本發(fā)明涉及一種修飾的磁性納米顆粒Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX NPs的制備，以及其在抗腫瘤光熱治療中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一。在我國，結(jié)腸癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。目前，臨床針對結(jié)腸癌的治療主要以手術(shù)治療為主，輔以放射治療、中醫(yī)中藥治療和化學(xué)治療。手術(shù)切除腫瘤組織雖然是一種有效的治療手段，但是如果切除腫瘤組織范圍不足則會導(dǎo)致手術(shù)切緣處的腫瘤細(xì)胞有殘留，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。而化學(xué)療法是目前臨床治療結(jié)腸癌及預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的最重要的輔助治療手段，其對各期結(jié)腸癌均有著重要及積極治療作用。

近年來，光熱治療(Photothermal therapy,PTT)因其安全有效而逐漸成為繼手術(shù)、放療、化療后的又一種腫瘤治療手段。光熱治療腫瘤是通過將光能轉(zhuǎn)化為熱能，加熱腫瘤部位使溫度達到臨界治療溫度并維持一段時間，從而殺死腫瘤細(xì)胞，達到治療腫瘤的目的。借助于納米顆粒的腫瘤光熱治療作為一種非介入性物理治療方法，可以做到精確定位于腫瘤細(xì)胞及靶向加熱治療，因此具有高效、精確、微創(chuàng)的優(yōu)點。

磁性Fe₃O₄納米顆粒由于其生物相容性好，被認(rèn)為是很有潛力的納米粒子，對其進行合適的表面修飾，磁性Fe₃O₄納米粒子可以分散在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，得到均相溶液，也叫磁流體。這種溶液在與外部磁場作用時會移動到指定的部位，能夠進行磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)，同時不會對身體造成任何傷害，從而用于磁共振成像指導(dǎo)下的醫(yī)療診斷和輔助癌癥治療。目前臨床上常用的磁共振成像造影劑為二乙烯五胺乙酸釓。雖然其信號比較強，但是進入體內(nèi)后，由于循環(huán)時間很短，釓劑在不同組織之間的分布差異不明顯，從而造成成像結(jié)果不顯著。相比之下，超順磁性的Fe₃O₄納米顆粒能夠在腫瘤部位富集，使得圖像清晰，同時具有較長的代謝時間，可以進行長期監(jiān)控，因此近年來獲得了廣泛的關(guān)注。

可用于腫瘤光熱治療的材料要具有較高的近紅外光熱轉(zhuǎn)換效率和較好的生物相容性。近年來人們發(fā)現(xiàn)了許多優(yōu)異的光熱材料，無機納米材料如金棒、金顆粒，鉑納米顆粒，碳納米材料如碳管、石墨烯等，還有一些有機高分子如聚吡咯(Polypyrrole,PPY)，聚多巴胺(Polydopamine,PDA)等。聚多巴胺(PDA)納米顆粒在近紅外光處具有較強的光吸收和優(yōu)越的光熱效應(yīng)，同時PDA納米顆粒還具有良好的生物相容性，這使得它在生物體內(nèi)被廣泛應(yīng)用于酶、抗體、核酸以及藥物的載體等。聚多巴胺的合成方法簡單，能夠通過無毒的多巴胺單體直接聚合而成。

阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一種從鏈霉菌中分離出來的蒽環(huán)類抗生素，是目前最有效的廣譜抗腫瘤藥物之一，為周期非特異性藥物，對各種生長周期的細(xì)胞都有殺傷作用。而惡性腫瘤細(xì)胞因其大部分細(xì)胞均處于增殖周期中，故DOX被廣泛應(yīng)用于治療各種惡性腫瘤。阿霉素可以通過自由擴散進入細(xì)胞核，嵌入機體的DNA并與之緊密結(jié)合形成復(fù)合物，阻止DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞停滯于G2/M期，從而達到殺死腫瘤細(xì)胞的目的，但同時對正常細(xì)胞也具有很強的細(xì)胞毒性。由于阿霉素毒性大、水溶性較差、在體內(nèi)的分布無選擇性等缺陷，使其進入體內(nèi)后對正常組織產(chǎn)生十分嚴(yán)重的毒副作用，臨床上常見惡心、嘔吐、脫發(fā)、腎毒性、心臟毒性、骨髓抑制反應(yīng)等不良反應(yīng)。同時，長期使用阿霉素，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對其產(chǎn)生耐藥性，從而需要加大劑量，而化療藥物的劑量增大，也加重了藥物的毒副作用，這些都限制了阿霉素在腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用，成為臨床腫瘤化學(xué)治療中的棘手問題。因此如何提高阿霉素等化療藥物在腫瘤局部的濃度、減少藥物在正常組織和器官中的分布、增強治療效果的同時并降低其毒副作用成為當(dāng)前腫瘤化學(xué)治療亟待解決的問題。近年來，新型納米材料因具有多種性能和優(yōu)勢，被廣泛用于腫瘤治療領(lǐng)域，為解決常規(guī)化療藥物普遍面臨的問題提供了一種新的方法。

關(guān)于Fe₃O₄納米顆粒的MRI功能和聚多巴胺(PDA)的光熱功能分別有研究報道，但是目前關(guān)于Fe₃O₄@PDA具有腫瘤靶向能力特別是結(jié)腸癌靶向的研究較為少見。通過針對腫瘤的靶向治療能夠特異、高效地殺傷腫瘤細(xì)胞，從而降低化療藥物及納米材料對腫瘤周圍正常組織細(xì)胞的毒副作用，因此靶向治療技術(shù)具有非常大的應(yīng)用優(yōu)勢。同時表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一種在結(jié)腸癌組織中高表達的一個特異性靶點。

經(jīng)查找相關(guān)專利和文獻發(fā)現(xiàn)，目前還未見采用共價偶聯(lián)的方法將EGFR抗體連接到Fe₃O₄@PDA納米顆粒表面同時非共價結(jié)合阿霉素得到Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX納米顆粒用于結(jié)腸癌特異靶向的磁共振成像和光熱治療的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種靶向修飾的負(fù)載阿霉素的磁性納米顆粒及制備方法及應(yīng)用，以解決Fe₃O₄@PDA納米顆粒在應(yīng)用于結(jié)腸癌的磁共振成像和光熱治療時沒有特異靶向性的問題，提供一種將EGFR抗體作為靶向基團，合成出能夠特異靶向結(jié)腸癌細(xì)胞、并具有磁共振成像、光熱治療及化療多功能的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用，并在細(xì)胞和動物水平研究其納米生物學(xué)效應(yīng)，以期為結(jié)腸癌的診斷與治療做出貢獻。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種靶向修飾的負(fù)載阿霉素的磁性納米顆粒(Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX)，由多巴胺(PDA)作為外殼包裹形成的磁性Fe₃O₄納米顆粒作為核心，和在其表面通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)共價偶聯(lián)的EGFR抗體,以及通過非共價結(jié)合到納米顆粒表面的阿霉素(DOX)構(gòu)成。

本發(fā)明所述靶向修飾的負(fù)載阿霉素的磁性納米顆粒為球形結(jié)構(gòu)，粒徑為95～105nm。

一種靶向修飾的負(fù)載阿霉素的磁性納米顆粒(Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX)的制備方法，包括下列步驟：

(1)將2mmol的FeCl₃溶解在4mL乙二醇和16mL一羧二乙二醇的混合溶液中，攪拌0.5-1h后，在上述溶液中加入2g的聚乙烯吡咯烷酮，將溶液加熱到120℃得到透明的黃色溶液，1-2h后，停止加熱并加入1.5g乙酸鈉，繼續(xù)攪拌0.5-1h，將溶液轉(zhuǎn)移到25mL的反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜密封并加熱到200℃，繼續(xù)反應(yīng)12-16h后，停止加熱并將反應(yīng)釜冷卻至室溫，得到的Fe₃O₄納米簇用乙醇和水各洗3遍，Tris緩沖液溶解；

(2)將步驟(1)所制的含F(xiàn)e₃O₄納米簇的Tris緩沖液調(diào)節(jié)pH至8.5，緩慢加入0.03M多巴胺溶液，在室溫下反應(yīng)3-6h直至顏色變黑，離心、去離子水洗滌2-3次，取沉淀物50-60℃真空干燥得到多巴胺包裹的Fe₃O₄@PDA納米粒子；

(3)取10mg步驟(2)制備的Fe₃O₄@PDA納米粒子及30-60mg NH₂-PEG-COOH溶于50-100mL，0.01M,pH 8.1，Tris緩沖液中，劇烈震搖12-24h，離心、去離子水洗滌2-3次，取沉淀物50-60℃真空干燥得到PEG偶聯(lián)的Fe₃O₄@PDA-PEG納米粒子；

(4)用PBS緩沖液溶解步驟(3)所得到的Fe₃O₄@PDA-PEG納米粒子使納米粒子濃度為1mg/mL，并調(diào)節(jié)pH為5.0，向此溶液中加入5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和12.5mmol的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)，室溫震蕩0.5-1h；在反應(yīng)體系中加入EGFR抗體使抗體終濃度為50ug/mL，混合均勻并調(diào)節(jié)pH至7.0-7.5，室溫振蕩反應(yīng)4-12h，反應(yīng)結(jié)束后用PBS緩沖液離心洗滌2-3次，得到所述EGFR抗體修飾的納米顆粒Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR，得到的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR納米顆?？杉尤隤BS緩沖液溶解后置于4℃冰箱內(nèi)保存待用；

(5)取1mg上述步驟(4)制備的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR溶解于0.5-1mL 10×Tris緩沖液中與2mL DOX溶液1mg/mL混合，避光震搖12-24h后離心、去離子水洗滌2-3次，得到Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX納米粒子。

本發(fā)明所述的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX納米顆粒在制備結(jié)腸癌靶向的光熱治療劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR納米顆粒核心是多巴胺包裹的磁性Fe₃O₄，其表面具有大量的羥基和氨基基團，通過EDC/NHS共價偶聯(lián)的方法，將EGFR抗體連接到多巴胺表面，賦予了納米顆粒通過抗體-受體識別作用從而具有了特異靶向到結(jié)腸癌細(xì)胞的功能。多巴胺帶正電荷，阿霉素帶負(fù)電荷，通過π-π堆疊能夠?qū)⒚顾匕诙喟桶返谋砻?。這些修飾作用不會改變磁性Fe₃O₄@PDA納米顆粒的MRI成像和光熱轉(zhuǎn)換功能。

研究發(fā)現(xiàn)，粒徑介于20-150nm之間的納米顆粒能夠更容易通過增強滲透滯留效應(yīng)(Enhanced permeability and retention effect,EPR)和有效避開網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除作用而從血管中溢出進入腫瘤微環(huán)境，從而有效地避免被機體清除及更有效地到達靶向組織。制備的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX納米顆粒具有合適的納米尺寸，因此在機體的代謝過程中，更易在靶組織區(qū)域進行輸送和吸收。

本發(fā)明Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX納米顆粒靶向診療制劑可通過全身遞送(靜脈注射)，動脈內(nèi)，腫瘤內(nèi)，局部給藥等遞送形式進入體內(nèi)?？梢砸罁?jù)結(jié)腸癌細(xì)胞類型及結(jié)腸癌患者的醫(yī)學(xué)狀況，以各種不同形式的單位劑量進行給藥。此外，用藥方案的制定還需考慮到結(jié)腸癌細(xì)胞類型、組織或腫瘤是分散還是局部、患者健康程度及年齡等因素。通過參照其他相關(guān)診療制劑的用藥方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明藥物的最佳有效劑量及濃度。

本發(fā)明Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX納米顆粒對結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1具有良好的靶向識別能力，能有效的進入DLD-1細(xì)胞內(nèi)部；同時對DLD-1細(xì)胞具有優(yōu)異的光熱殺傷功能，能夠用于結(jié)腸癌細(xì)胞的光熱治療及藥物化療；并具有良好的磁共振成像功能。

附圖說明

圖1是透射電子顯微鏡下觀察Fe₃O₄@PDA納米顆粒的表觀性狀及粒徑，可見大多數(shù)合成材料粒徑在30nm左右；

圖2是Fe₃O₄@PDA及Fe₃O₄@PDA-PEG納米顆粒的紅外光譜圖，F(xiàn)e₃O₄@PDA-PEG在3393cm^-1(O-H伸縮鍵)及1109cm^-1(C-O-C伸縮鍵)處有吸收峰，證明NH₂-PEG-COOH成功連接到Fe₃O₄@PDA納米顆粒表面；。

圖3是Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR納米顆粒的SDS-PAGE圖，其中泳道1為EGFR抗體；泳道2,3為偶聯(lián)EGFR抗體后的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR納米顆粒；泳道5為Fe₃O₄@PDA-PEG納米顆粒，F(xiàn)e₃O₄@PDA-PEG-EGFR納米顆粒與EGFR抗體在相同位置有電泳條帶證明成功偶聯(lián)EGFR抗體到Fe₃O₄@PDA-PEG納米顆粒表面；

圖4是Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR樣品溶液的T₂核磁共振加權(quán)圖像，隨著納米顆粒濃度增加，成像逐漸加深，下部為相應(yīng)的曲線圖；

圖5是Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR樣品溶液的體外升溫曲線圖及光熱穩(wěn)定性能圖；

圖中：A為不同濃度的材料體外升溫曲線圖，在 6min內(nèi)隨著Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR濃度的增加，溫度升高明顯，當(dāng)材料濃度達到150ug/mL時，在6min內(nèi)溶液溫度可達到50℃；

圖中：B為材料的光熱穩(wěn)定性能圖，經(jīng)過5輪光熱，F(xiàn)e₃O₄@PDA-PEG-EGFR納米顆粒的光熱轉(zhuǎn)換能力沒有任何衰減，證明材料有很好的光熱穩(wěn)定性；

圖6是合成納米顆粒的細(xì)胞毒性檢測，與Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR相比，F(xiàn)e₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX能夠明顯抑制DLD-1細(xì)胞生長，光熱后效果更加明顯；

圖7是DLD-1人結(jié)腸癌細(xì)胞荷瘤裸鼠，注射材料后腫瘤隨時間的變化圖，圖中：

不同材料處理后14天測量腫瘤，計算相對體積，與對照組相比，可見Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX聯(lián)合近紅外光照射對腫瘤的抑制作用非常明顯。

具體實施方式

一種靶向修飾的負(fù)載阿霉素的磁性納米顆粒(Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX)，由多巴胺(PDA)作為外殼包裹形成的磁性Fe₃O₄納米顆粒作為核心，和在其表面通過1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)共價偶聯(lián)的EGFR抗體,以及通過非共價結(jié)合到納米顆粒表面的阿霉素(DOX)構(gòu)成。

本發(fā)明所述靶向修飾的負(fù)載阿霉素的磁性納米顆粒為球形結(jié)構(gòu)，粒徑為95～105nm。

本發(fā)明所述的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX納米顆粒在制備結(jié)腸癌靶向的光熱治療劑中的應(yīng)用。

實施例1

一種靶向修飾的負(fù)載阿霉素的磁性納米顆粒(Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX)的制備方法，包括下列步驟：

(1)將2mmol的FeCl₃溶解在4mL乙二醇和16mL一羧二乙二醇的混合溶液中，攪拌0.5h后，在上述溶液中加入2g的聚乙烯吡咯烷酮，將溶液加熱到120℃得到透明的黃色溶液，1h后，停止加熱并加入1.5g乙酸鈉，繼續(xù)攪拌0.5h，將溶液轉(zhuǎn)移到25mL的反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜密封并加熱到200℃，繼續(xù)反應(yīng)12h后，停止加熱并將反應(yīng)釜冷卻至室溫，得到的Fe₃O₄納米簇用乙醇和水各洗3遍，Tris緩沖液溶解；

(2)將步驟(1)所制的含F(xiàn)e₃O₄納米簇的Tris緩沖液調(diào)節(jié)pH至8.5，緩慢加入0.03M多巴胺溶液，在室溫下反應(yīng)3h直至顏色變黑，離心、去離子水洗滌2次，取沉淀物50℃真空干燥得到多巴胺包裹的Fe₃O₄@PDA納米粒子；

(3)取10mg步驟(2)制備的Fe₃O₄@PDA納米粒子及30mg NH₂-PEG-COOH溶于50mL，0.01M,pH 8.1，Tris緩沖液中，劇烈震搖12h，離心、去離子水洗滌2次，取沉淀物50℃真空干燥得到PEG偶聯(lián)的Fe₃O₄@PDA-PEG納米粒子；

(4)用PBS緩沖液溶解步驟(3)所得到的Fe₃O₄@PDA-PEG納米粒子使納米粒子濃度為1mg/mL，并調(diào)節(jié)pH為5.0，向此溶液中加入5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和12.5mmol的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)，室溫震蕩0.5h；在反應(yīng)體系中加入EGFR抗體使抗體終濃度為50ug/mL，混合均勻并調(diào)節(jié)pH至7.0，室溫振蕩反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后用PBS緩沖液離心洗滌2次，得到所述EGFR抗體修飾的納米顆粒Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR，得到的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR納米顆?？杉尤隤BS緩沖液溶解后置于4℃冰箱內(nèi)保存待用；

(5)取1mg上述步驟(4)制備的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR溶解于0.5mL 10×Tris緩沖液中與2mL DOX溶液1mg/mL混合，避光震搖12h后離心、去離子水洗滌2次，得到Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX納米粒子。

實施例2

包括下列步驟：

(1)將2mmol的FeCl₃溶解在4mL乙二醇和16mL一羧二乙二醇的混合溶液中，攪拌0.75h后，在上述溶液中加入2g的聚乙烯吡咯烷酮，將溶液加熱到120℃得到透明的黃色溶液，1.5h后，停止加熱并加入1.5g乙酸鈉，繼續(xù)攪拌0.75h，將溶液轉(zhuǎn)移到25mL的反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜密封并加熱到200℃，繼續(xù)反應(yīng)14h后，停止加熱并將反應(yīng)釜冷卻至室溫，得到的Fe₃O₄納米簇用乙醇和水各洗3遍，Tris緩沖液溶解；

(2)將步驟(1)所制的含F(xiàn)e₃O₄納米簇的Tris緩沖液調(diào)節(jié)pH至8.5，緩慢加入0.03M多巴胺溶液，在室溫下反應(yīng)4.5h直至顏色變黑，離心、去離子水洗滌3次，取沉淀物55℃真空干燥得到多巴胺包裹的Fe₃O₄@PDA納米粒子；

(3)取10mg步驟(2)制備的Fe₃O₄@PDA納米粒子及45mg NH₂-PEG-COOH溶于75mL，0.01M,pH 8.1，Tris緩沖液中，劇烈震搖18h，離心、去離子水洗滌3次，取沉淀物55℃真空干燥得到PEG偶聯(lián)的Fe₃O₄@PDA-PEG納米粒子；

(4)用PBS緩沖液溶解步驟(3)所得到的Fe₃O₄@PDA-PEG納米粒子使納米粒子濃度為1mg/mL，并調(diào)節(jié)pH為5.0，向此溶液中加入5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和12.5mmol的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)，室溫震蕩0.75h；在反應(yīng)體系中加入EGFR抗體使抗體終濃度為50ug/mL，混合均勻并調(diào)節(jié)pH至7.3，室溫振蕩反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后用PBS緩沖液離心洗滌3次，得到所述EGFR抗體修飾的納米顆粒Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR，得到的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR納米顆?？杉尤隤BS緩沖液溶解后置于4℃冰箱內(nèi)保存待用；

(5)取1mg上述步驟(4)制備的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR溶解于0.75mL 10×Tris緩沖液中與2mL DOX溶液1mg/mL混合，避光震搖12-24h后離心、去離子水洗滌3次，得到Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX納米粒子。

實施例3

包括下列步驟：

(1)將2mmol的FeCl₃溶解在4mL乙二醇和16mL一羧二乙二醇的混合溶液中，攪拌1h后，在上述溶液中加入2g的聚乙烯吡咯烷酮，將溶液加熱到120℃得到透明的黃色溶液，2h后，停止加熱并加入1.5g乙酸鈉，繼續(xù)攪拌1h，將溶液轉(zhuǎn)移到25mL的反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜密封并加熱到200℃，繼續(xù)反應(yīng)16h后，停止加熱并將反應(yīng)釜冷卻至室溫，得到的Fe₃O₄納米簇用乙醇和水各洗3遍，Tris緩沖液溶解；

(2)將步驟(1)所制的含F(xiàn)e₃O₄納米簇的Tris緩沖液調(diào)節(jié)pH至8.5，緩慢加入0.03M多巴胺溶液，在室溫下反應(yīng)6h直至顏色變黑，離心、去離子水洗滌3次，取沉淀物60℃真空干燥得到多巴胺包裹的Fe₃O₄@PDA納米粒子；

(3)取10mg步驟(2)制備的Fe₃O₄@PDA納米粒子及60mg NH₂-PEG-COOH溶于100mL，0.01M,pH 8.1，Tris緩沖液中，劇烈震搖-24h，離心、去離子水洗滌3次，取沉淀物60℃真空干燥得到PEG偶聯(lián)的Fe₃O₄@PDA-PEG納米粒子；

(4)用PBS緩沖液溶解步驟(3)所得到的Fe₃O₄@PDA-PEG納米粒子使納米粒子濃度為1mg/mL，并調(diào)節(jié)pH為5.0，向此溶液中加入5mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和12.5mmol的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)，室溫震蕩1h；在反應(yīng)體系中加入EGFR抗體使抗體終濃度為50ug/mL，混合均勻并調(diào)節(jié)pH至7.5，室溫振蕩反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后用PBS緩沖液離心洗滌3次，得到所述EGFR抗體修飾的納米顆粒Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR，得到的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR納米顆?？杉尤隤BS緩沖液溶解后置于4℃冰箱內(nèi)保存待用；

(5)取1mg上述步驟(4)制備的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR溶解于1mL 10×Tris緩沖液中與2mL DOX溶液1mg/mL混合，避光震搖24h后離心、去離子水洗滌3次，得到Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX納米粒子。

實驗例1

取制備的含F(xiàn)e₃O₄@PDA納米顆粒的溶液稀釋20倍后滴加于銅網(wǎng)上(溶液在銅網(wǎng)上形成小液滴)，對滴加樣品后的銅網(wǎng)用磷鎢酸(Sodium phosphotungstate)進行染色。將滴加樣品后的銅網(wǎng)放入通風(fēng)櫥中進行干燥，對處理后的Fe₃O₄@PDA進行透射電鏡檢測分析，結(jié)果見圖1。

實驗例2

取制備的Fe₃O₄@PDA或Fe₃O₄@PDA-PEG納米顆粒真空凍干后，通過紅外光譜儀進行紅外光譜檢測，結(jié)果見圖2。

實驗例3

取EGFR(2ug/mL)、Fe₃O₄@PDA-PEG納米顆粒及Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR(相當(dāng)于2ug/mL)納米顆粒，加入等體積2×上樣緩沖液，將樣品置于100℃沸水中熱變性5min，進行10％聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后，考馬斯亮藍過夜染色，甲醇脫色后凝膠成像儀觀察，結(jié)果見圖3。

實驗例4：

將不同濃度(0、15、30、60、120、240ug/mL)的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR水溶液置于1.5mL ep管中，通過3.0-T核磁成像系統(tǒng)檢測T₂核磁共振加權(quán)圖像，結(jié)果見圖4。

實驗例5

不同濃度(0、25、50、75、100、150ug/mL)的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR水溶液經(jīng)808nm近紅外光(0.6W/cm²)照射6min，用數(shù)顯溫度計記錄每分鐘溫度變化，同時將100ug/mL的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR水溶液經(jīng)808nm近紅外光(0.6W/cm²)照射6min，而后停止照射直至溫度恢復(fù)到室溫，再進行新一輪照射，該過程共重復(fù)5次，檢測合成材料經(jīng)多輪反復(fù)照射的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖5。

下過通過藥效學(xué)實驗來進一步說本發(fā)明。

將處于對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞DLD-1消化、離心后進行計數(shù)，在96孔板中每孔接種1.0×10⁴細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。分別取不同濃度的Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR、Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX、DOX與DLD-1細(xì)胞繼續(xù)孵育24h后，進行CCK-8檢測，以確定其相對對照組來說，實驗組細(xì)胞的存活率。同樣條件下，實驗組經(jīng)808nm近紅外光照射6min(350mW/cm²)后，CCK-8法檢測光熱對DLD-1細(xì)胞的影響。檢測儀器條件為：450nm處用BIO-TEKELx800全自動酶標(biāo)儀讀出吸光度值，結(jié)果見圖6

將處于對數(shù)生長期的DLD-1細(xì)胞細(xì)胞消化，取5×10⁶個細(xì)胞懸浮在100uL PBS中，皮下注射接種于BALB/c裸鼠的右股。每天觀察腫瘤的生長狀況，當(dāng)腫瘤直徑大約為4mm時，將小鼠隨機分為8組，每組5只，分別經(jīng)尾靜脈注射20uL PBS、Fe₃O₄@PDA-PEG、Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR、Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX(相當(dāng)于DOX 1mg/kg,Fe₃O₄@PDA 5mg/kg)。注射以后，腫瘤部位分別經(jīng)808nm近紅外光(350mW/cm²)照射6min或不照射，每2天測量一次腫瘤尺寸直至2周。腫瘤的長度和寬度用游標(biāo)卡尺進行測量。腫瘤的體積通過以下公式計算：腫瘤體積＝(寬²×長)/2。測量不同材料處理后14天的腫瘤大小，計算相對體積，與對照組相比，可見Fe₃O₄@PDA-PEG-EGFR-DOX聯(lián)合近紅外光照射對腫瘤的抑制作用非常明顯，結(jié)果見圖7。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。