼠后分離的血清，MF-10-3表示四種HA胞外區(qū)蛋白各10μg與MF59佐劑混勻后在第0、14和28天共三次免疫小鼠后分離的血清，MF-PBS-3表示PBS與MF59佐劑混勻后在第0、14和28天共三次接種小鼠后分離的血清，NC表示陰性對(duì)照，是從未經(jīng)任何免疫處理的小鼠中分離的血清，PC-3表示使用賽諾菲巴斯德公司的流感病毒裂解疫苗三次免疫小鼠后分離的血清。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：流感病毒HA蛋白的表達(dá)和純化

1、表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

分別選取流感病毒株A/California/04/2009(H1N1)、A/HongKong/2014(H3N2)、B/Brisbane/60/2008(B35)和B/Massachusetts/2/2012(B51)，由公司合成基因序列，構(gòu)建其HA胞外區(qū)的桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒。

具體地，A/California/04/2009(H1N1)的HA全長序列由大連寶生物生物工程有限公司合成。在此基礎(chǔ)上，擴(kuò)增出編碼H1N1蛋白的胞外區(qū)11-505位(按H3排序)氨基酸的核苷酸序列，在其前面加上GP67分泌信號(hào)肽，可將目的蛋白有效地分泌到細(xì)胞外。為促進(jìn)HA蛋白的三聚化，提高蛋白的免疫原性，并方便后續(xù)的純化，我們在HA胞外區(qū)的C端加上一段修飾序列：這一序列包括凝血酶(Thrombin)酶切位點(diǎn)、來自于T4噬菌體次要纖維蛋白fibritin的三聚體標(biāo)簽和末端的6×His標(biāo)簽，得到序列如SEQ ID NO.1所示的片段，將該片段連入到pFastBac^TM1載體上，形成pFastBac^TM1-H1HA重組質(zhì)粒。GP67信號(hào)肽的序列如SEQ ID NO.5所示，Thrombin酶切位點(diǎn)的序列如SEQ ID NO.6所示，三聚體標(biāo)簽的序列如SEQ ID NO.7所示，His標(biāo)簽為6個(gè)組氨酸。

H3N2的HA胞外區(qū)以及前面的GP67信號(hào)肽、后面的Thrombin酶切位點(diǎn)、三聚體標(biāo)簽和His標(biāo)簽由上海捷瑞生物工程有限公司直接合成，克隆構(gòu)建與H1N1的胞外區(qū)一致，命名為pFastBac^TM1-H3HA。

B35和B51的HA胞外區(qū)由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，克隆構(gòu)建與H1N1和H3N2的胞外區(qū)一致，也連入pFastBac^TM1載體上。分別形成pFastBac^TM1-B35HA重組質(zhì)粒和pFastBac^TM1-B51HA重組質(zhì)粒。

2、轉(zhuǎn)化

取100μl的DH10BAC^TM E.coli感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，加至少1ng pFastBac^TM1-H1HA重組質(zhì)粒至100μl DH10Bac^TM E.coli感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上放置30min。42℃熱激45s，立即插回冰上，靜置2min。在超凈臺(tái)中，每管加入800μl無抗LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4h。4小時(shí)培養(yǎng)后，取100μl菌液涂三抗平板(LB平板，含：50μg/ml卡那霉素(kanamycin)、7μg/ml慶大霉素(gentamicin)、10μg/ml四環(huán)霉素(tetracycline)、300μg/ml Bluo-gal，40μg/ml IPTG)，余下的菌液4℃暫存，平板倒置于37℃烘箱中培養(yǎng)24h。pFastBac^TM1-H3HA、pFastBac^TM1-B35HA和pFastBac^TM1-B51HA重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法與pFastBac^TM1-H1HA完全一致。

3、提取Bacmid

經(jīng)過PCR菌液鑒定為陽性的白斑菌液轉(zhuǎn)接至4ml含KGT三種抗生素的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)37℃培養(yǎng)16-24h，提取Bacmid(S.N.A.P.^TM MidiPrep Kit，Catalog no.K1910-01或者異丙醇沉淀法提取)。測質(zhì)粒濃度，挑選OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.0之間，濃度較高(500ng/μl或以上)的Bacmid做轉(zhuǎn)染比較好。并再次進(jìn)行PCR鑒定。

4、轉(zhuǎn)染

預(yù)先準(zhǔn)備好懸浮培養(yǎng)的Sf9或Sf21細(xì)胞，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，密度約1.5-2.5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。細(xì)胞計(jì)數(shù)板數(shù)細(xì)胞，確定細(xì)胞密度。鋪六孔板(孔直徑35mm)，每孔8×10⁵個(gè)細(xì)胞，將細(xì)胞搖勻。待板底細(xì)胞達(dá)到合適密度，吸取培養(yǎng)液，每孔加入1ml Grace’s Medium。Cellfectin II 6-8μl(4℃保存，加前混勻)加上Grace’s Medium 100μl，輕輕混勻，標(biāo)記為管1，靜置5min。將PCR鑒定結(jié)果為陽性的重組Bacmid 2μg加上Grace’s Medium 100μl，輕輕混勻，標(biāo)記為管2。管1的溶液轉(zhuǎn)移到管2中(總體積約210μl)，輕輕混勻，靜置20min。將六孔板中的培養(yǎng)基用移液器吸出，每孔加2ml Grace’s Medium洗滌2次，洗完棄去培養(yǎng)基。加0.8ml Grace’s Medium至步驟4的管1和管2混合液中，總共1ml，輕混后沿六孔板壁緩緩加入。將六孔板放入27℃培養(yǎng)箱中5h。換液：棄去六孔板中的混合液，每孔加2ml Sf-900^TM III SFM培養(yǎng)基(含三種抗生素：100單位/ml penicillin，100單位/ml streptomycin和0.25μg/mlAntimycotic，發(fā)揮抗細(xì)菌和抗真菌作用)。27℃培養(yǎng)箱中孵育。約72h以后，細(xì)胞裂解，單層細(xì)胞漂浮。收取2ml上清，500g，5min離心后轉(zhuǎn)移至干凈的離心管，錫箔紙包裹4℃避光保存，獲得P1代重組桿狀病毒(加胎牛血清至終濃度2％可防止蛋白酶對(duì)病毒的破壞)。若需長期保存，將P1病毒在液氮中凍后保存于-80℃。

5、擴(kuò)毒

重組桿狀病毒擴(kuò)增P1代病毒的滴度一般約1×10⁶-1×10⁷pfu/ml。pfu：plaque forming units(空斑形成單位)。擴(kuò)毒的MOI應(yīng)控制在0.05-0.1。MOI：multiplicity ofinfection(感染復(fù)數(shù))，接種體積(ml)＝MOI(pfu/cell)×細(xì)胞個(gè)數(shù)/病毒滴度(pfu/ml)。P1擴(kuò)P2實(shí)驗(yàn)步驟如下：每個(gè)10cm盤鋪1×10⁷個(gè)Sf9或Sf21細(xì)胞。算出所需P1體積，把病毒加入盤中，27℃培養(yǎng)箱孵育。48-72h收毒。一般P2病毒的滴度在10⁷-10⁸pfu/ml。P2病毒可以直接表達(dá)蛋白，或者繼續(xù)擴(kuò)增P3病毒，用P3代病毒表達(dá)蛋白。一般200μl的P2病毒可感染100ml懸浮培養(yǎng)的Sf9(1.5-2.0×10⁶)或Sf21(1.0-1.5×10⁶)細(xì)胞，48-72h收P3病毒。一般P3病毒的滴度達(dá)到10⁸pfu/ml。

6、蛋白表達(dá)純化

通過Western blot檢測目的蛋白的表達(dá)，然后P3病毒感染High Five^TM細(xì)胞密度約1.5-2.0×10⁶(Sf9密度2.0-3.0×10⁶；Sf21密度1.0-2.0×10⁶)，27℃搖床培養(yǎng)48h，鏡檢細(xì)胞約50％死亡率收細(xì)胞，將細(xì)胞倒入離心桶，7,000g離心45min，收集上清，0.22μm濾膜抽濾。使用HisTrapTMHP 5ml預(yù)裝柱(GE Healthcare)，在buffer3(20mM Tris，150mM NaCl，300mM咪唑，pH 8.0)洗脫目的HA蛋白，經(jīng)過透析濃縮至約10ml。濃縮后的HA蛋白用SuperdexTM200 10/300 GL column進(jìn)行分子篩純化(20mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH 8.0的緩沖液)，最終獲得目的的HA蛋白。并通過SDS-PAGE鑒定蛋白純度，蛋白純度達(dá)到95％以上。

四種蛋白H1HA、H3HA、B35HA和B51HA均使用同樣的方法制備。H1HA、H3HA、B35HA和B51HA的胞外區(qū)序列與GP67信號(hào)肽、凝血酶(Thrombin)酶切位點(diǎn)、T4噬菌體次要纖維蛋白fibritin的三聚體標(biāo)簽和末端的6×His標(biāo)簽的融合片段分別如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

實(shí)施例2：四價(jià)亞單位疫苗的性能檢測

將四價(jià)亞單位疫苗對(duì)小鼠進(jìn)行了免疫，小鼠接種方案請(qǐng)見表1。分別在第0天、14天和28天進(jìn)行三次對(duì)小鼠腿部進(jìn)行接種，每組小鼠每次接種的蛋白及佐劑的種類和數(shù)量一致。分別在二免和三免后的12天采集小鼠的尾血，分離血清。在第0天采用眼球取血的方法采集分離6只小鼠的樣本做陰性對(duì)照。

免疫小鼠時(shí)采用不同的蛋白劑量、不同的佐劑進(jìn)行免疫。蛋白劑量分為30μg，10μg，5μg和2.5μg四個(gè)梯度，佐劑分為鋁和MF59兩種。例如免疫方案中第一組是將四種蛋白H1HA、H3HA、B35HA和B51HA各10μg混勻，使得總體積為600μl。然后加入600μl的MF59佐劑，使用1ml注射器反復(fù)吹打，充分混勻蛋白和佐劑，然后取150μl該混合液接種小鼠大腿部，共接種6只小鼠。

表1、小鼠免疫方案

隨后，我們通過流感病毒中和實(shí)驗(yàn)檢測小鼠血清對(duì)流感病毒的中和效果。分別采用的流感病毒株為：A/California/04/2009(H1N1)，A/Texas/50/2012(H3N2)，B/Brisbane/60/2008和B/Massachusetts/2/2012。將血清用RDE處理后，進(jìn)行2倍倍比稀釋，與等體積的病毒(200TCID50/100ul)孵育1.5小時(shí)。取100μl加在長滿MDCK細(xì)胞的96孔板中，37℃培養(yǎng)72小時(shí)，期間定期觀察細(xì)胞病變情況。經(jīng)過血凝法檢測中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)過三次鋁佐劑免疫后的血清可以顯著中和A/California/04/2009(H1N1)病毒(5μg HA蛋白/鋁佐劑組，TICD50＝10E-1.6)和B/Massachusetts/2/2012(B51)病毒(5μg HA蛋白/鋁佐劑組，TICD50＝10E-2.58)。小鼠經(jīng)過三次鋁佐劑免疫后的血清對(duì)B/Brisbane/60/2008(B35)病毒和A/Beijing Huairou/1178/2014(H3N2)病毒的中和效價(jià)較低，但是加上MF59佐劑免疫后的血清可以顯著中和B/Brisbane/60/2008(B35)病毒(10μg HA蛋白/MF59佐劑組，TCID50＝10E-2.36)，并且可以在一定程度上中和H3N2病毒(A/Beijing Huairou/1178/2014)(2.5μg HA蛋白/MF59佐劑組TCID50＝10E-1.76)。

我們通過小鼠免疫方案和病毒中和實(shí)驗(yàn)，可以初步證明添加佐劑后的四價(jià)疫苗可以有效提高動(dòng)物對(duì)甲型H1N1和H3N2病毒和B型流感病毒(B35、B51)免疫能力。

綜上，我們發(fā)明了一種流感病毒四價(jià)亞單位疫苗，該疫苗包括四種HA蛋白，H1HA、H3HA、B35HA和B51HA，加入鋁或MF59佐劑后，該四價(jià)疫苗可以有效提高小鼠對(duì)甲型H1N1病毒和B型流感病毒(B35、B51)免疫能力，對(duì)H3N2病毒也有一定的免疫效果。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。