本發(fā)明涉及藥物制劑
技術領域：
，具體涉及一種體內原位載藥水凝膠載體及其制備方法和應用。
背景技術：
：利用材料包埋藥物延緩藥物釋放，提高藥物療效及靶向作用已經(jīng)廣泛應用于臨床。其中，BMP-2已廣泛用于臨床上脊柱椎間融合，骨不連，大段骨缺損修復等等，展現(xiàn)了其替代自體骨修復的巨大潛力。但是目前PDA批準的可用于臨床的BMP-2產(chǎn)品“BMP-2+ACS”存在溶液狀態(tài)的BMP-2粘附性差導致周圍播散導致異位骨化等并發(fā)癥，此外為彌補體內快速降解及酶解作用提高BMP-2效應,BMP-2超生理劑量使用(mg/ml)導致成骨質量差、骨囊腫、脂肪形成等副作用，因此亟需開發(fā)一種不影響因子活性，又能控制因子緩慢釋放的載體。已有較多的細胞因子載體報道，他們往往只能夠延長BMP-2釋放時間幾天，還達不到BMP-2等細胞因子在自然骨折中的病理生理釋放時間(3周)；此外有關multi-barriercarrierstructures,e.g.,hierarchicalstructure[25],core-shellstructure[26]andnanoparticleembeddedstructure[27].等探索顯示了控制因子釋放較長時間，但是要控制因子在負重部位人工骨支架中的三維時空釋放還面臨挑戰(zhàn)。可注射溫敏水凝膠(PLGA-PEG-PLGA)逐漸顯示了其在藥物釋放領域中的巨大潛力，該系列水凝膠可于室溫環(huán)境下與細胞因子均勻混合并可注射體內，而在較高溫度(>30℃，包括體溫)時包埋細胞因子形成原位載藥凝膠。文獻(俞麟，Biomaterials，2013，Along-actingformulationofapolypeptidedrugexenatideintreatmentofdiabetesusinganinjectableblockcopolymerhydrogel；Biomater.Sci.,2013，ThethermogellingPLGA–PEG–PLGAblockcopolymerasasustainedreleasematrixofdoxorubicin)已利用該系列水凝膠包埋腫瘤化療藥物、胰島素等領域應用并取得較好效果。文獻(許國華，3DArtificialBonesforBoneRepairPreparedbyComputedTomography-GuidedFusedDepositionModelingforBoneRepair.ACSAppl.Mater.Interfaces，2014；Sol–gelderivedmesoporous58SbioactiveglasscoatingsonAZ31magnesiumalloyandinvitrodegradationbehavior，SurfaceandCoatingsTechnology，2014；中國專利CN102532585B，硫酸軟骨素交聯(lián)膠原蛋白/羥基磷灰石復合支架材料的制備方法)公開發(fā)表了關于組織工程骨的改進，如臨床使用的骨水泥、椎間融合器等僅僅起到機械支撐作用，可能導致融合率差等缺陷。目前，尚未見可用于仿生人工骨髓支架的體內原位載藥水凝膠載體的相關文獻報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供了一種體內原位載藥水凝膠載體及其制備方法和應用。本發(fā)明的主要技術方案是：本發(fā)明的第一目的在于提供一種體內原位載藥水凝膠載體PLGA–PEG–PLGA，所述水凝膠載體由丙交酯LA、聚乙二醇PEG和乙交酯GA聚合而成；其中，PLGA與PEG的數(shù)均分子量之比為1.5-3：1，LA與GA的摩爾比為3-5:1。進一步的，所述水凝膠載體中PLGA與PEG的數(shù)均分子量之比為2：1，LA與GA的摩爾比為4:1，所述水凝膠載體的數(shù)均分子量Mn為5956，重均分子量Mw為8732，分子量分布系數(shù)D為1.26；相變溫度約27-30℃；核磁計算得到的實際數(shù)均分子量為1744-1500-1744。本發(fā)明的第二目的在于提供一種體內原位載藥水凝膠載體PLGA–PEG–PLGA的制備方法，包括：a.以雙端羥基的PEG為引發(fā)劑，油浴加熱至100-150℃，減壓除水3-6小時，然后加入丙交酯單體LA和單體乙交酯GA，真空環(huán)境加熱待其完全融化后加入辛酸亞錫無水甲苯溶液催化，減壓除甲苯1小時，油浴升溫至150℃后在氬氣下繼續(xù)反應6小時；其中，所述PLGA與PEG按數(shù)均分子量1.5-3：1比例投料；LA與GA的摩爾比為3-5:1；b.反應完畢后，降溫至90-120℃，減壓除未反應單體及低沸點產(chǎn)物，將初始產(chǎn)物溶于10-15℃的冷水中，待其完全溶解后，加熱溶液至90-120℃，發(fā)生產(chǎn)物沉淀，移除上層溶液，重復提純產(chǎn)物，最后通過冷凍干燥除去水分并保存于-20℃真空。進一步的，所述步驟a中，PLGA與PEG按數(shù)均分子量2：1比例投料；LA與GA的摩爾比為4:1。進一步的，所述步驟a中，油浴加熱至120℃，減壓除水4小時。進一步的，所述步驟b中，反應完畢后，降溫至100℃，減壓除未反應單體及低沸點產(chǎn)物，將初始產(chǎn)物溶于10-15℃的冷水中，待其完全溶解后，加熱溶液至100℃。本發(fā)明的第三目的在于提供上述體內原位載藥水凝膠載體PLGA–PEG–PLGA在制備仿生人工骨髓支架中的應用。進一步的，所述應用包括：在所述水凝膠載體PLGA–PEG–PLGA中包埋促骨生長因子制成仿生人工骨髓支架。進一步的，所述促骨生長因子選自rhBMP-2、rhVEGF-165中的一種或兩種的混合。對于不同鏈長的樣品，即使在親疏水比接近的條件下，其溶解性差別也很大而且有獨特的分子量依賴性，只有分子量適中的嵌段共聚物才能溶于水中，分子量太小或分子量太大的樣品都不溶解。本發(fā)明通過調節(jié)PLGA–PEG–PLGA聚合物中親疏水嵌段比例，實現(xiàn)了聚合物/水體系在超過凝膠濃度以后具有室溫下為溶液、體溫下為凝膠的熱致sol-gel轉變特征。其中，PLGA–PEG–PLGA在20℃需要1h攪拌可得到均一透明的溶液，其25wt％溶液在較低溫度(小于27℃)時為流動的溶膠，接近體溫附近(大于30℃)時發(fā)生凝膠化，溫度達到42℃時沉淀析出。本發(fā)明的體內原位載藥水凝膠載體通過包埋促骨生長因子，可模擬自然骨髓充填于多孔人工骨支架中，模擬骨折修復過程中重要訊息因子的釋放，在改善脊柱融合、骨不連、骨缺損修復等領域具有極好的應用。附圖說明圖1為實施例1制備的PLGA-PEG-PLGA水凝膠載體的1HNMR譜圖；圖2為實施例1制備的PLGA-PEG-PLGA的GPC軌跡圖；圖3為25wt％PLGA-PEG-PLGA水溶液隨溫度變化的流變圖；圖4為PLGA-PEG-PLGA水凝膠載體相變大體觀；其中，sol溶膠中箭頭示液平，gel凝膠中箭頭示液平凝固；圖5為21天內三組凝膠載體rhVEGF165濃度釋放圖(Elisa檢測)；圖6為21天內三組凝膠載體rhBMP-2濃度釋放圖(Elisa檢測)；圖7為四組凝膠緩釋系統(tǒng)對成骨細胞成骨基因表達的影響，*代表顯著性差異，P<0.05有統(tǒng)計學意義；其中，a為ALP、b為COL-I、c為RUNX-2、d為OPN；圖8為四組凝膠緩釋系統(tǒng)中貼壁成骨細胞14天鈣結節(jié)染色；其中，a表示N組，b表示V組，c表示B組，d表示VB組；圖9為可注射PLGA-PEG-PLGA水凝膠載體注射小鼠皮下降解情況；其中，a表示注射后即刻，b表示注射后第1天，c表示原位凝膠取出后，d表示注射后3天，e表示注射后7天；圖10為水凝膠載體注射小鼠皮下14天降解情況；其中，a表示N組殘留凝膠，b表示V組殘留凝膠伴毛細血管分布，c表示B組骨性結構伴血管分布，d表示VB組骨性結構伴血管分布，d骨性結構較c組少；圖11為水凝膠載體注射小鼠皮下21天時情況；其中，a表示N組殘留凝膠，b表示V組殘留凝膠伴毛細血管分布，c表示B組骨性結構伴血管分布，d表示VB組骨性結構伴血管分布，c組與d組骨樣結構大小無明顯差異；圖12為水凝膠載體注射小鼠皮下28天時情況；其中，a表示N組殘留凝膠，b表示V組殘留凝膠伴毛細血管分布，c表示B組骨性結構伴血管分布，d表示VB組骨性結構伴血管分布，c組與d組骨樣結構大小無明顯差異；圖13為甲苯胺藍染色，圖中箭頭示成骨細胞和類骨質結構。具體實施方式下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。實施例1體內原位載藥水凝膠載體PLGA–PEG–PLGA的制備以下原料：聚乙二醇PEG(1500)(Aldrich-SigmaCo.)、丙交酯DL-lactide(LA)(Purac)、乙交酯glycolide(GA)(Purac)、辛酸亞錫(99％，Aldrich-SigmaCo.)，以及無水甲苯及二氯甲烷均通過市售獲得。在250毫升的燒瓶中加入20g雙端羥基的PEG(1500)，油浴加熱至120℃，減壓除水4小時，然后加入單體丙交酯(LA)48.8g和乙交酯12.2g(GA)摩爾比為4:1，真空環(huán)境加熱待其完全融化后加入150微升辛酸亞錫無水甲苯溶液催化，減壓除甲苯1小時，油浴升溫至150℃后在氬氣下繼續(xù)反應6小時。反應完畢后降溫到100℃，減壓除未反應單體及低沸點產(chǎn)物。將初始產(chǎn)物溶于(10-15℃)冷水中，待其完全溶解后，加熱溶液至100℃，發(fā)生產(chǎn)物沉淀，移除上層溶液，重復提純產(chǎn)物，最后通過冷凍干燥除去水分并保存于-20℃真空。實施例2水凝膠載體數(shù)均分子量、分子量分布、變相溫度測定1、將實施例1制備的的PLGA-PEG-PLGA水凝膠載體根據(jù)核磁計算得到的實際數(shù)均分子量為1744-1500-1744，LA:GA＝4:1，如圖1所示。2、通過GPC分析計算實施例1的PLGA-PEG-PLGA為均一物質，其數(shù)均分子量Mn:5956，重均分子量Mw:8732，分子量分布系數(shù)D:1.26，如圖2所示。3、用生理鹽水配置PLGA-PEG-PLGA的25wt％的溶液，其流變圖如圖3所示，可見當以0.5℃/min升溫速率到達27-30℃左右時，該水凝膠開始變相，超過30℃基本由流動的溶膠狀態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)的凝膠狀態(tài)(如圖4)。實施例3載rhBMP2/rhVEGF165凝膠PLGA–PEG–PLGA的制備將實施例1制備的載藥水凝膠載體PLGA-PEG-PLGA溶解于生理鹽水中，制備成25wt％的水凝膠溶液40ml，該水凝膠溶液經(jīng)過7kGy輻照消毒(第二軍醫(yī)大學輻照中心)后置于4℃冰箱靜置24h待其成均勻溶液狀態(tài)，在室溫(低于25℃)環(huán)境下于無菌超凈臺中利用5ml無菌注射器抽取14ml水凝膠溶液注入含有500ug的rhVEGF165試劑瓶中，將混有水凝膠和rhVEGF的試劑瓶置于混勻器中混勻5min，配制得含VEGF濃度為36ug/ml的混合物V溶液；將14ml水凝膠溶液注入含有5mg的rhBMP-2試劑瓶中配制含rhBMP-2濃度為360ug/ml的混合物B溶液；取一無菌離心管(15ml)于超凈臺無菌操作，注射器抽取5mlV溶液和5mlB溶液，置于混勻器中混勻5min，配制得含VEGF18ug/ml和rhBMP-2180ug/ml的混合物VB；將配置的三種凝膠溶液及不含因子的空白凝膠N溶液置于4℃冰箱待用。實施例4載rhBMP2/rhVEGF165凝膠于體外模擬體液中釋放情況如圖5中可見三組凝膠模擬體液中細胞因子濃度總體較平穩(wěn)，其中V組和VB于第3天模擬體液中細胞因子濃度相對增高，提示此時存在藥物突釋效應。圖6中可見三組凝膠模擬體液中細胞因子濃度總體較平穩(wěn)，其中B組和VB組于第3天模擬體液中細胞因子濃度相對增高，提示此時存在藥物突釋效應。實施例5體外對成骨細胞的影響為比較該載藥凝膠及其緩釋藥物對成骨細胞可能的影響，分別設置空白凝膠組(N組)、載rhVEGF165凝膠組(V組)、載rhBMP-2凝膠組和載rhBMP-2(VB組)、rhBMP-2凝膠組(B組)四組培養(yǎng)小鼠MC3T3成骨細胞。如圖7所示，結果表明：顯示隨著時間增長，各組細胞的成骨表達標記物(ALP、COL-I、RUNX-2、OPN)均呈一致性顯著增長；而且VB組四種標記物表達最高，B組次之，V組再次之，空白組表達最少。利用獨立樣本t-test進行組間比較，各組間存在顯著差異(置信區(qū)間為95％)。如圖8所示，于體外培養(yǎng)成骨細胞致第14天時，顯微鏡下觀察貼壁成骨細胞分化后鈣結節(jié)的染色情況顯示，VB組鈣結節(jié)染色最多，B組次之、V組、N組表達最少(圖8中，從左往右依次是N、V、B、VB組)。實施例6體內降解及異位骨化結果如圖9所示，于小鼠背部皮下注射水凝膠溶膠可原位形成固態(tài)凝膠，且注射后前7天四組凝膠形態(tài)逐漸變小，用小鑷子輕輕夾持凝膠感覺柔軟、部分糊狀散開，無明顯血管化和骨化形成。如圖10所示，于凝膠注射后14天時，其中載BMP-2凝膠(B組)凝膠大小未見變小和不均勻，反而變大而光整，表面可見血管分布，用小鑷子輕輕夾持凝膠感覺柔韌、無凝膠糊狀散開，用眼科剪從中間慢慢剪開，有水樣液體流出；載VEGF和BMP-2凝膠(VB組)凝膠形態(tài)未見明顯變小，但扁平不均勻，表面可見血管分布，用小鑷子輕輕夾持凝膠感覺柔韌、無明顯凝膠糊狀散開，無水樣液體流出。空白凝膠(N組)與載VEGF凝膠(V組)的凝膠形態(tài)逐漸變小并且不均勻，用小鑷子輕輕夾持凝膠感覺柔軟、部分糊狀散開，兩組無明顯骨樣結構生成，V組凝膠表面有部分血管分布。如圖11所示，于凝膠注射后21天時，載BMP-2凝膠(B組)大小較術后7天、14天時未見變小和不均勻，類似術后14天時大而光整的橢圓形，橢圓結構表面可見布滿血管，用小鑷子輕輕夾持凝膠感覺質地較硬、無凝膠散開，用眼科剪從中間慢慢剪開，無明顯水樣液體流出，囊壁變厚中間可見被包裹的凝膠；而載VEGF和BMP-2凝膠(VB組)凝膠形態(tài)較術后14天時明顯變厚實，成骨結構外形似于載BMP-2凝膠(B組)，用小鑷子輕輕夾持凝膠感覺質地較硬、無凝膠散開，無水樣液體流出，中間可見被包裹的凝膠和骨樣結構?？瞻啄z(N組)與載VEGF凝膠(V組)的凝膠形態(tài)繼續(xù)逐漸變小并且不均勻，用小鑷子輕輕夾持凝膠感覺柔軟、不易散開，兩組凝膠處未見明顯骨化改變，V組凝膠表面有少量血管分布。如圖12所示，于凝膠注射后28天時，B組和VB組皮下骨化結構與21天時未見明顯差異；N組與V組凝膠形態(tài)繼續(xù)變小并且不均勻，其中V組凝膠表面有少量血管分布與21天時未見明顯骨化差異。如圖13所示，分別取B組和BV組中術后皮下14天、21天、28天時的骨樣結構行甲苯胺藍染色(x100)，可見2組于個時間點組織學檢查均可見成骨細胞和類骨質樣結構，且隨著時間增長而增長。其中，B組于14天時類骨質面積明顯多于VB組，但在術后21天及28天時VB組類骨質面積并不少于B組。以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。當前第1頁1 2 3