本發(fā)明屬于基因的功能與應用領(lǐng)域，特別涉及一種雙特異性磷酸酶14(Dual-specificityphosphatase14,DUSP14)作為靶基因在制備預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中應用。
背景技術(shù)：
：糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染和精神因素等多種因素引發(fā)的機體胰島功能減退、胰島素抵抗，最終導致糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征。Ⅱ型糖尿病(T2DM)又稱非胰島素依賴型糖尿病，是一種以高血糖為表現(xiàn)特征的代謝綜合征[1]，約占糖尿病總?cè)藬?shù)的90％以上，已成為繼癌癥、心血管疾病之后的第三大影響人類健康的疾病。其可并發(fā)冠心病、末梢血管病、高血壓、腎病等多種疾病，累及心腦血管、腎臟、視網(wǎng)膜、神經(jīng)等重要臟器和組織，肝臟也是其重要的靶器官之一。隨著糖尿病病程的延長，發(fā)生肝臟病變的危險性及其病變程度也隨之增加。糖尿病性肝損傷是指糖尿病引起的肝臟組織學和功能變化，是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥。非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是以患者雖然無過量飲酒史，但是肝實質(zhì)細胞卻出現(xiàn)脂肪變性和脂肪堆積為病理特征的慢性肝臟疾病[2-4]。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝(NAFLD)已逐漸成為我國第一大肝病，其危害不僅可進展為非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝細胞癌，而且作為代謝綜合征的重要組分與心腦血管疾病密切相關(guān)，嚴重影響了人們的身體健康和生活質(zhì)量，也給社會帶來沉重負擔。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，T2DM合并NAFLD的患病率正逐年增加。研究結(jié)果顯示，在糖尿病人群中，NAFLD患病率可高達80％[5]。在有些患者中肝臟脂肪沉積可能是影響其T2DM發(fā)展的主要因素[6]。另一方面，如果T2DM控制不佳或充分發(fā)展，不僅促進脂肪肝生成，而且使肝損傷加重，甚至形成非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維變性、肝硬化及肝細胞癌。T2DM合并NAFLD將大大增加由于肝硬化、肝細胞癌和心血管并發(fā)癥導致的死亡風險[7]。目前，雖然控制高脂血癥在T2DM伴NASH患者中的治療作用仍有待探究，但是NAFLD的治療主要包括針對糖尿病和心血管風險因子的積極控制。研究表明，在合并T2DM和NASH的患者中，只有噻唑烷二酮類藥物吡格列酮顯示出肝臟組織學的明顯改善。因此未來我們應該制定特異的篩選標準以及治療方案以期應用于臨床T2DM和NAFLD患者，尤其是T2DM和NAFLD合并的患者。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKS)是細胞內(nèi)的一類絲氨酸/酪氨酸蛋白激酶，已經(jīng)證實，MAPKS信號通路存在于大多數(shù)細胞內(nèi)，在細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化、凋亡等細胞反應中發(fā)揮重要作用。雙特異性磷酸酶(DUSP)，是蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶超家族的一個亞家族，是一類雙向特異性蘇/酪氨酸磷酸酯酶。不僅能使磷酸化的蘇氨酸/絲氨酸去磷酸化，還可使磷酸化的酪氨酸去磷酸化[8]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征和序列的相似性可分為典型的和非典型的。研究表明，現(xiàn)已知的大多數(shù)家族成員均作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPKS)的負向調(diào)節(jié)劑參與細胞增殖、分化、代謝、基因轉(zhuǎn)錄、離子通道、細胞細胞通信、免疫應答等以及腫瘤的形成。Dual-specificityphosphatase14(DUSP14；alsoknownasMKP6)，非典型雙特異性磷酸酶亞組的一員，MAPKS信號通路重要的負向調(diào)節(jié)劑，已被證實在炎癥免疫反應，腫瘤，細胞分化，增殖方面發(fā)揮重要作用。DUSP14首先作為CD28胞質(zhì)尾區(qū)相互作用的蛋白被克隆出來，后來發(fā)現(xiàn)在心臟，胚胎，肝臟等組織器官相對高表達[9]。另外KlingerS等發(fā)現(xiàn)當β細胞表達顯性負調(diào)控的DUSP14S時，通過增加ERK激活，細胞增殖率則表現(xiàn)出明顯的增加趨勢[10]。參考文獻：[1]KatsikiN，AthyrosV，GkaragiannisA，etal.Metabolicsyndromeandnon-cardiacVasculardiseases:anupdatefromhumanstudies[J].CurrPharmDes，2014,20(31)：4944-52[2]KrawczykM，BonfrateL，PortincasaP.Nonalcoholicfattyliverdisease[J].BestPractResClinGastroenterol，2010，24(5):695-708.[3]GeorgeJ，PeraN，PhungN，etal.Lipidperoxidation，stellatecellactivationandhepaticfibrogenesisinaratmodelofchronicsteatohepatitis[J].JHepatol，2003，39(5):756-764.[4]MansourGF，VahhabiMM，JoukarF，etal.Noninvasiveevaluationofnonalcoholicsteatohepatitis(NASH)[J].CaspianJInterMed，2013，4(4):797-798.[5]FanJG,FarrellGC.Epidemiologyofnon-alcoholicfattyliverdiseaseinchina.JHepatol.2009；50:204-210.[6]LoriaP,LonardoA,AnaniaF.Liveranddiabetes.Aviciouscircle.HepatolRes.2013；43:51-64.[7]CusiK.Treatmentofpatientswithtype2diabetesandnon-alcoholicfattyliverdisease:Currentapproachesandfuturedirections.Diabetologia.2016；59:1112-1120.[8]LiuC，ShiY，DuY，etal.Dual-specificityphosphataseDUSP1protectsoveractivationofhypoxia-induciblefactor1throughinactivatingERKMAPK[J].ExperimentalCellResearch，2005，309(2)：410-418.[9]MartiF,KrauseA,PostNH,LyddaneC,DupontB,SadelainM,KingPD(2001)Negative-feedbackregulationofCD28costimulationbyanovelmitogen-activatedproteinkinasephosphatase,MKP6.JImmunol166:197–206.[10]KlingerS,PoussinC,DebrilMB,DolciW,HalbanPA,ThorensB(2008)IncreasingGLP-1-inducedb-cellproliferationbysilencingthenegativeregulatorsofsignalingcAMPresponseelementmodulator-aandDUSP14.Diabetes57:584–593.技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供DUSP14基因的表達與非酒精性脂肪肝及Ⅱ型糖尿病之間的相互關(guān)系，提供一個用于治療非酒精性脂肪肝，Ⅱ型糖尿病的靶基因DUSP14的新用途，進而把DUSP14基因應用于非酒精性脂肪肝Ⅱ型糖尿病的治療中。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：本發(fā)明以野生型C57小鼠與DUSP14肝臟特異性基因敲除小鼠(DUSP14-KO)為實驗對象，通過高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型(dietinducedobesity，DIO)研究DUSP14基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型WT小鼠對比，DUSP14-KO小鼠表現(xiàn)出肥胖，其體重明顯高于同種飼料飼養(yǎng)的WT小鼠，并且DUSP14-KO的空腹血糖水平高于對照組WT小鼠，DUSP14-KO小鼠的肝功能明顯差于WT小鼠。進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗發(fā)現(xiàn)DUSP14-KO小鼠對葡萄糖的耐受能力明顯減弱。從肝臟重量及肝臟/體重比以及肝臟甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸含量檢測結(jié)果等均說明HFD組(Highfatdiet，高脂飲食)的DUSP14-KO小鼠脂肪肝病變明顯嚴重，脂質(zhì)蓄積顯著增加。這表明DUSP14基因敲除會加劇脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，DUSP14基因能夠改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生。本發(fā)明人的研究證明了：在高脂誘導的脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型中，DUSP14具有抑制肥胖，降低血糖，減少肝臟脂質(zhì)蓄積，保護肝功能，特別是改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的作用。針對DUSP14的上述功能，提供DUSP14作為藥物靶標在篩選保護肝臟及糖代謝的藥物中的應用。針對DUSP14的上述功能，提供DUSP14作為藥物靶標在篩選預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應用。以上藥物是指能夠促進DUSP14基因表達的藥物。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)DUSP14基因的新功能，即DUSP14基因具有能夠保護脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病的作用。(2)基于DUSP14在保護脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制備預防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。附圖說明圖1是Dusp14-KO小鼠構(gòu)建策略圖。圖2是WT和DUSP14-KO小鼠的空腹血糖結(jié)果圖；A為空腹血糖水平統(tǒng)計圖，B為空腹血清胰島素水平圖(*：p＜0.05vsWTNC組，**：p＜0.01vsWTNC組，#：p＜0.05vsWTHFD組，##：p＜0.01vsWTHFD組)。圖3是WT和DUSP14-KO小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量結(jié)果圖；A為通過腹腔注射葡萄糖后不同時間點小鼠血糖水平統(tǒng)計圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積(areaunderthecurve，AUC)比較圖(*：p＜0.05vsWTNC組，**：p＜0.01vsWTNC組，#：p＜0.05vsWTHFD組，##：p＜0.01vsWTHFD組)。圖4是DUSP14-KO和WT小鼠的肝臟重量結(jié)果圖；A為肝臟重量統(tǒng)計柱狀圖，B為肝臟重量與小鼠本身體重比值統(tǒng)計柱狀圖(*：p＜0.05vsWTNC組，**：p＜0.01vsWTNC組，#：p＜0.05vsWTHFD組，##：p＜0.01vsWTHFD組)。圖5是DUSP14-KO和WT小鼠的肝臟脂質(zhì)結(jié)果圖；分別為肝臟膽固醇，肝臟甘油三酯及肝臟游離脂肪酸統(tǒng)計柱狀圖(*：p＜0.05vsWTNC組，**：p＜0.01vsWTNC組，#：p＜0.05vsWTHFD組，##：p＜0.01vsWTHFD組)。具體實施方式通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。實驗用動物及飼養(yǎng)：實驗動物種屬，性別，周齡及來源：C57BL/6小鼠(WT)和DUSP14肝臟特異性基因敲除(DUSP14-KO)小鼠，雄性，8周齡。C57BL/6小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，DUSP14肝臟特異性基因敲除小鼠(DUSP14-KO)由DUSP14-floxed小鼠與受蛋白啟動子控制、肝細胞特異性表達的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠Albumin-Cre(購自TheJacksonLaboratory，貨號003574)雜交得到，構(gòu)建策略見圖1。肝臟特異性DUSP14基因敲除小鼠的構(gòu)建：根據(jù)基因信息利用CRISPRDesign(網(wǎng)址：http://crispr.mit.edu/)分別在內(nèi)含子2和外顯子3的右邊中各設計一個CRISPR的打靶位點。靶序列分別為：DUSP14-sRNA1：ggATAAGTCATTTTCTATTGACCATTGGDUSP14-sRNA2：GGTTCTCCCGAGAGGGTTTCTACGCTGG此外還設計了一個用于同源修復的供體質(zhì)粒(DonorVector)，它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子3以及兩個同向的loxp序列。①打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對應的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個T7啟動子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實驗。②供體載體(DonorVector)的構(gòu)建：根據(jù)引物設計原則，設計如下引物(表1)用于擴增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。擴增得到的產(chǎn)物經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切后得到3個片段，將其分別連入條件性敲除骨架載體pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到DonorVector。表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對應酶切位點引物名稱引物序列酶切位點DUSP14LA-FGGGGTACCCCGGCTCAATGATTTCCTCTKpnIDUSP14LA-RGCGTCGACCATTGGGAGATGTAGCCTGCASalIDUSP14M-FTCTACCGGTGTCAATAGAAAATGACTTATATGCTTCAgeIDUSP14M-RGACCTTAAGTAGAAACCCTCTCGGGAGAACAflIIDUSP14RA-FCGACGCGTCGCTGGGTGTTCGGGTTMluIDUSP14RA-RATAAGAATGCGGCCGCCCTGGCTGATAAAAGGGAAANotI③打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個部分(負責切割作用的Cas9蛋白和引導Cas9蛋白定位到靶位點的gRNA)分別進行轉(zhuǎn)錄。對于Cas9蛋白，將其表達載體(pST1374-Cas9)用PmeI進行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7mMESSAGEmMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對于sgRNA，使用MEGAshortscriptTMKit(AM1354，Ambion公司)進行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit(Qiagen，217084)進行純化。④DUSP14-floxed條件性敲除小鼠的制作將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進行培育。得到的小鼠進行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機挑選一只作為F0代進行后續(xù)的繁殖，最終獲得DUSP14-floxed純合小鼠。⑤肝臟特異性DUSP14基因敲除小鼠的制作將上述DUSP14-floxed小鼠與肝臟特異性Albumin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到DUSP14floxed/floxed/Albumin-Cre小鼠，待該小鼠長至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導Cre酶的表達，Cre酶特異性的識別兩個同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個loxp，最后得到肝臟細胞特異性DUSP14基因敲除小鼠。實驗動物飼料配方：高脂飼料(HFD)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12942)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，總的熱量質(zhì)量比:5.24kcal/g。低脂飼料(NC)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12450B)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，總的熱量質(zhì)量比:3.85kcal/g。飼養(yǎng)環(huán)境及條件：SPF級實驗動物中心，室溫在22-24℃之間，濕度在40-70％之間，明暗交替照明時間為12h，自由飲水攝食。【實施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型(dietinducedobesity，DIO)獲得(1)實驗動物分組：選用8周齡，雄性，WT小鼠和DUSP14-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfatdiet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normalchow，NC)飼養(yǎng)，即WTNC組，KONC組，WTHFD組，KOHFD組共4個組別。(2)模型通過高脂飼料誘導操作流程：采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，進行表型相關(guān)分析，明確DUSP14基因?qū)χ靖?、Ⅱ型糖尿病發(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，WT小鼠和DUSP14-DUSP14小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfatdiet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normalchow，NC)飼養(yǎng)，即WTNC組，KONC組，WTHFD組，KOHFD組共4個組別。每周均詳細記錄小鼠攝食量，小鼠空腹體重和空腹血糖每隔2周檢測1次。實驗第12周，進行腹腔注射葡萄糖實驗(IPGTT)，以評價小鼠機體對葡萄糖耐受能力，第14周終末取材?！緦嵤├?】小鼠空腹血糖水平及血清胰島素水平測定(1)小鼠空腹血糖水平檢測將所有待實驗的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食(不禁水)，即禁食6小時后開始實驗操作。①血糖儀準備：檢查血糖儀(美國強生公司，ONETOUCH)電池，按右側(cè)開關(guān)，將試紙正確放入左側(cè)插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應代碼的數(shù)字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀進入待測狀態(tài)。②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對折，用拇指和食指捏住毛巾對折處，將鼠頭部和身體包入手掌內(nèi)的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。④血糖檢測：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計時5秒顯示讀數(shù)。(2)血清胰島素水平檢測①試劑及耗材準備：樣品(冰凍血清)，去離子水一瓶(1000mL)，小鼠胰島素ELISA試劑盒(Millipore，貨號EZRMI-13K)含胰島素ELISA酶標板(1塊，儲存于2-8℃)、酶標板封口膜(1片)、10×HRP洗脫緩沖液(2瓶，每瓶50mL,使用前使用去離子水稀釋10倍)、胰島素標準品(濃度為：0.2，0.5，1，2，5，10ng/mL，每種量為0.25mL)、胰島素質(zhì)量對照buffer(0.25mL)、基質(zhì)溶液(0.5mL)、分析緩沖液(20mL)、胰島素檢測抗體(10mL)、酶溶液(12mL)、底物(12mL)、終止溶液(12mL)。②實驗步驟：A.確認溫箱開啟，熟悉酶標儀操作，將待檢測的血清標本從-80℃冰箱中找出；B.將待檢測的血清在室溫下復融至液態(tài)，準備檢測；C.稀釋10×HRP洗脫緩沖液，每瓶用450mL去離子水稀釋；D.將取下來的酶標板條安裝到一個空的酶標板架上300μLTBS洗脫緩沖液洗滌3次。洗滌完畢將酶標板倒扣在吸水紙上，輕輕拍幾次，將殘液吸凈(注意：在進行下一步之前避免酶標板干燥，將未使用的酶標板條密封在裝酶標板的袋子里，2-8℃保存)；E.將10μL分析緩沖液加入非特異性孔(NSB)和所有的樣品孔；F.在NSB孔，標準孔和對照孔加入10μL基質(zhì)溶液；G.在預設的標準孔里加入10μL胰島素標準品；H.在預設的質(zhì)量對照孔里加入胰島素質(zhì)量對照buffer1和2各10μL；I.在每個樣品孔里加入10μL樣品；J.每孔中加入80μL胰島素檢測抗體(以上所有加樣步驟在1個小時之內(nèi)完成，室溫孵育2小時，在此期間將酶標板至于酶標板振蕩器上，調(diào)整轉(zhuǎn)速為400-500rpm震蕩)；K.取下封口膜，棄去液體，在吸水紙上輕輕拍打，吸凈殘液；L.使用洗脫緩沖液洗板3次，每次300μL，每次洗板完畢都用吸水紙吸去殘液；M.每孔加入酶溶液100μL，封口膜封口后，室溫下酶標板振蕩器震蕩30分鐘，取下封口膜，棄去溶液，拍打吸干；N.使用洗脫緩沖液洗板6次，每次300μL，每次洗板完畢都用吸水紙吸去殘液加入100μL底物溶液，酶標板震蕩器上震蕩15分鐘左右。此時可以看到標準孔出現(xiàn)深淺漸變的藍色。(注意：在這一步，藍色的出現(xiàn)和進展可能明顯快于15分鐘，也可能明顯慢于15分鐘，取決于室溫溫度。請通過視覺來判斷孵育的時間?；蛘呤褂妹笜藘x370nm波長檢測，讀數(shù)在1.2到1.8之間，則為合適的孵育時間)O.加入100μL終止溶液，震蕩酶標板確保充分的混勻，此時藍色變?yōu)辄S色。5分鐘內(nèi)在450nm和590nm處分別讀取吸光值。根據(jù)測定的標準曲線，通過吸光值換算出濃度。Ⅱ型糖尿病損傷嚴重程度的評估指標主要包括體重、血糖等水平，這些指標均與糖尿病嚴重程度正相關(guān)。血糖變化結(jié)果如圖1所示，WT小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，經(jīng)空腹血糖檢測發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠從第2周開始的空腹血糖水平及血清胰島素水平明顯較相應NC對照組升高，HFD組的DUSP14-KO小鼠空腹血糖水平及血清胰島素水平也明顯高于WT組小鼠(見圖2A、B)。表明DUSP14基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，DUSP14基因能顯著提高小鼠的糖代謝能力，表明DUSP14基因能顯著抑制高脂誘導引起的Ⅱ型糖尿病?！緦嵤├?】葡萄糖耐量實驗(intraperitonealglucosetolerancetest，IPGTT)實驗第12周，進行腹腔注射葡萄糖實驗(IPGTT)，以評價小鼠機體對糖耐受能力。(1)在測血糖之前，先測量小鼠的空腹體重，根據(jù)10μL/g計算葡萄糖的注射體積。(2)先檢測葡糖糖注射前即0分鐘時空腹血糖，在檢測完畢后迅速經(jīng)腹腔注射葡萄糖液。(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進針定位及注射：從腹部一側(cè)進針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進針，回抽，注射時針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過腹中線后在腹部另一側(cè)進入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。(4)分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時間點剪尾測小鼠血糖值，并記錄血糖數(shù)值和檢測時間。進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗(intraperitonealglucosetolerancetests，IPGTT)來評估各組小鼠對葡萄糖的處理能力，在實驗第12周，通過注射1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的WT小鼠和DUSP14-KO小鼠血糖水平在15分鐘時間點劇增達到峰值，隨著時間推移至注射后30分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空腹血糖水平(0分鐘時血糖)，在2小時時恢復至空腹血糖水平，且DUSP14-KO小鼠血糖水平從0分鐘至2小時一直處于高于WT小鼠的血糖水平(圖3A)。比較各組小鼠血糖曲線下面積(areaunderthecurve，AUC)，發(fā)現(xiàn)WT小鼠HFD組的AUC顯著高于NC組，DUSP14-KOHFD組的AUC顯著大于WTHFD組的AUC(圖3B)，表明DUSP14對維持糖代謝穩(wěn)態(tài)具有強大的調(diào)控能力?！緦嵤├?】肝臟大體外觀及肝臟組織脂質(zhì)成分及脂質(zhì)代謝情況測定(1)終末肝臟組織取材1)小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤濕。2)用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。3)迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速拍照，稱重。(2)小鼠肝組織脂質(zhì)檢測1)從-80℃冰箱取出肝臟組織樣品，稱量50mg組織，使用研磨器將肝臟組織研磨成粉末狀，溶于1mLPBS中，混勻后再與1mL氯仿/甲醇(2:1)共孵育過夜。2)以12000g高速離心15min后，收集管底脂質(zhì)層物質(zhì)，風干，以去除水分。3)將分離出的脂質(zhì)層物質(zhì)溶于200μL含1％TritonX-100的PBS溶液中，仔細吹吸混勻。4)開啟電腦labman軟件，打印機，再開啟生化分析儀；5)選擇并清洗檢測探針、比色杯等，保證探針通暢、比色杯無雜質(zhì)附著，吸光值在設定的參考范圍；6)在labman軟件上檢查所需檢測指標試劑是否足夠，設定檢測指標和檢測順序等。7)將制得的混勻液上機檢測，分析。結(jié)果見圖4所示，在HFD組的DUSP14-KO小鼠無論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較HFD組的WT小鼠高。而如圖5所示，從肝脂的結(jié)果所示，HFD組的DUSP14-KO小鼠均較HFD組的WT小鼠高，這些結(jié)果說明DUSP14基因敲除小鼠的脂肪肝明顯惡化。上述結(jié)果顯示DUSP14-KO小鼠在HFD的誘導下發(fā)生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病變顯著加重。這些結(jié)果表明DUSP14基因?qū)Ω纳脾蛐吞悄虿『椭靖尉哂酗@著的作用。本發(fā)明結(jié)果說明DUSP14基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有著重要的保護作用。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>武漢大學<120>雙特異性磷酸酶14在治療非酒精性脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應用<160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>28<212>DNA<213>DUSP14-sRNA1<400>1ggataagtcattttctattgaccattgg28<210>2<211>28<212>DNA<213>DUSP14-sRNA2<400>2ggttctcccgagagggtttctacgctgg28<210>3<211>28<212>DNA<213>DUSP14LA-F<400>3ggggtaccccggctcaatgatttcctct28<210>4<211>29<212>DNA<213>DUSP14LA-R<400>4gcgtcgaccattgggagatgtagcctgca29<210>5<211>36<212>DNA<213>DUSP14M-F<400>5tctaccggtgtcaatagaaaatgacttatatgcttc36<210>6<211>30<212>DNA<213>DUSP14M-R<400>6gaccttaagtagaaaccctctcgggagaac30<210>7<211>25<212>DNA<213>DUSP14RA-F<400>7cgacgcgtcgctgggtgttcgggtt25<210>8<211>36<212>DNA<213>DUSP14RA-R<400>8ataagaatgcggccgccctggctgataaaagggaaa36當前第1頁1 2 3