本發(fā)明涉及中成藥物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種抗肝纖維化的中成藥。

背景技術(shù)：

肝纖維化是由于各種原因引起肝細(xì)胞損傷,激活肝星狀細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)變成為肌纖維母細(xì)胞，炎癥因素、毒素等刺激損傷及再生的肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、自然殺傷 (NK)細(xì)胞產(chǎn)生免疫介質(zhì)和細(xì)胞因子,并且以自分泌或旁分泌的方式作用于靶細(xì)胞受體, 使肌纖維母細(xì)胞增殖,合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），細(xì)胞外基質(zhì)增生與降解失衡，纖維結(jié)締組織在肝臟內(nèi)部的出現(xiàn)過多沉積，肝臟的正常的組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，從而肝臟的正常的功能也出現(xiàn)異常，肝纖維化是各種慢性肝臟疾病的共同病理過程。肝纖維化是可逆的，這促使廣大中醫(yī)學(xué)工作者對(duì)肝纖維化階段進(jìn)行了各種研究和嘗試，盡可能在此階段或者肝硬化早期進(jìn)行肝纖維化的逆轉(zhuǎn)，防止向肝硬化晚期及肝癌的發(fā)展。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激(PI3K/Akt)信號(hào)通路與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中的肝星狀細(xì)胞活化及增殖、凋亡及遷移，還有細(xì)胞外基質(zhì)的分泌緊密相關(guān)。PI3K/Akt信號(hào)通路參與肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展：被激活的PI3K/Akt信號(hào)通路，可通過調(diào)節(jié)HSC增殖和遷移以及增加Ⅰ型、II型膠原的表達(dá)水平來促使肝纖維化形成；相反，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，則可誘導(dǎo)HSC凋亡，促進(jìn)ECM 的降解，進(jìn)而延緩了肝纖維化發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程。肝病患者病情不斷向前進(jìn)展的主要因素是炎癥的不斷發(fā)生，并進(jìn)一步使損失的肝臟在肝纖維化不斷發(fā)展的基礎(chǔ)上向著肝硬化進(jìn)展，故通過PI3K/Akt信號(hào)通路來調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的活化、肝臟細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解及肝竇毛細(xì)血管化，以達(dá)到減少肝臟內(nèi)炎癥反應(yīng)的作用，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用，進(jìn)而延緩肝病患者病情發(fā)展，在一定程度上也可控制甚至逆轉(zhuǎn)肝硬化的病情發(fā)展。中國傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥對(duì)肝纖維化有一定療效，但因肝病療程長、中藥湯劑服用不便，病人難以堅(jiān)持。進(jìn)十幾年來，市面上出現(xiàn)了各種各樣用于治療肝病的中成藥，如中國專利“乙肝轉(zhuǎn)陰散”，公開號(hào)為CN 1194849，該轉(zhuǎn)陰散主要針對(duì)乙肝病毒控制環(huán)節(jié)，兼具抗肝纖維化功效，隨著西藥在抗病毒上發(fā)揮的主導(dǎo)作用，“乙肝轉(zhuǎn)陰散”作為一個(gè)眾多藥物組成的制劑，在抗病毒治療上的優(yōu)勢(shì)上已逐漸下降。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的問題是提供一種具有溫陽利濕、化瘀散結(jié)作用，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用的中成藥。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：它由以下重量份的組分制備而成：熟地黃60份～100份、山茱萸20份～60份、山藥20份～50份、澤瀉20份～50份、茯苓20份～60份、丹皮20份～50份、肉桂5份～20份、附子5份～25份、車前子10份～40份、牛膝10份～50份、鱉甲12份～40份、三七2份～5份。

上述技術(shù)方案中，更具體的方案還可以是：所述各組分的重量份如下：

熟地黃85份、山茱萸35份、山藥35份、澤瀉35份、茯苓35份、丹皮35份、肉桂15份、附子15份、車前子25份、牛膝25份、鱉甲30份、三七5份。

進(jìn)一步的：所述各組分的重量份如下：

熟地黃80份、山茱萸40份、山藥40份、澤瀉30份、茯苓30份、丹皮30份、肉桂10份、附子10份、車前子20份、牛膝20份、鱉甲25份、三七3份。

進(jìn)一步的：所述各組分的重量份如下：

熟地黃60份、山茱萸20份、山藥20份、澤瀉20份、茯苓20份、丹皮20份、肉桂5份、附子5份、車前子10份、牛膝10份、鱉甲12份、三七2份。

進(jìn)一步的：所述各組分的重量份如下：

熟地黃100份、山茱萸60份、山藥50份、澤瀉50份、茯苓60份、丹皮50份、肉桂20份、附子25份、車前子40份、牛膝50份、鱉甲40份、三七5份。

進(jìn)一步的：該中成藥的劑型為散劑、丹劑、蜜丸、膠囊或水丸。

藥理分析：

調(diào)節(jié)免疫：①地黃水提物中分離得到的地黃低聚糖可明顯增強(qiáng)荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)及ConA誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)。另外有報(bào)道地黃多糖可明顯拮抗衰老模型小鼠胸腺及脾臟的萎縮,甚至使其免疫器官有關(guān)指標(biāo)如胸腺皮質(zhì)厚度及細(xì)胞數(shù)、脾小結(jié)及淋巴細(xì)胞數(shù)超過正常水平,顯示有較好的免疫興奮作用。②山茱萸水煎劑腹腔注射使小白鼠胸腺明顯萎縮。③連續(xù)7天腹腔注射山藥水煎液,結(jié)果表明山藥可顯著增加小鼠的脾臟重量。④茯苓多糖灌胃增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能，增加ANAE陽性淋巴細(xì)胞數(shù),還能使小鼠脾臟抗體分泌細(xì)胞數(shù)明顯增多。表明茯苓多糖具有抗胸腺萎縮及抗脾臟增大和抑瘤生長的功能。⑤澤瀉水煎劑能顯著抑制小鼠碳粒廓清速度，還有降血糖、抗脂肪肝、抑制血液凝固、降血脂等作用。⑥附子注射液可提高小鼠體液免疫功能及豚鼠血清補(bǔ)體含量，但對(duì)小鼠血清溶菌酶活性無明顯影響；以玫瑰花結(jié)形及細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)研究了機(jī)體細(xì)胞免疫的影響，發(fā)現(xiàn)附子注射液可使T細(xì)胞和玫瑰花結(jié)形的形成細(xì)胞明顯上升。⑦用體內(nèi)、外的方法，發(fā)現(xiàn)牛膝多糖在體外可以提高老年小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖能力和IL-2的分泌；體內(nèi)能顯著提高老年大鼠T淋巴細(xì)胞和血清中TNF-β或INF-a及NO的產(chǎn)生和NOS的活性,降低其SIL-2R的產(chǎn)生。

抗炎保肝：①實(shí)驗(yàn)研究證明牡丹皮總甙對(duì)卡介苗與脂多糖聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫性肝損傷有保肝作用。②懷牛膝水提物對(duì)CCL4引起的小鼠SGPT升高有明顯降低作用，能促進(jìn)正常小鼠肝糖元生成。③桂皮油不僅能促進(jìn)唾液及胃液分泌,增強(qiáng)消化功能,并能解除內(nèi)臟平滑肌痙攣、緩解腸道痙攣性疼痛。應(yīng)用小鼠壓尾刺激或腹腔注射醋酸的扭體運(yùn)動(dòng)的方法證明桂皮醛有鎮(zhèn)痛的作用，此外，還有抗菌、抗?jié)?、抗腫瘤等藥理作用。④車前子煎液能明顯降低皮膚及腹腔毛細(xì)血管的通透性,降低紅細(xì)胞膜的通透性,表明車前子具有一定的抗炎作用。⑤現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)其主要成分有三七總皂苷（PNS）、三七素（三七氨酸）、黃酮、揮發(fā)油、氨基酸、糖類及各種微量元素等。相關(guān)研究表明，三七還具有抗肝損傷作用。PNS對(duì)CCl4肝損傷小鼠可顯著降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶，也能明顯改善酒精引起的肝組織的脂肪變和炎癥程度，減輕肝組織損傷，其具有抗肝纖維化的作用，可使二甲基亞硝胺中毒大鼠肝細(xì)胞變性壞死減少，肝細(xì)胞間膠原纖維減少。⑥現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，鱉甲及其復(fù)方制劑廣泛應(yīng)用于治療慢性肝病預(yù)防肝硬化。文獻(xiàn)報(bào)道，鱉甲煎煮液能有效地預(yù)防和治療大鼠肝纖維化，其作用機(jī)制可能是通過抗脂質(zhì)過氧化改善肝組織病理改善肝功能調(diào)控細(xì)胞因子水平等而發(fā)揮抑制HSC激活增殖及ECM合成分泌促進(jìn)ECM降解吸收等綜合作用，阻斷和治療肝纖維化。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：

本抗肝纖維的中成藥是根據(jù)肝病多具有發(fā)于外感濕熱疫毒、內(nèi)傷氣血陰陽，久則必夾瘀夾痰夾濕的病因病機(jī)的特點(diǎn)，而肝病患者在其既往的慢性疾病基礎(chǔ)，其病機(jī)已是正氣虧虛，故而表現(xiàn)多為寒熱虛實(shí)錯(cuò)雜之陽虛夾瘀的病機(jī)特點(diǎn)，確定了以溫陽化瘀為法的抗肝纖維化的中成藥的藥物組成，使得該抗肝纖維化中成藥具有溫陽利濕、化瘀散結(jié)的作用。

本抗肝纖維的中成藥以小劑溫陽藥置于十倍之滋陰利水劑之中，恰似坎卦一陽爻藏于兩陰爻之中，取象于火涵水中，藏而不露。又以山藥厚其土以藏之，山茱萸斂其氣以秘之，澤瀉、丹皮、茯苓引亢火以歸之，車前子、牛膝以消陰翳。如此則腎復(fù)其封蟄之職，水中之火，不亢不衰，緩緩蒸騰，溫養(yǎng)五臟六腑，而不蓄水。充分體現(xiàn)了水火既濟(jì)之象，在溫補(bǔ)腎陽的同時(shí)兼起到化濕之功效。同時(shí)加入鱉甲以平旰熄風(fēng)、軟堅(jiān)散結(jié)及小劑量三七活血化瘀、血行氣行。以上藥物制成中成藥，具有溫陽利濕、化瘀散結(jié)之功效，從而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明各組大鼠肝組織HE染色鏡下表現(xiàn)（HE染色×200）圖（空白對(duì)照組）。

圖2是本發(fā)明各組大鼠肝組織HE染色鏡下表現(xiàn)（HE染色×200）圖（模型組）。

圖3是本發(fā)明各組大鼠肝組織HE染色鏡下表現(xiàn)（HE染色×200）圖（抗肝纖維化的中成藥低劑量組）。

圖4是本發(fā)明各組大鼠肝組織HE染色鏡下表現(xiàn)（HE染色×200）圖（抗肝纖維化的中成藥高劑量組）。

圖5是各組大鼠肝組織中Akt1表達(dá)情況（免疫組化×400）圖（空白組Akt）。

圖6是各組大鼠肝組織中Akt1表達(dá)情況（免疫組化×400）圖（模型組Akt1）。

圖7是各組大鼠肝組織中Akt1表達(dá)情況（免疫組化×400）圖（抗肝纖維化的中成藥低劑量組Akt1）。

圖8是各組大鼠肝組織中Akt1表達(dá)情況（免疫組化×400）圖（抗肝纖維化的中成藥高劑量組Akt1）。

圖9是各組大鼠肝組織中Akt1表達(dá)情況（免疫組化×400）圖（空白組p-Akt1）。

圖10是各組大鼠肝組織中Akt1表達(dá)情況（免疫組化×400）圖（模型組p-Akt1）。

圖11是各組大鼠肝組織中Akt1表達(dá)情況（免疫組化×400）圖（抗肝纖維化的中成藥低劑量組p-Akt1）。

圖12是各組大鼠肝組織中Akt1表達(dá)情況（免疫組化×400）圖（抗肝纖維化的中成藥高劑量組p-Akt1）。

圖13是各組大鼠肝組織中HSC凋亡情況（TUNEL法×400）圖（空白對(duì)照組）。

圖14是各組大鼠肝組織中HSC凋亡情況（TUNEL法×400）圖（模型對(duì)照組）。

圖15是各組大鼠肝組織中HSC凋亡情況（TUNEL法×400）圖（抗肝纖維化的中成藥低劑量組Akt1）。

圖16是各組大鼠肝組織中HSC凋亡情況（TUNEL法×400）圖（抗肝纖維化的中成藥高劑量組Akt1）。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實(shí)施例限定。以下所有配比量都以重量百分比計(jì)算。

一、具體實(shí)施例部分

實(shí)施例1：

本實(shí)施例的中成藥采用如下質(zhì)量的組分制成：熟地黃80g、山茱萸40g、山藥40g、澤瀉30g、茯苓30g、丹皮30g、肉桂10g、附子10g、車前子20g、牛膝20g、鱉甲25g，三七3g。

制作方法為：將以上組分的藥物加水煎煮，收集提取液，將提取液過濾、濃縮，得到濃縮液，將該濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，得到干浸膏，再把干浸膏粉碎，得到浸膏粉，再添加一些常用輔料制粒。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例的中成藥采用如下質(zhì)量的組分制成：熟地黃85g、山茱萸35g、山藥35g、澤瀉35g、茯苓35g、丹皮35g、肉桂15g、附子15g、車前子25g、牛膝25g、鱉甲30g、三七5g。

其制作方法與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例的中成藥采用如下質(zhì)量的組分制成：

熟地黃60g、山茱萸20g、山藥20g、澤瀉20g、茯苓20g、丹皮20g、肉桂5g、附子5g、車前子10g、牛膝10g、鱉甲12g、三七2g。

其制作方法與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例的中成藥采用如下質(zhì)量的組分制成：

熟地黃100g、山茱萸60g、山藥50g、澤瀉50g、茯苓60g、丹皮50g、肉桂20g、附子25g、車前子40g、牛膝50g、鱉甲40g、三七5g；

其制作方法與實(shí)施例1相同。

二、實(shí)驗(yàn)部分：

1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.1實(shí)驗(yàn)材料

SD雌性大鼠50只，體重(250±50)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在有通風(fēng)條件的動(dòng)物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)，分籠喂養(yǎng)，室內(nèi)濕度維持在(60土10)%，室溫維持在(25.0±1.0)℃，以普通大顆粒飼料為食物和自來水為飲用水，每周2次更換鼠籠內(nèi)墊料，每日加食1次，換水1次。實(shí)驗(yàn)正式開始前，適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠1周。

1.2藥物制備

抗肝纖維化的中成藥藥液的配制：高劑量的配制：取實(shí)施例1所得顆粒，加純凈水溶解，配成0.254g/mL的藥液，即大鼠給藥量0.508ml/100g。低劑量的配制：取實(shí)施例1所得顆粒，加純凈水稀釋成0.06g/mL的藥液，即大鼠給藥量0.12ml/100g。配置好的中藥液體，放在4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫辔盖疤崆叭〕鏊幰?，加熱至常溫后使用?/p>

1.3主要試劑

四氯化碳(CCL4)分析純，由汕頭光華試劑廠生產(chǎn)?；ㄉ?，為金龍魚牌食用花生油。按照花生油與四氯化碳容積比6:4配制成40%的CCL4花生油混合液備用?？偰懠t素（TBIL）、白蛋白（ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測(cè)試劑盒、透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C) 、Ⅲ型前膠原( PCⅢ)酶聯(lián)試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供；兔抗大鼠多克隆Akt1及p-Akt1抗體購自美國Santa Cruz公司；免疫組織化學(xué)SABC試劑盒、DAB顯色劑及TUNEL檢測(cè)試劑盒均購自武漢博士德公司；丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉、過硫酸銨、甘氨酸均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；PVDF膜及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模

第一步：將50只雌性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠1周后，隨機(jī)分為兩組，即空白組與模型組：模型組40只大鼠，首次劑量以劑量為0.5mL/100g體質(zhì)量，腹腔注射40%CCL4花生油溶液誘導(dǎo)肝纖維化模型，以后劑量為0.3mL/100g體質(zhì)量, 每隔3d腹腔注射1次；空白組10只大鼠，予腹腔注射等量花生油溶液。所有大鼠均以普通飼料喂養(yǎng)及自由飲水，共造模6周。第二步：在造模的過程中，模型組共死亡1只大鼠。造模第4周末開始，每周隨機(jī)從由CCL4花生油溶液誘導(dǎo)而成的肝纖維化模型大鼠中處死1只，于光鏡下觀察肝臟的病理學(xué)改變，第6周證實(shí)肝纖維化大鼠模型造模成功，第7周開始對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃給藥。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥方法

除了空白組10只外，剩余的36只大鼠，隨機(jī)分為3組，模型對(duì)照組12只，抗肝纖維化的中成藥高劑量組12只，抗肝纖維化的中成藥低劑量組12只。造模后空白對(duì)照組與模型組、抗肝纖維化的中成藥高劑量組、抗肝纖維化的中成藥低劑量組均予標(biāo)準(zhǔn)大鼠基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。按《動(dòng)物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)表》計(jì)算出大鼠模型實(shí)驗(yàn)所需用藥劑量：空白對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服純凈水；中藥高劑量組灌服抗肝纖維化的中成藥0.508ml /100g；中藥低劑量組灌服抗肝纖維化的中成藥0.12ml /100g。各組于造模成功后第7周開始灌胃給藥，每天1次，至12周末結(jié)束。為了防止肝臟自然修復(fù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，除空白組外，其他3組于造模結(jié)束后仍每周1次腹腔注射40%CCL4花生油溶液，劑量為0.3mL/100g體質(zhì)量。

1.4.3 標(biāo)本提取

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在第12周末末次給藥后禁食過夜，次日稱重后各組大鼠以10%水合氯醛，按0.4~0.5ml/100g的劑量腹腔注射進(jìn)行麻醉，由腹正中線切皮，進(jìn)入腹腔，分離腹主動(dòng)脈，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，靜置半小時(shí)后以3000r/min離心10min，收集血清，置于-80℃冰箱儲(chǔ)存待測(cè)。在充分暴露游離肝臟后，迅速剪取同一部位適量的肝組織以預(yù)冷的生理鹽水灌洗后放入4%多聚甲醛中固定，48h后，轉(zhuǎn)移到0.1mol/L PBS溶液中保存，余下肝臟迅速分裝入凍存管，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 血清學(xué)指標(biāo)

全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、白蛋白（ALB）及放射免疫法檢測(cè)血清透明質(zhì)酸（HA）、 型前膠原（PC-）、型膠原（-C）和層粘連蛋白（LN），嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.5.2肝組織HE染色

HE染色步驟如下：切取部分肝臟姐織，將組織塊切成約2mm的厚度，放入4%中性多聚甲醛溶液中固定，放在4℃冰箱過夜，進(jìn)行脫水、透明，石蠟包埋。切成約5um的常規(guī)厚度，用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)酒精逐級(jí)脫水，二甲苯5min×2次，逐層酒精復(fù)水：100%酒精2min→95%酒精2min→80%酒精2min→75%酒精2min→50%酒精1min→30%酒精1min。用蒸餾水沖洗約1min，蘇木素染色5min，自來水沖洗約1min，鹽酸酒精分化30s，自來水浸泡5min，放于伊紅液中約2min。最后常規(guī)脫水、透明，用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察。

1.5.3肝組織免疫組織化學(xué)檢測(cè)

切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，微波修復(fù)抗原，加封閉液后，滴加兔抗大鼠Akt1及p-Akt1多克隆抗體(工作濃度為1:100)，4℃過夜。次日加生物素化羊抗兔IgG，在37℃孵育30min，加SABC工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照以PBS緩沖液代替一抗。隨機(jī)抽取5個(gè)高倍鏡下視野，觀察Akt1及p-Akt1陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.5.4Western blot檢測(cè)肝組織中Akt1及p-Akt1表達(dá)情況

提取肝組織總蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后，采用半干電轉(zhuǎn)移將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，電轉(zhuǎn)移結(jié)束后PVDF膜置于封閉緩沖液中室溫下封閉1h。封閉完成后洗膜緩沖液洗膜3次，然后將PVDF膜與一抗稀釋液(1:500)4℃封閉過夜。次日早上用洗膜緩沖液洗膜3次后，PVDF膜與二抗稀釋液(1：1000)在室溫下孵育1h，洗膜緩沖液洗膜3次后加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑A、B液各0.5mL，室溫反應(yīng)1min后暗室中將PVDF膜迅速封入保鮮膜中，Kodak X-ray film壓片，放射自顯影1min。然后進(jìn)行顯影、定影，清水沖洗晾干。

1.5.5TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

胞質(zhì)棕黃色的細(xì)胞為HSC，凋亡的HSC為胞質(zhì)、胞核均呈棕黃色的梭型細(xì)胞。隨機(jī)取5個(gè)不同高倍視野觀察，計(jì)數(shù)胞質(zhì)為棕黃色的HSC的數(shù)量和胞質(zhì)、胞核均呈棕黃色的梭型凋亡細(xì)胞的數(shù)量，并計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比，取5個(gè)視野的平均數(shù)作為凋亡指數(shù)，即：凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/HSC數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS18.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間治療前后比較用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行分析，不同組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

1.7.1大鼠一般情況

造模期間，空白對(duì)照組的大鼠進(jìn)食飲水正常，體重稍有增加，毛發(fā)光澤，活動(dòng)自如及反應(yīng)靈敏。相比之下，模型組大鼠造模三天后便逐漸出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)及攝食均較前減少，表現(xiàn)為嗜睡或情緒易怒，毛發(fā)變黃，色澤暗淡，體重增長緩慢。造模過程中，有1只模型組大鼠死亡，原因考慮為CCl4腹腔注射的部位不當(dāng)或注射角度過深導(dǎo)致腹腔組織的潰破誘發(fā)感染。在確認(rèn)造模成功后，開始分組實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過程中，有6只大鼠死亡，分別為模型對(duì)照組2只大鼠因腹水死亡，抗肝纖維化的中成藥低劑量組死亡2只，抗肝纖維化的中成藥高劑量組死亡2只，其余大鼠未出現(xiàn)死亡。原因考慮為灌胃不當(dāng)而損傷氣管或肝損傷出現(xiàn)急性進(jìn)展等原因。在灌胃治療3周后，上述癥狀有所減輕，抗肝纖維化的中成藥高劑量組及抗肝纖維化的中成藥低劑量組的納差、嗜睡、易怒等表現(xiàn)有所好轉(zhuǎn)。模型組大鼠的上述癥狀并未減輕。而在灌胃治療6周后，抗肝纖維化的中成藥高劑量組大鼠的狀態(tài)明顯優(yōu)于其它各組。

1.7.2肉眼觀察大鼠肝臟變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠解剖，肉眼觀察其肝臟形態(tài)發(fā)現(xiàn)：空白對(duì)照組大鼠肝臟呈深紅色，肝臟表面光滑無斑點(diǎn)，全肝邊緣銳圓，質(zhì)地柔軟；模型對(duì)照組大鼠的肝臟呈現(xiàn)暗紅，體積較大，全肝邊緣鈍圓，肝臟表面有黃色斑點(diǎn)隆起的現(xiàn)象，質(zhì)地稍實(shí)；抗肝纖維化的中成藥高劑量組和抗肝纖維化的中成藥低劑量組大鼠肝臟色澤深紅，肝臟體積較空白對(duì)照組稍大，有一小部分大鼠肝臟表面有斑點(diǎn)隆起，全肝邊緣純圓，但模型組表現(xiàn)較明顯。

1.7.3HE染色

(1)空白對(duì)照組：肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊并且圍繞中央靜脈，呈條索狀向四周放射排列，肝細(xì)胞多為單核且未見脂肪變性、壞死，肝細(xì)胞正常且無炎細(xì)胞浸潤。

(2)模型對(duì)照組：肝小葉正常的結(jié)構(gòu)被破壞甚至消失，肝細(xì)胞腫脹變性，不再表現(xiàn)為條索狀排列，取而代之為排列紊亂，表現(xiàn)為點(diǎn)狀或灶狀壞死。部分小葉內(nèi)的壞死灶融合成一片或者發(fā)生橋接壞死，炎性細(xì)胞或成纖維細(xì)胞可出現(xiàn)在壞死灶內(nèi)。肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織明顯增生，此時(shí)將肝小葉包繞成為大小不等的肝細(xì)胞團(tuán)而形成假小葉。

(3)抗肝纖維化的中成藥高劑量組：肝小葉結(jié)構(gòu)破壞較模型組明顯減輕，肝竇雖有輕度擴(kuò)張，但結(jié)構(gòu)較正常，肝細(xì)胞的脂肪變性壞死、匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生及炎性細(xì)胞浸潤較模型組明顯減少，假小葉形成也明顯減少。

(4) 抗肝纖維化的中成藥低劑量組：肝臟的病理變化介于模型組與抗肝纖維化的中成藥高劑量組之間。

各組大鼠肝組織HE染色鏡下表現(xiàn)（HE染色×200），如圖1-圖4所示。

1.7.4血清學(xué)指標(biāo)

1.7.4.1抗肝纖維化的中成藥對(duì)肝纖維化大鼠血清ALB、ALT、AST的影響，見表1。

表1： 抗肝纖維化的中成藥對(duì)肝纖維化大鼠血清ALB、ALT、AST的影響

注：模型組與空白組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（★P＜0.05）；抗肝纖維化的中成藥高劑量組、抗肝纖維化的中成藥低劑量組分別與模型組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（△P＜0.05）；抗肝纖維化的中成藥高劑量組與抗肝纖維化的中成藥低劑量組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（▲P＜0.05）。

1.7.4.2抗肝纖維化的中成藥對(duì)肝纖維化大鼠血清HA、PC-、-C、LN的影響，見表2。

表2 ：抗肝纖維化的中成藥對(duì)肝纖維化大鼠血清HA、PC-、-C、LN的影響

注：模型組與空白組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（★P＜0.05）；抗肝纖維化的中成藥高劑量組、抗肝纖維化的中成藥低劑量組分別與模型組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（△P＜0.05）；抗肝纖維化的中成藥高劑量組與抗肝纖維化的中成藥低劑量組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（▲P＜0.05）。

1.7.5免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠肝組織中Akt1、磷酸化Akt1(p-Akt1)蛋白表達(dá)情況，見表3。

表3：免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠肝組織中Akt1、p-Akt1蛋白表達(dá)情況

注：模型組與空白組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（★P＜0.05）；抗肝纖維化的中成藥低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；抗肝纖維化的中成藥高劑量組分別與模型組、抗肝纖維化的中成藥低劑量組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（△P＜0.05）。

各組大鼠肝組織中Akt1、p-Akt1表達(dá)情況（免疫組化×400），如圖圖5-圖12所示。

1.7.6Western blot檢測(cè)各組大鼠肝組織中Akt1、磷酸化Akt1(p-Akt1)蛋白表達(dá)情況 ，見表4。

表4： Western blot檢測(cè)各組大鼠肝組織中Akt1、p-Akt1蛋白表達(dá)情況

注：模型組與空白組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（★P＜0.05）；抗肝纖維化的中成藥低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；抗肝纖維化的中成藥高劑量組分別與模型組、抗肝纖維化的中成藥低劑量組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（△P＜0.05）。

1.7.7TUNEL法檢測(cè)各組大鼠肝組織中肝星狀細(xì)胞(HSC)凋亡情況，見表5。

表5：TUNEL法檢測(cè)各組大鼠肝組織中HSC凋亡情況

注：模型組與空白組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；抗肝纖維化的中成藥高劑量組、抗肝纖維化的中成藥低劑量組分別與模型組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（△P＜0.05）；抗肝纖維化的中成藥高劑量組與抗肝纖維化的中成藥低劑量組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（▲P＜0.05）。

各組大鼠肝組織中HSC凋亡情況（TUNEL法×400），如圖13-圖16所示。

1.8實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)研究利用CCL4花生油溶液誘導(dǎo)而成的肝纖維化模型大鼠來觀察抗肝纖維化的中成藥的抗纖維化機(jī)制，主要通過觀察大鼠的血清學(xué)改變、PI3K/AKT信號(hào)通路下游的Akt1及p-Akt1蛋白表達(dá)情況及HSC細(xì)胞凋亡情況這幾種方式來實(shí)現(xiàn)。研究結(jié)果表明：經(jīng)過抗肝纖維化的中成藥灌胃干預(yù)的肝纖維化大鼠在肝功能、肝纖四項(xiàng)的恢復(fù)、抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活來降低HSC的增殖及加速HSC的凋亡等方面均較模型組顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過實(shí)驗(yàn)研究來觀察抗肝纖維化的中成藥對(duì)肝纖維大鼠PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，揭示了抗肝纖維化的中成藥的抗纖維化機(jī)制所在，為指導(dǎo)臨床運(yùn)用提供了理論依據(jù)。

、臨床病例觀察

病例1：“韋×，男，56歲，廣西柳城縣人，乙肝病史10年，癥狀脅部脹滿不適3年，腹部稍脹滿不適，口苦，咽干，大便干結(jié)難解，3-5天1行，舌紅，苔黃膩，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院門診間斷就診，3年前規(guī)律口服“恩替卡韋分散片”0.5mg qd，1年前腹部B超檢查提示：肝彌漫性病變，考慮早期肝硬化。其后在原有“恩替卡韋分散片”治療基礎(chǔ)上加服該“抗肝纖維化的中成藥”治療，治療3個(gè)月，上述癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，1年后復(fù)查腹部B超提示肝膽脾胰未見明顯異常。

病例2：“黃×，女，26歲，廣西桂林人，病歷4年，癥狀脅部脹痛不適，伴胃脘部灼熱感，口干口苦，舌紅，苔黃厚。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院門診間斷就診，1年前到我院門診就診，查肝功能正常，乙肝五項(xiàng)提示小三陽，HBV-DNA 2.95E3copy/ml，腹部B超無異常。暫不予抗病毒藥物治療，予該“抗肝纖維化的中成藥”治療，規(guī)律服用1個(gè)月后患者癥狀逐漸減輕，服用6個(gè)月后上述不適癥狀基本消失，復(fù)查肝功能正常，乙肝五項(xiàng)提示小三陽，HBV-DNA＜1.0E2copy/ml，腹部B超無異常。

病例3：“高×，男，38歲，廣西三江縣人，病歷10年，癥狀右脅部脹痛不適10年，伴胃脘部脹滿不適，口苦，咽干，大便干結(jié)難解，2天1行，舌紅，苔黃膩，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院間斷就診（具體用藥不詳），癥狀未見緩解。2年前到我院門診就診，查肝功能：ALT 60U/L，AST 50U/L；乙肝五項(xiàng)提示小三陽，HBV-DNA 3.95E2copy/ml，肝纖四項(xiàng)：HA 104.90ng/ml，LN 108.20ng/ml，PC-III 20.87ug/ml，IV-C 60.27ng/ml。腹部B超提示肝臟表面實(shí)質(zhì)光點(diǎn)增粗。遂后于門診規(guī)律服用該“抗肝纖維化的中成藥”治療，治療3個(gè)月后上述不適癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，6個(gè)月后基本消失，復(fù)查肝功能、肝纖四項(xiàng)均無明顯異常，乙肝五項(xiàng)提示小三陽，HBV-DNA ＜1.0E2copy/ml，腹部B超肝膽脾胰未見明顯異常。

病例4：“陳×，男，56歲，廣西融水人，病歷20年，15年前因乙肝肝硬化開始服用拉米夫定片抗病毒治療，1年前查腹部B超提示肝硬化聲像，脾臟稍大，膽胰未見異常。肝臟彈性測(cè)定示肝臟彈性值23.5，遂后開始規(guī)律服用該“抗肝纖維化的中成藥”治療，1年后復(fù)查腹部B超提示肝硬化聲像，膽脾胰未見異常。肝臟瞬時(shí)彈性成像硬度值16.5KPa。