本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種多肽納米微球、制備方法及其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多肽在生命過程中具有關(guān)鍵作用，多肽藥物是發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，隨著多肽合成技術(shù)及多肽重組表達(dá)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的多肽藥物應(yīng)用于臨床治療。多肽藥物具有制備方便、活性強(qiáng)、容易修飾、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，但也存在體內(nèi)容易降解、半衰期短等問題。此外，許多大分子多肽具有良好的抑瘤作用，但由于其難于進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，無(wú)法作為抗腫瘤藥物應(yīng)用，限制了這類藥物的應(yīng)用。因此，迫切需要采用新的技術(shù)提高多肽穿透細(xì)胞膜/核膜的能力，提高這類藥物的血漿半衰期，這一技術(shù)的突破對(duì)發(fā)展多肽/蛋白藥物具有重要價(jià)值。

海鞘多肽CS5931是我們研究團(tuán)隊(duì)由海洋生物海鞘中獲得的抗腫瘤多肽，前期研究表明，CS5931由58個(gè)氨基酸組成，分子量5931Da，可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)肝癌、結(jié)腸癌及肺癌等都具有很強(qiáng)的殺傷活性，對(duì)小鼠肝癌和人結(jié)腸癌裸鼠移植性腫瘤的抑瘤率分別達(dá)到59%和70%。CS5931具有發(fā)展成為新型抗腫瘤藥物的潛力。但我們前期研究發(fā)現(xiàn)CS5931可以主要作用于腫瘤細(xì)胞膜表面的烯醇式酶1（Enolase1），能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的量很少。但多肽作為藥物應(yīng)用，極易受到體內(nèi)蛋白酶的攻擊而降解，多數(shù)多肽的半衰期僅為十至幾十分鐘。我們測(cè)定了CS5931的半衰期，發(fā)現(xiàn)其在兔體內(nèi)的血漿半衰期僅為22min。因此，增加多肽的半衰期對(duì)進(jìn)一步提高其抗腫瘤效果具有重要意義。

納米技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，在生物科學(xué)的研究方面，納米技術(shù)也獲得了廣泛應(yīng)用，包括新型納米藥物的研發(fā)、納米醫(yī)用材料的應(yīng)用都取得了突破性進(jìn)展。本發(fā)明將多肽CS5931制備為納米微球，可大大提高其抗腫瘤活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供了一種多肽CS5931納米微球，并提供了該納米微球的制備方法及其在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種多肽納米微球，其特征在于：包括納米載體和由載體包裹或吸附的多肽CS5931。

優(yōu)選的，所述多肽CS5931由58個(gè)氨基酸組成，分子量5931Da，N末端序列為：MVVPCDGQSECPDGNT。

優(yōu)選的，所述納米載體為植物油或十二烷制備的納米顆粒，所述植物油包括大豆油，橄欖油或其它可食用非調(diào)和油。

更優(yōu)選的，所述納米載體與多肽CS5931的體積重量比為10：1-3ml/g。

更進(jìn)一步的，所述的多肽微球的制備方法，包括以下步驟：將多肽CS5931溶于5-15倍體積蒸餾水制備為水溶液，加入植物油或十二烷，將超聲探頭置于水油液面分界處，超聲處理制備成納米微球，采用超濾膜分離納米微球，即得。

優(yōu)選的，所述的多肽納米微球的制備方法，其特征在于包括以下步驟：將多肽CS5931溶于10倍體積蒸餾水制備為多肽水溶液，多肽水溶液按體積比3:2加入植物油或十二烷，將超聲探頭置于水油液面分界處，反應(yīng)溫度為20℃，超聲強(qiáng)度為150W/cm²，超聲時(shí)間為3min，采用超濾膜分離納米微球，收集微球體積小于200納米的微球，即得。

本發(fā)明還提供了上述的多肽納米微球在抗腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

1）多肽CS5931具有一定的抗腫瘤活性，但其穩(wěn)定性差，同時(shí)不能直接進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用；本發(fā)明將多肽CS5931制備成穩(wěn)定的納米微球，其穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，在室溫（25℃）條件下保存一周而不降解。這很好地解決了多肽的保存問題，為多肽藥物的應(yīng)用開辟了新的途徑。

2）本發(fā)明將具有顯著抗腫瘤活性的多肽CS5931制備為多肽納米微球，經(jīng)MTT法檢測(cè)，該納米微球具有更高的抗腫瘤活性，其半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）約為多肽CS5931的十分之一，抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。

附圖1為本發(fā)明的多肽CS5931納米微球用戊二醛固定后的電鏡掃描圖。

附圖2為本發(fā)明的多肽CS5931納米微球的甲醛變性PAGE凝膠電泳圖，圖中，M：蛋白Marker；1：Cs5931凝膠電泳；2：Cs5931納米微球凝膠電泳。

附圖3為本發(fā)明的多肽CS5931納米微球?qū)Y(jié)腸癌HCT116和肝癌Bel7402細(xì)胞增殖作用圖；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1.多肽CS5931納米微球的制備方案

多肽CS5931參照以下文獻(xiàn)方法進(jìn)行制備：

MarDrugs.2016Mar21;14(3).pii:E47.doi:10.3390/md14030047.

將多肽CS5931溶于10倍體積蒸餾水制備為多肽水溶液，多肽水溶液按體積比3:2加入保護(hù)油層（大豆油），將超聲探頭置于水油液面分界處（≈150W/cm²），反應(yīng)溫度設(shè)定為20℃，超聲時(shí)間為3Min。采用20kDa的超濾膜分離納米微球，納米微球分離出來(lái)后經(jīng)DLS和SME方法分析其大小及粒徑分布。多肽CS5931納米顆粒用戊二醛固定后用掃描電鏡分析，實(shí)施結(jié)果見附圖1所示，標(biāo)尺：100納米。結(jié)果表明應(yīng)用此方法可制備為200納米直徑大小的多肽CS5931納米微球，且成均質(zhì)分布在溶液中。

實(shí)施例2.多肽CS5931納米微球體外穩(wěn)定性檢測(cè)

為檢測(cè)多肽CS5931納米微球的體外穩(wěn)定性，將制備得到多肽CS5931樣品和采用本發(fā)明制備的多肽納米微球樣品，分別在25℃條件下放置0-7天，期間用紫外分光廣度計(jì)在280納米處監(jiān)測(cè)蛋白的紫外吸收值變化，結(jié)果表明，多肽CS5931放置7天后，吸收度顯著降低，但其納米微球，吸收度沒有變化，說明多肽CS5931制備為納米微球后穩(wěn)定性顯著升高。進(jìn)一步我們采用甲醛變性PAGE凝膠電泳檢測(cè)多肽CS5931的完整性，以評(píng)價(jià)多肽CS5931納米微球在室溫條件下的保存時(shí)間。實(shí)施結(jié)果見附圖2，結(jié)果表明：多肽CS5931應(yīng)用實(shí)施例1的方法制備為納米顆粒后可以在室溫25℃條件下存放7天而保持多肽的完整性，但未經(jīng)處理的多肽CS5931在室溫條件下存放7天完全降解。

實(shí)施例3.多肽CS5931納米微球體外抗腫瘤活性檢測(cè)

消化收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌HCT116和肝癌Bel7402細(xì)胞，每孔3000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，24h后，分別加入不同濃度的未處理的多肽及納米微球（0.25、0.5、1、2、4μM）、陰性對(duì)照采用PBS緩沖液，分別于44h加入0.5mg/mLMTT，4h后每孔加入DMSO150μL，溶解后于490nm處測(cè)吸收。計(jì)算不同濃度的抑制率，并計(jì)算IC₅₀。存活率計(jì)算公式如下：存活率(%)=OD_{實(shí)驗(yàn)}/OD_對(duì)照×100。

不同濃度的多肽及納米微球?qū)Y(jié)腸癌HCT116和肝癌Bel7402細(xì)胞的抑制曲線如圖3所示?？梢钥闯?，多肽能劑量依賴性抑制HCT116和肝癌Bel7402細(xì)胞生長(zhǎng)，IC₅₀分別為7.9和9.5μM，而多肽制備為納米微球后抗腫瘤活性大大升高，且對(duì)這兩種細(xì)胞的IC₅₀分別為0.75，1.1μM。