本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體地講，miR-133小分子核酸藥物在制備抗胃癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，同時(shí)也是一種惡性程度極高的腫瘤，總體5年生存率只有20-30％。在我國(guó)，其發(fā)病率和死亡率均居所有惡性腫瘤的第2位。隨著標(biāo)準(zhǔn)的胃癌D2根治手術(shù)的規(guī)范性開展，以及各種新型放、化療手段的應(yīng)用，其臨床療效得到一定程度的提高。然而，即使在得到根治性切除且接受了規(guī)范的輔助性化療的情況下，仍有部分患者出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提示現(xiàn)有治療手段的局限性。目前認(rèn)為，胃癌是一種生物學(xué)異質(zhì)性很大的腫瘤，其發(fā)生由多種基因組和表觀遺傳學(xué)機(jī)制共同參與。因此，進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的細(xì)胞和分子機(jī)制，對(duì)于更精細(xì)化的診治這一頑疾，具有重要的科學(xué)意義和臨床實(shí)用價(jià)值。

microRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小片段RNA，其進(jìn)化保守，其通過(guò)與mRNA(messenger RNA)的3’非翻譯區(qū)(3’untranslational region，3’-UTR)相互作用從而調(diào)控mRNA的翻譯，進(jìn)而廣泛參與發(fā)育、腫瘤、炎癥等多種生物學(xué)活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在許多人類腫瘤中均有異常的表達(dá)，它們或通過(guò)改變癌基因或抑癌基因的表達(dá)，直接影響腫瘤的生長(zhǎng)、增殖和凋亡，或與腫瘤的表型、分期及患者生存有相關(guān)性，從而以早期診斷和監(jiān)測(cè)病情的生物標(biāo)志物的身份出現(xiàn)。

miR-133家族最早于2002年在小鼠肌肉發(fā)育過(guò)程研究中被鑒定發(fā)現(xiàn)，其序列在物種中高度保守。在人類基因組中，miR-133家族包含三個(gè)家族成員：miR-133-a-1、miR-133a-2和miR-133b，它們依次分別位于第18、20和6號(hào)染色體上。miR-133的成熟序列包括miR-133a-3p和miR-133b，其均為miR-133的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-miRNA)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的3’端剪切而來(lái)，兩個(gè)成熟序列在結(jié)構(gòu)上高度同源，只有3’端存在一個(gè)堿基的差異。研究證實(shí)，miR-133的表達(dá)異常與多種骨骼肌和心肌的疾病相關(guān)。近年來(lái)，miR-133在 腫瘤領(lǐng)域中的作用亦被逐步揭示，包括膀胱癌、前列腺癌和胃癌。例如，在人膀胱癌中，miR-133a可以直接靶向并調(diào)節(jié)癌基因GSTP1的表達(dá)，而miR-133a的下調(diào)表達(dá)則通過(guò)增強(qiáng)GSTP1介導(dǎo)的抗凋亡效應(yīng),從而促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生發(fā)展(Uchida等，MiR-133a induces apoptosis through direct regulation of GSTP1in bladder cancer cell lines，Urol Oncol，31卷1期)。在胃癌中，miR-133的表達(dá)與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度及外周器官轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)性，其功能異常是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(Cheng等，miR-133is a key negative regulator of CDC42-PAK pathway in gastric cancer，Cell Signal，26卷12期)。然而，miR-133在胃癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色、確切的分子生物學(xué)機(jī)制以及是否可以作為小分子核酸藥物用于臨床治療胃癌尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，提供了微小RNA-miR-133的新的醫(yī)藥用途，具體是指miR-133在惡性腫瘤分子靶向治療中的應(yīng)用；本發(fā)明還揭示了miR-133小分子核酸藥物在胃癌治療中的潛在價(jià)值。

本發(fā)明的第一方面，提供了miR-133的新的醫(yī)藥用途，具體是指miR-133在制備抗胃癌藥物中的應(yīng)用；所述的miR-133的序列如下：

miR-133a-3p：5’-UUUGGUCCCUUCAACCAGCUG-3’(SEQ ID NO.1)

miR-133b：5’-UUUGGUCCCUUCAACCAGCUA-3’(SEQ ID NO.2)

上述miR-133a-3p和miR-133b在制備抗胃癌藥物中可以單獨(dú)應(yīng)用或同時(shí)應(yīng)用。

所述的藥物，是指能夠提高或增加miR-133a-3p或/和miR-133b的表達(dá)量的試劑。

本發(fā)明中提及的miR-133b/a-3p，即指miR-133a-3p或/和miR-133b。

所述的藥物能夠通過(guò)靶向抗凋亡分子Mcl-1和Bcl-xL抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

所述的抗胃癌是指預(yù)防或治療胃癌。

所述的miR-133是包括但不限于：miR-133序列、特異性干擾miR-133基因表達(dá)、加工的小干擾分子，如siRNA分子、miRNA分子、反義核苷酸等,miR-133序列的表達(dá)質(zhì)粒及其高表達(dá)腺病毒與慢病毒。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述的miR-133體內(nèi)表達(dá)試劑為 AgomiR-133(購(gòu)自廣州銳博公司)。

本發(fā)明中，所述的藥物是指以miR-133為唯一活性成份，或者是含有miR-133的藥物組合物。

所述的藥物組合物是指含有有效量的所述的miR-133或其抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。

所述的藥物是指miR-133或含有miR-133序列的miR-133體內(nèi)活性成分AgomiR-133，具有抗腫瘤活性，可用于臨床治療胃癌。

上述含有miR-133序列的miR-133體內(nèi)活性成分AgomiR-133為AgomiR-133b/a-3p，具體合成方法為：

Agomir-133的序列基于miR-133b/a-3p的成熟序列合成后，在3’端連接一個(gè)膽固醇分子，協(xié)助核酸進(jìn)入細(xì)胞。5’端前兩個(gè)核苷酸與3’端四個(gè)核苷酸之間通過(guò)硫代反應(yīng)加入硫代骨架修飾，全部核苷酸分子都進(jìn)行甲基化修飾，用來(lái)增強(qiáng)小分子核酸的穩(wěn)定性。

所述“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。

所述“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。

任何適用的給藥途徑都是可以的，包括但不限于：口服、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉給予、局部給予、植入、緩釋給予、心臟內(nèi)給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。

有益效果

本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，在胃癌發(fā)生過(guò)程中，miR-133的表達(dá)受到顯著抑制；恢復(fù)miR-133的表達(dá)可以通過(guò)靶向抗凋亡分子Mcl-1和Bcl-xL抑制胃癌細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

本發(fā)明為胃癌的臨床治療提供了新的潛在分子靶點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1.在胃癌中miR-133b/a-3p表達(dá)顯著下調(diào)

(A)14對(duì)胃癌標(biāo)本的miRNA組的熱力圖分析。所示結(jié)果為每例樣本讀取值的log2對(duì)數(shù)，并與單純計(jì)數(shù)板讀取值進(jìn)行標(biāo)化。熱力圖分析通過(guò)帶有DESeq包的R軟件完成(padj＜0.05，log2倍數(shù)變化＞3)。RNA序列從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù) 下載得到。(B)qRT-PCR方法對(duì)正常胃黏膜永生細(xì)胞GES和胃癌細(xì)胞系SGC7901和MNK45中miR-133b/a-3p的表達(dá)進(jìn)行定量。U6snRNA的表達(dá)作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝5)的形式表達(dá)，**，p<0.01。(C)qRT-PCR方法對(duì)臨床獲取的20例胃癌及相應(yīng)的正常胃組織中miR-133b/a-3p的表達(dá)進(jìn)行定量分析。miR-133b/a-3p的表達(dá)以U6作為內(nèi)參。

圖2.組蛋白修飾介導(dǎo)胃癌發(fā)生過(guò)程中miR-133b/a-3p的下調(diào)

(A)qRT-PCR方法檢測(cè)GES細(xì)胞系中miR-133的三個(gè)前體Pri-miR-133a-1,pri-miR-133a-2and pri-miR-133b的表達(dá)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝5)的形式表達(dá)。(B)qRT-PCR方法檢測(cè)胃癌細(xì)胞系SGC7901和MNK45中miR-133的三個(gè)前體Pri-miR-133a-1,pri-miR-133a-2and pri-miR-133b的表達(dá)。GES細(xì)胞系作為對(duì)照。數(shù)據(jù)表達(dá)形式同(A)，**，p<0.01。(C)對(duì)胃癌細(xì)胞分別以DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷(10nM)、組蛋白甲基化抑制劑DZNep(10nM)或組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA(10nM)處理一段時(shí)間，qRT-PCR檢測(cè)miR-133b/a-3p的表達(dá)情況。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝3)的形式表達(dá)，**，p<0.01。(D)對(duì)正常胃組織永生細(xì)胞和胃癌細(xì)胞系進(jìn)行ChIP分析，RT-PCR法對(duì)miR-133a-1和miR-133b啟動(dòng)子區(qū)域H3Kme3、H3K27me3、H3乙?；虷4乙?；竭M(jìn)行分析。數(shù)據(jù)表達(dá)形式同(C)，**，p<0.01。

圖3.miR-133b/a-3p降低細(xì)胞活性并促進(jìn)細(xì)胞凋亡

(A)SGC7901和MNK45細(xì)胞按照5：4的比例轉(zhuǎn)染miR-133a-3p和miR-133b的混合物，使終濃度為20nM或100nM。轉(zhuǎn)染后36小時(shí)，采用qRT-PCR方法檢測(cè)miR-133b/a-3p的表達(dá)量。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝5)的形式表達(dá)。(B)SGC7901和MNK45細(xì)胞按照(A)中的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，采用CCK8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。數(shù)據(jù)表達(dá)形式同(A)，**，p<0.01。(C)以20nM濃度的miR-133b/a-3p轉(zhuǎn)染細(xì)胞72小時(shí)，然后對(duì)細(xì)胞采用Annexin V和PI染色，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。Annexin V陽(yáng)性同時(shí)PI陰性的細(xì)胞被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝3)的形式表達(dá)，**，p<0.01。(D)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法同(C)，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清和低氧培養(yǎng)24小時(shí)。采用TUNEL染色法分析凋亡細(xì)胞，以紅色箭頭指示。TUNEL(綠色)、DAPI(藍(lán)色)。圖4.miR-133b/a-3p直接靶向抗凋亡分子Mcl-1和Bcl-xL。

(A)所示為miR-133b/a與其靶位點(diǎn)配對(duì)結(jié)合的示意圖，該圖經(jīng)由TargetScan網(wǎng)站下載(www.targetscan.org)。(B)按照相關(guān)步驟，HEK293細(xì)胞(1× 10⁴)共轉(zhuǎn)染100ng pMIR-Mcl-1的3’-UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和40ng pTK-Renilla-熒光素酶質(zhì)?；蚱浣Y(jié)合段突變的報(bào)告質(zhì)粒與對(duì)照或miR-133b/a-3p(終濃度20nM)共轉(zhuǎn)染。24小時(shí)后，檢測(cè)熒光素活性并與Renilla熒光素活性進(jìn)行標(biāo)化。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝3)的形式表達(dá)，**，p<0.01。(C)HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染pMIR-Bcl-xL 3’-UTR區(qū)熒光報(bào)告質(zhì)粒和相應(yīng)RNA。熒光素活性檢測(cè)方法同(B)。(D)SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染20nM miR-133b/a-3p，36小時(shí)后通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)Mcl-1和Bcl-xL兩個(gè)靶分子RNA水平的表達(dá)，通過(guò)western blot方法檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。(E)MNK45細(xì)胞接受如(D)中SGC7901同樣的處理，36小時(shí)后通過(guò)qRT-PCR方法檢測(cè)Mcl-1和Bcl-xL兩個(gè)靶分子RNA水平的表達(dá)，通過(guò)western blot方法檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。(F)檢測(cè)I期到IIIB期不同分期的代表性胃癌標(biāo)本中Mcl-1和Bcl-xL的表達(dá)，miR-133b/a-3p的表達(dá)在圖下方顯示。N代表相應(yīng)的周圍正常胃組織，T代表胃癌組織。

圖5.miR-133b/a-3p抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，其下調(diào)與胃癌進(jìn)展顯著相關(guān)。

(A)miR-133對(duì)裸鼠荷瘤動(dòng)物成瘤的生物學(xué)作用。同一只裸鼠的兩側(cè)后肢外側(cè)分別皮下注射1×10⁶個(gè)SGC7901或MNK45細(xì)胞，而后通過(guò)小鼠尾靜脈注射AgomiR-133b/a-3p或AgomiR-NC，濃度均為每只小鼠5nM，每周一次。在指定時(shí)間測(cè)量腫瘤體積。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝5)的形式表達(dá)。*，p<0.05；**，p<0.01。(B)采用qRT-PCR方法對(duì)小鼠成瘤瘤體內(nèi)miR-133b/a-3p的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝5)的形式表達(dá)。**，p<0.01。(C)采用免疫組化方法對(duì)小鼠成瘤瘤體內(nèi)Bcl-xL and Mcl-1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

除非另有描述，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的。這些技術(shù)在下列文獻(xiàn)中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編輯1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編輯，1984)；《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins編輯.1984)；《蛋白質(zhì)純化：原理和實(shí)踐》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手 冊(cè)》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell編輯1986)。或者，可按照試劑生產(chǎn)商所提供的說(shuō)明書進(jìn)行。

除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

實(shí)施例1

本發(fā)明人調(diào)閱下載癌癥基因組圖集(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中包含14對(duì)胃癌標(biāo)本的miRNA數(shù)據(jù)資料，通過(guò)R語(yǔ)言對(duì)顯著差異性表達(dá)的miRNA進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照樣本相比，胃癌組織中的miR-133-a-1、miR-133a-2和miR-133b均發(fā)生顯著下調(diào)(圖1A)。

進(jìn)而，我們體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系SGC7901和MNK45，以正常胃壁組織永生細(xì)胞系GES作為對(duì)照，通過(guò)qRT-PCR方法對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞系中miR-133的成熟片段miR-133b/a-3p的表達(dá)較對(duì)照細(xì)胞GES亦顯著下調(diào)(圖1B)。

為了進(jìn)一步證實(shí)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們采集20例臨床胃癌冰凍組織標(biāo)本(標(biāo)本來(lái)源于上海長(zhǎng)征醫(yī)院普外二科(胃腸外科)，經(jīng)病理科醫(yī)生明確診斷為胃癌)，發(fā)現(xiàn)癌組織中miR-133b/a-3p的表達(dá)顯著低于同一個(gè)體中正常對(duì)照組織中的表達(dá)量(圖1C)。以上結(jié)果提示，在胃癌發(fā)生過(guò)程中，miR-133b/a-3p的表達(dá)會(huì)發(fā)生下調(diào)。

本發(fā)明人研究了miR-133b/a-3p在胃癌組織中發(fā)生穩(wěn)定下調(diào)的分子機(jī)制。因?yàn)樵谌祟惢蚪M中，共有三個(gè)miR-133的前體，即miR-133a-1(18號(hào)染色體)，miR-133a-2(20號(hào)染色體)and miR-133b(6號(hào)染色體)。我們首先分析了成熟的miR-133b/a-3p的來(lái)源，通過(guò)對(duì)GES細(xì)胞系中三個(gè)miR-133前體的qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)miR-133b/a-3p主要來(lái)源于miR-133a-1和miR-133b(圖2A)。而胃癌細(xì)胞系中miR-133前體miR-133a-1和and miR-133b的表達(dá)同樣顯著低于其在GES細(xì)胞系中(圖2B)。鑒于表觀遺傳學(xué)修飾在miRNA表達(dá)調(diào)控中的重要作用，我們研究了DNA甲基化、組蛋白甲基化和組蛋白乙酰化三種表觀遺傳修飾在miR-133表達(dá)調(diào)控中的作用。發(fā)現(xiàn)組蛋白甲基化抑制劑DZNep和組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA均可以顯著增加胃癌細(xì)胞系中miR-133b/a-3p的表達(dá)，而DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷則不影響 miR-133b/a-3p的表達(dá)(圖2C)，提示組蛋白修飾參與了miR-133b/a-3p的表達(dá)調(diào)控。進(jìn)而，我們采用染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)方法對(duì)miR-133a-1和miR-133b啟動(dòng)子區(qū)域的表觀遺傳學(xué)修飾水平進(jìn)行定量檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的兩個(gè)位點(diǎn)H3K4me3甲基化水平和H3乙?；骄@著降低；相反，與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的位點(diǎn)H3K27me3甲基化水平則顯著升高(圖2D)。相似的，胃癌細(xì)胞系中miR-133b的H3乙?；斤@著降低而H3K27me3甲基化水平顯著升高。因此，我們的研究證實(shí)，miR-133的下調(diào)是組蛋白修飾介導(dǎo)的而與DNA的甲基化無(wú)關(guān)。

為了研究在胃癌中miR-133下調(diào)所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，我們合成了miR-133的擬似物(mimics)用于體外高表達(dá)miR-133(圖3A)。使用interferin轉(zhuǎn)染試劑將miR-133mimics或miR-133抑制劑(inhibitor)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系后，采用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)miR-133的表達(dá)可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖(圖3B)。進(jìn)而，我們將胃癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-133，72小時(shí)后通過(guò)Annexin V和PI凋亡染色，并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-133后可以顯著增加Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞的比例(圖3C)，提示miR-133能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。為了驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了TUNEL和DAPI的雙重染色，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-133的胃癌細(xì)胞培養(yǎng)中觀察到許多凋亡小體，而轉(zhuǎn)染對(duì)照組則僅觀察到極少量的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(圖3D)。上述研究結(jié)果提示，miR-133可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

進(jìn)一步我們探討了miR-133作用的靶分子。雖然既往研究報(bào)道過(guò)一些miR-133的靶點(diǎn)，本研究中我們首先通過(guò)TargetScan(www.targetscan.Org)在線軟件分析其作用的靶點(diǎn)，結(jié)合前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)Mcl-1和Bcl-xL(圖4A)可能是miR-133發(fā)揮抗腫瘤作用的靶點(diǎn)；因?yàn)檫@兩個(gè)分子都與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。通過(guò)構(gòu)建上述分子的雙熒光報(bào)告基因表達(dá)載體，我們發(fā)現(xiàn)miR-133在Mcl-1和Bcl-xL的3’UTR區(qū)域存在保守的靶位點(diǎn)。根據(jù)雙熒光報(bào)告基因的檢測(cè)結(jié)果，我們證實(shí)miR-133的作用靶點(diǎn)是抗凋亡分子Mcl-1和Bcl-xL(圖4B-C)。進(jìn)一步通過(guò)qPCR和Western Blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)染miR-133的擬似物能夠降低胃癌細(xì)胞系中Mcl-1和Bcl-xL蛋白水平的表達(dá)但不影響mRNA水平的表達(dá)(圖4D-E)，提示miR-133可能通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯而不影響mRNA的降解。此外，在這些可用的胃癌臨床標(biāo)本中，我們發(fā)現(xiàn)Mcl-1和Bcl-xL的表達(dá)與miR-133的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)性，并與胃癌疾病的進(jìn)展相關(guān)(圖4F)。上述結(jié)果提示， miR-133通過(guò)直接靶向Mcl-1和Bcl-xL的3’UTR區(qū)域發(fā)揮作用。

最后，我們通過(guò)構(gòu)建胃癌裸鼠荷瘤動(dòng)物模型，對(duì)miR-133的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)進(jìn)行了研究。我們首先合成了miR-133的體內(nèi)活性藥物膽固醇連接的miR-133(AgomiR-133b/a-3p)及其空白對(duì)照agomiR-NC。將1×10⁶胃癌細(xì)胞皮下注射于裸鼠的后肢后，每次一次通過(guò)尾靜脈注射AgomiR-133b/a-3p共6周，觀察對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響。發(fā)現(xiàn)AgomiR-133b/a-3p可以顯著延遲腫瘤成瘤時(shí)間及腫瘤大小。最后我們處死小鼠，獲取腫瘤組織標(biāo)本，進(jìn)行qPCR和組織病理學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)AgomiR-133b/a-3p處理的小鼠其miR-133的水平顯著升高，伴隨Mcl-1和Bcl-xL的表達(dá)顯著下降，與體外實(shí)驗(yàn)相吻合。綜上所述，我們得出結(jié)論，miR-133可以抑制胃癌腫瘤生長(zhǎng)，可以作為治療胃癌的一種潛在的靶向藥物。

實(shí)施例2：體外實(shí)驗(yàn)中高表達(dá)miR-133對(duì)胃癌細(xì)胞的影響

委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成miR-133的擬似物(mimics)，序列如下：

UUUGGUCCCUUCAACCAGCUG(SEQ ID NO.1)

或UUUGGUCCCUUCAACCAGCUA(SEQ ID NO.2)。

實(shí)驗(yàn)方法：

1、胃癌細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：胃癌細(xì)胞SGC7901與MNK45購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，使用含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每36h進(jìn)行1:3傳代。細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用INTERFERin轉(zhuǎn)染試劑(購(gòu)自Polyplus-transfection公司)并按試劑說(shuō)明書轉(zhuǎn)染RNA。

2、實(shí)時(shí)定量RT-PCR：細(xì)胞總RNA使用TRIzol(Invitrogen)抽提，總mNRA使用Fast200試劑盒(購(gòu)自上海飛捷生物)抽提。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR試劑盒(Takara)并在LightCycler(Roche)實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成。miRNA的相對(duì)定量使用2^-ΔΔCt法計(jì)算(U6為內(nèi)參)，mRNA的相對(duì)定量使用GAPDH作為內(nèi)參照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：使用INTERFERin轉(zhuǎn)染試劑將miR-133mimics或miR-133inhibitor轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系后，采用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)miR-133的表達(dá)可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖(圖3B)。進(jìn)而，我們將胃癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miR-133，72小時(shí)后通過(guò)Annexin V和PI凋亡染色，并進(jìn)行流式細(xì) 胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-133后可以顯著增加Annexin V陽(yáng)性細(xì)胞的比例(圖3C)，提示miR-133能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。為了驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了TUNEL和DAPI的雙重染色，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-133的胃癌細(xì)胞培養(yǎng)中觀察到許多凋亡小體，而轉(zhuǎn)染對(duì)照組則僅觀察到極少量的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(圖3D)。上述研究結(jié)果提示，miR-133在體外實(shí)驗(yàn)中可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

實(shí)施例3：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中高表達(dá)miR-133可以抑制胃癌生長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)方法：

1、將SGC7901或MNK45細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，以無(wú)菌注射器將1×10⁶個(gè)細(xì)胞通過(guò)皮下注射方法接種于裸鼠右側(cè)腋下，以制作胃癌裸鼠荷瘤動(dòng)物模型。核酸藥物AgomiR-133(購(gòu)自廣州銳博公司)尾靜脈注射進(jìn)胃癌裸鼠荷瘤動(dòng)物模型體內(nèi)。

2、實(shí)時(shí)定量RT-PCR：細(xì)胞總RNA使用TRIzol(Invitrogen)抽提，總mNRA使用Fast200試劑盒(購(gòu)自上海飛捷生物)抽提。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR試劑盒(Takara)并在LightCycler(Roche)實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成。miRNA的相對(duì)定量使用2-ΔΔCt法計(jì)算(U6為內(nèi)參)。

3、免疫組化：

1)取小鼠腫瘤組織，石蠟包埋，切片，烤片60℃，1h；

2)脫蠟及復(fù)水：二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自來(lái)水1min，雙氧水1min；

3)1份30％H₂O₂加10份蒸餾水，室溫10min，蒸餾水洗3次，每次3min；

4)抗原修復(fù)：將切片浸入0.01M枸櫞酸緩沖液，微波中最大火力(98℃-100℃)加熱至沸騰，冷卻(約5-10min)，反復(fù)兩次；

5)將切片自然冷卻至室溫，PBS洗滌3次，每次5min；

6)封閉，5％BSA，室溫20min，甩去多余液體；

7)滴加一抗(MCL-1與Bcl-xL)，37℃，1h，或者4℃過(guò)夜；

8)PBS洗滌3次，每次3min；

9)滴加二抗，37℃，15-30min；

10)PBS洗滌3次，每次3min；

11)滴加SABC，37℃，30min；

12)PBS洗滌3次，每次5min；

13)1ml蒸餾水中分別滴加顯色劑，混勻；

14)DAB顯色劑配置好后，滴加于切片，室溫，鏡下檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間(約5min)；

15)自來(lái)水沖洗干凈，過(guò)蒸餾水；

16)蘇木素復(fù)染2min，自來(lái)水沖洗；

17)脫水：30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；

18)樹膠封片，鏡檢。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在胃癌裸鼠荷瘤動(dòng)物模型中，每周一次通過(guò)尾靜脈注射AgomiR-133b/a-3p共6周，觀察對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響。發(fā)現(xiàn)AgomiR-133b/a-3p可以顯著延遲腫瘤成瘤時(shí)間及腫瘤大小。最后我們處死小鼠，獲取腫瘤組織標(biāo)本，進(jìn)行qPCR和組織病理學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)AgomiR-133b/a-3p處理的小鼠其miR-133的水平顯著升高，伴隨Mcl-1和Bcl-xL的表達(dá)顯著下降，證明了miR-133的有效性。

以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說(shuō)明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。