本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種可注射骨修復(fù)水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

由于骨質(zhì)疏松、創(chuàng)傷、腫瘤、感染和其他疾病而使骨喪失了一些骨質(zhì)，形成較大的間隙，稱為骨缺損。絕大多數(shù)骨缺損都難以愈合，最后形成骨不連。長期以來，骨缺損的修復(fù)主要采用自體骨移植或同種異體骨移植的方法，自體骨因兼有骨誘導(dǎo)活性和骨傳導(dǎo)作用，并且攜有具成骨作用的骨髓細(xì)胞，故目前仍奉為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但自體骨來源有限，且取骨增加患者痛苦；異體骨存在不同程度的免疫排斥反應(yīng)及具有潛在的病源傳播危險(xiǎn)。近年來，臨床上也在使用各種金屬、高分子材料或陶瓷等制造的人工骨替代材料。但是，這些材料的植入都有潛在增加骨丟失量，造成周圍組織的損傷，也使患者承受較大的手術(shù)創(chuàng)傷等缺點(diǎn)。

利用微創(chuàng)手術(shù)結(jié)合可注射骨修復(fù)材料修復(fù)骨缺損克服了完全人工骨替代材料的不足，極大地提高了手術(shù)的安全性和實(shí)用性，且手術(shù)費(fèi)用低、損傷小。然而，目前上臨床上使用的可注射骨修復(fù)材料中都存在不足，如：甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥由于現(xiàn)場(chǎng)固化放熱導(dǎo)致溫度升至90℃甚至更高，可能引起周圍組織壞死；且其生物相容性差、不可降解、殘留單體及引發(fā)劑存在細(xì)胞毒性。磷酸鈣骨水泥(CPC)的固化時(shí)間長、粘結(jié)性能差、抗水性能不足、初凝階段接觸體液易崩解、機(jī)械性能難以與正常骨相匹配，未固化的微納米粉體一旦進(jìn)入心血管系統(tǒng)，則會(huì)造成血管堵塞；硫酸鈣溶解迅速，在體液里易潰散，缺乏骨誘導(dǎo)性。綜上，傳統(tǒng)可注射骨修復(fù)材料尚有一定的缺陷而不適用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷和不足，本發(fā)明的目的是提供一種可注射骨修復(fù)水凝膠及其制備方法，該方法能在生理?xiàng)l件下形成水凝膠，不需要添加具有生物/細(xì)胞毒性的交聯(lián)劑或引發(fā)劑，反應(yīng)條件溫和，無劇烈放熱，在臨床應(yīng)用中不會(huì)引發(fā)周圍組織損傷。同時(shí)凝膠化時(shí)間可控，滿足臨床骨缺損修復(fù)的要求。并且所制得的水凝膠具有細(xì)胞/組織粘附性，有良好的生物相容性和生物降解性。該水凝膠有望成為臨床上理想的骨缺損修復(fù)材料。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種可注射骨修復(fù)水凝膠，該水凝膠包括將聚多巴胺修飾的鈣磷顆粒固載在帶有醛基的可降解天然高分子上，再將帶有氨基的可降解天然高分子與固載有聚多巴胺修飾的鈣磷顆粒的帶有醛基的可降解天然高分子混合發(fā)生席夫堿反應(yīng)得到。

具體的，所述的聚多巴胺修飾的鈣磷顆粒包括將鈣磷顆粒分散于0.5～5mg/ml的多巴胺Tris-HCl溶液中形成濃度為0.25％～1％W/V的溶液，攪拌離心后即得聚多巴胺修飾的鈣磷顆粒。

更具體的，所述的鈣磷顆粒包括：羥基磷灰石、硫酸鈣、碳酸鈣和磷酸鈣中的一種或一種以上的混合物；鈣磷顆粒的粒徑為100nm～10μm。

還有，所述的帶有醛基的可降解天然高分子包括氧化海藻酸鈉、氧化透明質(zhì)酸、氧化纖維素、氧化甲殼素和氧化硫酸軟骨素中的一種或一種以上的混合物。

另外，所述的帶有氨基的可降解天然高分子包括明膠、殼聚糖、膠原、類人類膠原蛋白和生物短肽中的一種或一種以上的混合物。

可注射骨修復(fù)水凝膠的制備方法，包括將2～20wt％的帶有氨基的可降解天然高分子緩沖溶液與5～20wt％的固載有聚多巴胺修飾的鈣磷顆粒的帶有醛基的可降解天然高分子緩沖溶液以體積比為1∶0.25～4的比例混合，攪拌發(fā)生席夫堿反應(yīng)形成所述的水凝膠。

優(yōu)選的，包括將20wt％的帶有氨基的可降解天然高分子緩沖溶液與20wt％的固載有聚多巴胺修飾的鈣磷顆粒的帶有醛基的可降解天然高分子緩沖溶液以體積比為1∶1的比例混合，攪拌發(fā)生席夫堿反應(yīng)形成所述的水凝膠。

優(yōu)選的，所述的帶有氨基的可降解天然高分子為明膠，帶有醛基的可降解天然高分子為氧化海藻酸鈉，聚多巴胺修飾的鈣磷顆粒為聚多巴胺修飾的納米羥基磷灰石顆粒。

還有，所述的緩沖溶液中使用的緩沖液可以為磷酸緩沖液、生理鹽水或模擬體液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

一、本發(fā)明的水凝膠是在生理?xiàng)l件下天然高分子通過席夫堿反應(yīng)形成的，不需要添加具有生物/細(xì)胞毒性的交聯(lián)劑或引發(fā)劑。該反應(yīng)條件溫和，無劇烈放熱，在臨床應(yīng)用中不會(huì)引發(fā)周圍組織損傷，適用于臨床骨修復(fù)材料。

二、該水凝膠引入仿貽貝的粘附分子聚多巴胺對(duì)鈣磷顆粒進(jìn)行表面修飾，從而使鈣磷顆粒在水凝膠網(wǎng)絡(luò)中具有良好的分散性；且經(jīng)聚多巴胺修飾后的鈣磷顆粒能與水凝膠中的天然高分子發(fā)生席夫堿反應(yīng)，既增加水凝膠網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián)度，也提高了水凝膠的力學(xué)性能，適用于骨缺損的修復(fù)。

三、該水凝膠的主體成分是具有優(yōu)異的細(xì)胞/組織親和性的天然高分子，且上述物質(zhì)均可以完全生物降解。因此該水凝膠可完全降解，且降解產(chǎn)物無毒副作用；同時(shí)，該水凝膠中的聚多巴胺具有超強(qiáng)的粘附性能，有利于成骨相關(guān)細(xì)胞的粘附、增殖，從而能與鈣磷顆粒協(xié)同促進(jìn)骨組織的生長和修復(fù)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1-3中的水凝膠注射5分鐘后凝結(jié)效果圖；

圖2為實(shí)施例1-3中的水凝膠注射15分鐘后凝結(jié)效果圖；

圖3為實(shí)施例2制得的水凝膠最終凝結(jié)效果圖；

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做具體說明。

具體實(shí)施方式

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷和不足，本發(fā)明的目的是提供一種可注射骨修復(fù)水凝膠及其制備方法，該方法能在生理?xiàng)l件下形成水凝膠，不需要添加具有生物/細(xì)胞毒性的交聯(lián)劑或引發(fā)劑，反應(yīng)條件溫和，無劇烈放熱，在臨床應(yīng)用中不會(huì)引發(fā)周圍組織損傷。同時(shí)凝膠化時(shí)間可控，滿足臨床骨缺損修復(fù)的要求。并且所制得的水凝膠具有細(xì)胞/組織粘附性，有良好的生物相容性和生物降解性。該水凝膠有望成為臨床上理想的骨缺損修復(fù)材料。

一種可注射骨修復(fù)水凝膠的制備方法，其具體步驟如下：

A、聚多巴胺(PDA)修飾鈣磷顆粒

將鈣磷顆粒分散于0.5～5mg/ml的多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液中，形成0.25％～1％W/V的溶液，攪拌6～24h后離心，可得到PDA修飾的鈣磷顆粒(PCP)；

B、PCP的固定

向5～20wt％的帶有醛基的可降解天然高分子磷酸緩沖液(PBS)中加入PDA修飾的鈣磷顆粒(PCP)，充分混合，其中PCP的濃度為5～20wt％，即得固載有PDA修飾的鈣磷顆粒的帶有醛基的可降解天然高分子磷酸緩沖溶液；

C、水凝膠的制備

將帶有氨基的可降解天然高分子溶解于磷酸緩沖液(PBS)中，形成2～20wt％的溶液，再將其與上述固載有PDA修飾的鈣磷顆粒的帶有醛基的可降解天然高分子磷酸緩沖溶液以體積比1∶0.25～4的比例混合，充分?jǐn)嚢?，發(fā)生席夫堿反應(yīng)形成水凝膠。

進(jìn)一步，本發(fā)明中A步中使用的鈣磷顆粒為：羥基磷灰石、硫酸鈣、碳酸鈣和磷酸鈣等鈣鹽顆粒(上述顆粒粒徑為100nm-10μm)中的一種或一種以上的混合物。

進(jìn)一步，本發(fā)明B步中使用的帶有醛基的可降解天然高分子是氧化海藻酸鈉、氧化透明質(zhì)酸、氧化纖維素、氧化甲殼素和氧化硫酸軟骨素等的一種或一種以上的混合物。

進(jìn)一步，本發(fā)明C步中使用的帶有氨基的可降解天然高分子是明膠、殼聚糖、膠原、類人類膠原蛋白和生物短肽等的一種或一種以上的混合物。

進(jìn)一步，本發(fā)明B或C步中的磷酸緩沖液可以替代為生理鹽水或模擬體液等緩沖液。

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做具體說明，但本發(fā)明并不局限于下述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過合理推斷得到的其他技術(shù)方案均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。以下實(shí)施例中使用的磷酸緩沖液的濃度為0.01M，pH為7.2～7.4。

實(shí)施例1：

A、PDA修飾納米羥基磷灰石

將2g納米羥基磷灰石(HA)(粒徑為150～200nm)分散在100ml濃度為5mg/ml的多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液中，攪拌12h后離心，可得到PDA修飾的納米羥基磷灰石(PHA)；

B、氧化海藻酸鈉(ADA)的制備

將5.0g海藻酸鈉分散在25ml乙醇中形成懸浮液I，將3.25g高碘酸鈉溶于25ml蒸餾中形成溶液II，隨后將溶液II加入到懸浮液I中，避光攪拌反應(yīng)6h后加入2.5ml乙二醇終止反應(yīng)2h，將該反應(yīng)混合液加入到劇烈攪拌的200ml無水乙醇中。抽濾后將產(chǎn)物用蒸餾水充分溶解后裝入透析袋中透析3d；最終將白色產(chǎn)物放入表面皿中，冷凍干燥3d，即可得到氧化海藻酸鈉；

C、PHA的固定

向20wt％的ADA磷酸緩沖液(PBS)中加入PHA，充分混合，其中PHA的濃度為10wt％，得到ADA-PHA溶液；

D、水凝膠的制備

將明膠溶解于磷酸緩沖液(PBS)中，形成15wt％的溶液，再將其與上述的ADA-PHA溶液按照體積比1∶1的比例混合，充分?jǐn)嚢?，發(fā)生席夫堿反應(yīng)形成水凝膠。

經(jīng)測(cè)定水凝膠的凝膠時(shí)間約為15min。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例與實(shí)施例1不同的是：

C、PHA的固定

向20wt％的ADA磷酸緩沖液(PBS)中加入PHA，充分混合，其中PHA的濃度為20wt％，得到ADA-PHA溶液；

經(jīng)測(cè)定水凝膠的凝膠時(shí)間約為5min。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例與實(shí)施例1不同的是，納米羥基磷灰石未經(jīng)PDA修飾，經(jīng)測(cè)定混合液超過30min未凝膠。

將實(shí)施例1-3的水凝膠進(jìn)行注射凝膠時(shí)間測(cè)試：注射5分鐘后凝膠結(jié)果見圖1，圖1中的a為實(shí)施例3中的水凝膠的凝結(jié)情況，圖1中的b為實(shí)施例1中的水凝膠的凝結(jié)情況，圖1中的c為實(shí)施例2中的水凝膠的凝結(jié)情況；

注射15分鐘后的的凝結(jié)效果圖見圖2，圖2中的a為實(shí)施例3中的水凝膠的凝結(jié)情況，圖2中的b為實(shí)施例1中的水凝膠的凝結(jié)情況，圖2中的c為實(shí)施例2中的水凝膠的凝結(jié)情況；

由圖1和圖2中的凝結(jié)效果圖可知，隨著聚多巴胺(PDA)修飾的納米羥基磷灰石(PHA)濃度的增加，水凝膠體系的凝膠時(shí)間相應(yīng)縮短。臨床應(yīng)用中可根據(jù)需要在一定范圍內(nèi)(3-20min)調(diào)整凝膠時(shí)間以適應(yīng)各種類型的骨缺損修復(fù)。

實(shí)施例2制備得到的水凝膠的最終凝結(jié)效果圖見圖3，圖3說明在生理?xiàng)l件下天然高分子通過席夫堿反應(yīng)形成了水凝膠，不需要添加具有生物/細(xì)胞毒性的交聯(lián)劑或引發(fā)劑。

實(shí)施例4：

A、PDA修飾納米羥基磷灰石

將2g納米羥基磷灰石(HA)(粒徑為150～200nm)分散在100ml濃度為3mg/ml的多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液中。攪拌16h后離心，可得到PDA修飾的納米羥基磷灰石(PHA)。

B、氧化海藻酸鈉(ADA)的制備

將5.0g海藻酸鈉分散在25ml乙醇中形成懸浮液I，將3.25g高碘酸鈉溶于25ml蒸餾中形成溶液II，隨后將溶液II加入到懸浮液I中，避光攪拌反應(yīng)4h后加入與2.5ml乙二醇終止反應(yīng)2h，將該反應(yīng)混合液加入到劇烈攪拌的200ml無水乙醇中。抽濾后將產(chǎn)物用蒸餾水充分溶解后裝入透析袋中透析3d；最終將白色產(chǎn)物放入表面皿中，冷凍干燥3d，即可得到氧化海藻酸鈉。

C、PHA的固定

向12wt％的ADA磷酸緩沖液(PBS)中加入PHA，充分混合，其中PHA的濃度為15wt％，得到ADA-PHA溶液。

D、水凝膠的制備

將殼聚糖溶解于磷酸緩沖液(PBS)中，形成2wt％的溶液，再將其與上述的ADA-PHA溶液按照體積比1∶1的比例混合，充分?jǐn)嚢瑁l(fā)生席夫堿反應(yīng)形成水凝膠。

經(jīng)測(cè)定水凝膠的凝膠時(shí)間約為10min。

實(shí)施例5：

A、PDA修飾納米羥基磷灰石

將2g納米羥基磷灰石(HA)(粒徑為150～200nm)分散在100ml濃度為0.5mg/ml的多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液中。攪拌24h后離心，可得到PDA修飾的納米羥基磷灰石(PHA)。

B、氧化纖維素(CDA)的制備

將5.0g纖維素分散在25ml乙醇中形成懸浮液I，將3.10g高碘酸鈉溶于25ml蒸餾中形成溶液II，隨后將溶液II加入到懸浮液I中，避光攪拌反應(yīng)6h后加入與2.5ml乙二醇終止反應(yīng)2h，將該反應(yīng)混合液加入到劇烈攪拌的200ml無水乙醇中。抽濾后將產(chǎn)物用蒸餾水充分溶解后裝入透析袋中透析3d；最終將白色產(chǎn)物放入表面皿中，冷凍干燥3d，即可得到氧化纖維素。

C、PHA的固定

向5wt％的CDA磷酸緩沖液(PBS)中加入PHA，充分混合，其中PHA的濃度為20wt％，得到CDA-PHA溶液。

D、水凝膠的制備

將明膠溶解于磷酸緩沖液(PBS)中，形成15wt％的溶液，再將其與上述的CDA-PHA溶液按照體積比1∶1的比例混合，充分?jǐn)嚢?，發(fā)生席夫堿反應(yīng)形成水凝膠。

經(jīng)測(cè)定水凝膠的凝膠時(shí)間約為5min。

實(shí)施例6：

A、PDA修飾硫酸鈣顆粒

將2g硫酸鈣顆粒(CS)(粒徑為2～6μm)分散在100ml濃度為2mg/ml的多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液中。攪拌16h后離心，可得到PDA修飾的硫酸鈣顆粒(PCS)。

B、氧化海藻酸鈉(ADA)的制備

將5.0g海藻酸鈉分散在25ml乙醇中形成懸浮液I，將3.25g高碘酸鈉溶于25ml蒸餾中形成溶液II，隨后將溶液II加入到懸浮液I中，避光攪拌反應(yīng)6h后加入與2.5ml 乙二醇終止反應(yīng)2h，將該反應(yīng)混合液加入到劇烈攪拌的200ml無水乙醇中。抽濾后將產(chǎn)物用蒸餾水充分溶解后裝入透析袋中透析3d；最終將白色產(chǎn)物放入表面皿中，冷凍干燥3d，即可得到氧化海藻酸鈉。

C、PCS的固定

向15wt％的ADA磷酸緩沖液(PBS)中加入PCS，充分混合，其中PCS的濃度為10wt％，得到ADA-PCS溶液。

D、水凝膠的制備

將明膠溶解于磷酸緩沖液(PBS)中，形成15wt％的溶液，再將其與上述的ADA-PCS溶液按照體積比1∶1的比例混合，充分?jǐn)嚢?，發(fā)生席夫堿反應(yīng)形成水凝膠。

經(jīng)測(cè)定水凝膠的凝膠時(shí)間約為10min。

實(shí)施例7：

A、PDA修飾碳酸鈣顆粒

將2g碳酸鈣顆粒(CC)(粒徑為1μm-5μm)分散在100ml濃度為3mg/ml的多巴胺(DA)的Tris-HCl溶液中。攪拌20h后離心，可得到PDA修飾的碳酸鈣顆粒(PCC)。

B、氧化透明質(zhì)酸(AHA)的制備

將5.0g透明質(zhì)酸溶解于在500ml蒸餾水中形成溶液I，將1.38g高碘酸鈉溶于10ml蒸餾中形成溶液II，隨后將溶液II加入到懸浮液I中，避光攪拌反應(yīng)6h后加入與2.5ml乙二醇終止反應(yīng)1h，將該反應(yīng)混合液加入到劇烈攪拌的200ml無水乙醇中。抽濾后將產(chǎn)物用蒸餾水充分溶解后裝入透析袋中透析3d；最終將白色產(chǎn)物放入表面皿中，冷凍干燥3d，即可得到氧化纖透明質(zhì)酸。

C、PCC的固定

向20wt％的AHA生理鹽水中加入PCC，充分混合，其中PCC的濃度為10wt％，得到AHA-PCC溶液。

D、水凝膠的制備

將明膠溶解于生理鹽水中，形成10wt％的溶液，再將其與上述的AHA-PCC溶液按照體積比1∶1的比例混合，充分?jǐn)嚢?，發(fā)生席夫堿反應(yīng)形成水凝膠。

經(jīng)測(cè)定水凝膠的凝膠時(shí)間約為10min。