本發(fā)明涉及一種藥物偶聯(lián)體，尤其涉及一種具有細(xì)胞內(nèi)吞介導(dǎo)功能的多靶向配體-藥物偶聯(lián)體，屬于生物醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：通常病變細(xì)胞的病理及生理特征都與正常細(xì)胞有顯著不同，其中之一表現(xiàn)為病變細(xì)胞表面具有特異性或過(guò)度表達(dá)的物質(zhì)(如：抗原，化學(xué)信號(hào)，受體等)，這些物質(zhì)在正常細(xì)胞中無(wú)表達(dá)或低表達(dá)。抗體藥物偶聯(lián)體(ADC)，多肽-藥物偶聯(lián)體(PDC)，就是基于這一原理對(duì)疾病進(jìn)行治療的。目前雖已有一些藥物上市或進(jìn)入臨床研究，但由于藥物設(shè)計(jì)原理的原因，ADC和PDC藥物在臨床應(yīng)用中均具有很大的局限性。ADC目前主要應(yīng)用于在腫瘤治療領(lǐng)域。其所使用的靶向抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原具有極高的親和力10-9～10-12(Kd，mole/Liter),因此其與目標(biāo)細(xì)胞高特異性結(jié)合的同時(shí)，對(duì)含有相同靶點(diǎn)的正常細(xì)胞也有較高的結(jié)合能力。同時(shí)由于ADC在體內(nèi)的代謝時(shí)間較長(zhǎng)(1-3周)，因此其在體內(nèi)留存的時(shí)間內(nèi)會(huì)不斷地殺傷正常細(xì)胞，極大的增大了藥物的毒副作用。因此其所適用的病癥必須是腫瘤和正常細(xì)胞表面抗原數(shù)量懸殊極大的，而目前所知滿足此要求的疾病很少。PDC在臨床或臨床前研究中用于治療多種疾病，例如CN104248770A、及CN102397554B中均有揭示相應(yīng)的多肽藥物，但這些只是簡(jiǎn)單的把化療藥物與多肽連接，或在包埋了化療藥物的納米顆粒或高分子材料里添加多肽，這樣帶來(lái)的缺點(diǎn)是，大部分多肽由于分子量較大及帶電荷的性質(zhì)導(dǎo)致其無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞，因 此目前此類(lèi)PDC大多數(shù)只適用于胞外治療，嚴(yán)重限制了PDC的應(yīng)用范圍和藥效。腫瘤細(xì)胞和其他病變細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞、腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞)表面存在著多種特異性或過(guò)表達(dá)受體，如鐵蛋白受體(TFR)、密度脂蛋白受體、葉酸受體、低、尿酸激酶受體、腫瘤壞死因子受體，ICAM，整合素受體LFA-1等。這些受體的配體可分為蛋白類(lèi)(鐵蛋白、載脂蛋白、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1即LRP1等)，多肽類(lèi)(胰島素、SOR-C13、黃體生成素釋放激素LHRH、生長(zhǎng)激素抑制素SST-14等)，小分子類(lèi)(葉酸及類(lèi)似物，糖類(lèi)化合物)。這些配體與受體結(jié)合具有特異性好、親和力適中和生物效應(yīng)明顯的特性，與治療性藥物偶聯(lián)形成配體-藥物偶聯(lián)體(LDC)可以明顯提高藥物的靶向性和藥效，同時(shí)降低毒性。其中蛋白類(lèi)配體由于分子量大不易人工合成，且穩(wěn)定性差。而多肽和小分子類(lèi)配體分子量較小，可化學(xué)合成，化學(xué)修飾改善特性，在體內(nèi)代謝較快，同時(shí)與受體親和力適中10-6～10-9(mole/liter,Kd)，因此其在特異性地結(jié)合病變細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)較低水平表達(dá)目標(biāo)受體的正常細(xì)胞的殺傷力大大降低。但此類(lèi)配體-藥物偶聯(lián)體在應(yīng)用過(guò)程中仍存在很多有待解決的問(wèn)題，如達(dá)不到治療窗口所需的較強(qiáng)的親和力，合適的半衰期和快速的細(xì)胞內(nèi)吞。因此它們偶聯(lián)常規(guī)化療藥物(如多柔比星，紫杉醇)時(shí)療效低，偶聯(lián)高效藥物分子(如ADC常用的藥物分子MMAE,DM1,等)后毒性大，未達(dá)到腫瘤治療有效劑量就導(dǎo)致動(dòng)物中毒死亡。因此需要通過(guò)改造LDC，使其可以作用于病變細(xì)胞表面廣泛存在的較高表達(dá)受體，拓寬靶向范圍和治療窗口，增強(qiáng)藥效、并避免藥物副作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于解決上述的技術(shù)問(wèn)題，提供一種具有細(xì)胞內(nèi)吞介導(dǎo)功能的多靶向配體-藥物偶聯(lián)體。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：一種具有細(xì)胞內(nèi)吞介導(dǎo)功能的多靶向配體-藥物偶聯(lián)體，所述藥物偶聯(lián)體包括藥物分子及與所述藥物分子偶聯(lián)的連接子，所述藥物偶聯(lián)體至少包括兩個(gè)以上能與細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合的配體，所述配體中至少包括有一個(gè)具有介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞功能第一配體，至少一個(gè)所述配體與第一配體之間可選擇性的與所述藥物分子或所述連接子偶聯(lián)形成藥物偶聯(lián)體。優(yōu)選地，所述配體為多肽、葉酸或葉酸類(lèi)似物，所述第一配體為葉酸、葉酸類(lèi)似物或具有介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞功能的多肽。優(yōu)選地，所述配體與所述第一配體中的葉酸類(lèi)似物均包括5-甲基四氫葉酸，5-甲?；臍淙~酸、磺胺、甲氨蝶呤、5,10-亞甲基四氫葉酸。優(yōu)選地，所述配體中多肽的序列為Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg，命名為P10。優(yōu)選地，所述第一配體中多肽的序列為Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，命名為P11。優(yōu)選地，所述第一配體中多肽的序列為Ala-Gly-[Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys]，命名為P12。優(yōu)選地，所述第一配體中多肽的序列為Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，命名為P13。優(yōu)選地，所述連接子為二肽序列的多肽類(lèi)連接子、二硫鍵連接子或pH依賴型連接子。優(yōu)選地，所述二肽序列為包含有纈氨酸-瓜氨酸、苯丙酰胺-賴氨酸、纈氨酸-賴氨酸序列，所述二硫鍵連接子為DMDS、MDS、DSDM、NDMDS，所述pH依賴型連接子為順烏頭酸酐。優(yōu)選地，所述多肽為序列與P10中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。優(yōu)選地，所述多肽為序列與P11中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。優(yōu)選地，所述多肽為序列與P12中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。優(yōu)選地，所述多肽為序列與P13中所述的序列至少保留有40％同源性的多肽。優(yōu)選地，所述第一配體為葉酸，配體為P10，連接子為MC-Val-Cit-PAB，藥物分子為MMAE時(shí)，所述藥物偶聯(lián)體的結(jié)構(gòu)式為：當(dāng)?shù)谝慌潴w為葉酸，配體為P11，連接子為MC-Val-Cit-PAB，藥物分子為MMAE時(shí)，所述藥物偶聯(lián)體的結(jié)構(gòu)式為：當(dāng)?shù)谝慌潴w為葉酸，配體為P12，連接子為MC-Val-Cit-PAB，藥物分子為MMAE時(shí)，所述藥物偶聯(lián)體的結(jié)構(gòu)式為：當(dāng)?shù)谝慌潴w為葉酸，配體為P13，連接子為MC-Val-Cit-PAB，藥物分子為MMAE時(shí)，所述藥物偶聯(lián)體的結(jié)構(gòu)式為：以上由于配體P11、P12、P13均同樣具有細(xì)胞內(nèi)吞功能，故和葉 酸進(jìn)行偶聯(lián)后，其兩者之間的協(xié)同效應(yīng)將會(huì)對(duì)最后偶聯(lián)體的藥物性能得到更好的提高。優(yōu)選地，所述一種具有細(xì)胞內(nèi)吞介導(dǎo)功能的多靶向配體-藥物偶聯(lián)體的應(yīng)用，所述多靶向配體-藥物偶聯(lián)體可應(yīng)用于腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、心血管疾病的治療。本發(fā)明的有益效果：1)靶向和內(nèi)吞結(jié)構(gòu)的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)以任何配體靶向的多肽做為制導(dǎo)部分，從而拓寬了此類(lèi)藥物的靶向范圍。2)利用雙(多個(gè))靶向配體增強(qiáng)藥物偶聯(lián)體對(duì)病變細(xì)胞的親和性和靶向性，從而可以攜帶高效的毒素藥物如MMAE，增強(qiáng)藥效并拓寬治療窗口避免藥物副作用。3)連接子在細(xì)胞外部(胞間質(zhì)、血液循環(huán)系統(tǒng)等)無(wú)法釋放藥物分子，保證了藥物在體內(nèi)循環(huán)時(shí)的穩(wěn)定性，并降低藥物毒性，不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。進(jìn)入靶向細(xì)胞內(nèi)部后，連接子裂解釋放出具有治療作用的藥物分子，可避免產(chǎn)生多藥耐藥性(MDR)。4)該偶聯(lián)體可以將藥物分子更換為多種化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有可以發(fā)生?；磻?yīng)的游離氨基，腫瘤、免疫治療、心血管疾病、抗生素等藥物，如美登素類(lèi)(MMAE，MMAF)、DM1、SiRNA等。此偶聯(lián)體不僅拓寬了LDC類(lèi)藥物的靶向范圍和治療窗口，而且增強(qiáng)了藥效、避免了毒副作用。附圖說(shuō)明圖1是兩個(gè)片段的親和性自由能關(guān)系示意圖。圖2是偶聯(lián)體在移植腫瘤動(dòng)物體內(nèi)濃度變化對(duì)比圖具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例具體說(shuō)明本發(fā)明的制備方法：本發(fā)明揭示了一種具有細(xì)胞內(nèi)吞介導(dǎo)功能的多靶向配體-藥物偶聯(lián)體，所述藥物偶聯(lián)體包括藥物分子及與所述藥物分子偶聯(lián)的連接子，所述藥物偶聯(lián)體還包括至少兩個(gè)與細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合的配體， 所述配體可以是多肽或小分子，其中至少一個(gè)配體同時(shí)擁有介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞功能，如葉酸及其類(lèi)似物，多肽P11，多肽P12。所述配體間可互相偶聯(lián)、并與藥物分子或/和連接子偶聯(lián)形成藥物偶聯(lián)體，或分別單獨(dú)與藥物分子和連接子之一偶聯(lián)形成藥物偶聯(lián)體。所述配體為葉酸或葉酸類(lèi)似物。所述葉酸類(lèi)似物包括5-甲基四氫葉酸，5-甲?；臍淙~酸、磺胺、甲氨蝶呤、5,10-亞甲基四氫葉酸。葉酸受體在多種癌細(xì)胞表面表達(dá)高于正常細(xì)胞，同時(shí)葉酸與受體結(jié)合后能介導(dǎo)偶聯(lián)體的內(nèi)吞。所以葉酸與葉酸類(lèi)似物是一個(gè)構(gòu)建雙靶向配體藥物偶聯(lián)體的很好結(jié)構(gòu)。所述作為配體的多肽序列為Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg，為Soricidin蛋白碳端的13個(gè)氨基酸SOR-C13，命名為P10(US7119168，US12/886397)。所述P10上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸進(jìn)行替換，在序列同源區(qū)間至少保留40％同源性。所述配體多肽序列為Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，即黃體生成素釋放激素LHRH(TrendsEndocrinolMetab,2004,15(7):300-310,ArchGynecolObstet,2012,286(2):437-442.)，命名為P11。所述P11上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸進(jìn)行替換，在序列同源區(qū)間至少保留40％同源性。所述配體多肽序列為Ala-Gly-[Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys],即生長(zhǎng)激素抑制素SST-14(Science，1973，179(68)：77-79)，命名為P12。所述P12上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸進(jìn)行替換，在序列同源區(qū)間至少保留40％同源性。所述配體多肽序列為Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys，即黃體生成素釋放 激素LHRH類(lèi)似物(TrendsEndocrinolMetab,2004,15(7):300-310,ArchGynecolObstet,2012,286(2):437-442.)，命名為P13。所述P13上的氨基酸序列可以以天然、非天然氨基酸進(jìn)行替換，在序列同源區(qū)間至少保留40％同源性。所述連接子為二肽序列的多肽類(lèi)連接子、二硫鍵連接子或pH依賴型連接子。具體的，所述二肽序列為包含有纈氨酸-瓜氨酸、苯丙酰胺-賴氨酸、纈氨酸-賴氨酸序列，所述二硫鍵連接子可為DSDM、DMDS、MDS，所述pH依賴型連接子為順烏頭酸酐。以上所述連接子的具體結(jié)構(gòu)式見(jiàn)下表1所示。表1：二硫鍵連接子的結(jié)構(gòu)式：由于本發(fā)明中的連接子需要在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)特定的條件如低PH裂解，二硫鍵還原，或溶酶體酶解后才能釋放所攜帶藥物，偶連體所攜帶的藥物在沒(méi)有釋放下來(lái)前是沒(méi)有毒性的，使得偶聯(lián)體具有較低的毒性，同時(shí)保證了本發(fā)明中藥物的穩(wěn)定性。所述藥物分子為具有治療作用的藥物基團(tuán)，包括細(xì)胞毒素(美登 素衍生物MMAE、MMAF，DM1，卡奇霉素、多卡霉素、阿多來(lái)新、安曲霉素等)、化療藥物(紫杉醇)、酶抑制劑、酶激動(dòng)劑，SiRNA或其他生物活性分子。其共同特點(diǎn)是化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有可以發(fā)生?；磻?yīng)的游離氨基，這些游離氨基被其他化學(xué)基團(tuán)修飾后，將顯著降低藥物的細(xì)胞毒性，并在去除化學(xué)基團(tuán)后可以恢復(fù)。以下闡述本發(fā)明的作用機(jī)理：首先，多靶向配體-藥物偶聯(lián)體進(jìn)入血液循環(huán)和細(xì)胞外部(胞間質(zhì))，由于連接子在胞外環(huán)境非常穩(wěn)定無(wú)法釋放藥物分子，則藥物分子的毒性被封閉。該偶聯(lián)體是一個(gè)無(wú)細(xì)胞毒性或低毒性的藥物，不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。接著，多靶向配體-藥物偶聯(lián)體與病變細(xì)胞上同時(shí)有高表達(dá)的多個(gè)受體結(jié)合，其協(xié)同效應(yīng)大大增加了偶聯(lián)體對(duì)靶向細(xì)胞的親和性，降低了與正常細(xì)胞結(jié)合的可能。從而可以攜帶高效的毒素藥物如MMAE，增強(qiáng)藥效并拓寬治療窗口避免藥物副作用。通過(guò)偶聯(lián)體上同時(shí)具有內(nèi)吞介導(dǎo)作用的配體的透膜遞送功能，偶聯(lián)體被靶向細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。進(jìn)入靶向細(xì)胞內(nèi)部后，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的變化(特異性酶切、pH變化、二硫鍵還原等)連接子可以裂解釋放出藥物分子(相當(dāng)于去除藥物分子的修飾基團(tuán))，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生治療作用。同時(shí)避免了多藥耐藥性(MDR)相關(guān)的藥物抗性。多靶向配體-藥物偶聯(lián)體是解決藥物靶向性差，從而拓寬治療窗口的有效方法。很多單配體藥物偶聯(lián)體在有療效藥物濃度時(shí)已有毒性，從而不能成藥。相對(duì)于單配體，多靶向配體-藥物偶聯(lián)體對(duì)靶向細(xì)胞的親和性應(yīng)有很大改善。從而可以攜帶高效的毒素藥物如MMAE，增強(qiáng)藥效并拓寬治療窗口避免藥物副作用。其中雙靶向也屬于多靶向中的一種，而雙靶向協(xié)同效應(yīng)的具體的原理可用片段藥物設(shè)計(jì)的 例子來(lái)解釋，假如一個(gè)藥物的兩個(gè)片段結(jié)合組成，這兩個(gè)片段連接后都可以正常和其受體結(jié)合部位結(jié)合，最后的化合物親和性應(yīng)該是兩個(gè)片段的親和性(Kd)的積而不是其和。這是因?yàn)镵d和結(jié)合的自由能是幾何關(guān)系如以下所示，ΔGAB＝ΔGA+ΔGB，RTln(K)＝-ΔGAB，KAB＝KAxKBKA＝2x103，KB＝5x103，KAB＝1x107現(xiàn)實(shí)中由于連接會(huì)影響兩個(gè)片段同時(shí)與其受體位點(diǎn)結(jié)合能力，最后化合物的親和性往往大大小于兩個(gè)片段Kd之積，但大于其之和，具體的協(xié)同關(guān)系如圖1所示。以下是第一配體為葉酸，配體為P10，連接子為MC-Val-Cit-PAB，藥物分子為MMAE時(shí)，具體闡述本發(fā)明的合成方法及過(guò)程：步驟一、Folate-NHS的合成將葉酸(44.1g，100mmol)溶解在2升DMSO中，然后用DCC(24.8g,120mmol)和NHS(23g，200mmol)混合，將混合物于常溫下避光攪拌18小時(shí)。過(guò)濾不溶物，真空抽干，得到膠狀固體。用冰乙醚洗3遍，抽干成黃色粉末，得到53.8g，無(wú)需進(jìn)一步純化，可以做下一步反應(yīng)。步驟二、P10保護(hù)肽樹(shù)脂的合成稱取替代度為1.1mmol/g的WangResin100g于固相反應(yīng)柱中，加入DMF，氮?dú)夤呐萑苊?0分鐘；稱取Fmoc-Arg(pbf)-OH142.7g(220mmol)，HOBt35.6g(264mmol)，DMAP2.7g(22mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入40.8mlDIC(264mmol)，活化5分鐘，加入反應(yīng)柱，反應(yīng)3小時(shí)后，抽干，洗滌3遍。將104ml醋酸酐、88.5ml吡啶溶于500mlDMF中，混合加入以上洗滌后的樹(shù)脂，室溫封閉5h，DMF洗滌三次，甲醇收縮后抽干樹(shù) 脂，得到Fmoc-Arg(pbf)-WangResin，檢測(cè)替代度為0.53mmol/g。稱取Fmoc-Arg(pbf)-WangResin(Sub＝0.53mmol/g)37.7克(20mmol)于反應(yīng)柱中，用DMF清洗3次，再用DMF溶脹30分鐘。然后用DBLK脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，再用DMF洗滌6次。稱取Fmoc-Pro-OH20.2g(60mmol)，HOBt9.7g(72mmol)，用DMF溶解，0℃冰水浴下加入11.1mlDIC(72mmol)，活化5分鐘，加入反應(yīng)柱，反應(yīng)2小時(shí)，然后用DBLK脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。重復(fù)上述操作，按照肽序依次偶聯(lián)Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)–OH、Fmoc-Ser(tBu)–OH、Fmoc-Pro–OH、Fmoc-His(Trt)–OH、Fmoc-Leu–OH、Fmoc-Phe–OH、Fmoc-Glu(OtBu)–OH、Fmoc-Lys(Boc)–OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH,然后用DBLK脫除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，然后用DMF洗滌6次，用甲醇收縮兩次，抽干，獲得P10保護(hù)肽樹(shù)脂85.8g。步驟三、中間體Folate-P10(Folate-Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg-OH)的合成稱取Folate-NHS32.3g(60mmol)，用DMSO溶解，加入85.8g上述P10保護(hù)肽樹(shù)脂，反應(yīng)5分鐘，滴加21ml(120mmol)DIEA，室溫繼續(xù)反應(yīng)4h。DFM洗3遍，甲醇收縮，真空抽干，得到全保護(hù)肽樹(shù)脂320.3g。將上一步得到的肽樹(shù)脂80g加入到1000ml單口燒瓶中，預(yù)先配置裂解液640ml，TFA:苯甲硫醚:EDT:苯甲醚＝90:5:3：2(體積比)，將裂解液加入到燒瓶中，室溫反應(yīng)2.5小時(shí)，濾掉樹(shù)脂，樹(shù)脂用100mlTFA洗滌，合并濾液，加入到4500ml無(wú)水乙醚中析出黃色固體，離心，無(wú)水乙醚洗滌固體，真空干燥的到黃色固體40.6g，粗肽收率97.1％。HPLC純度76.3％。經(jīng)HPLC純化制備，凍干得到Folate-P1028.25g，純度為98.6％。步驟四、中間體(Mc-Val-Cit-PAB-MMAE)的合成稱取MMAE7.18g(10mmol)加入到250ml三口燒瓶中，用無(wú)水DMF溶解，N2保護(hù)室溫?cái)嚢柚脸吻?。加入Mc-Val-Cit-PAB-PNP7.37g，HOAt72mg(2mmol),反應(yīng)5分鐘，再滴加3.5ml(20mmol)DIEA，繼續(xù)室溫反應(yīng)30分鐘，升溫40～50度反應(yīng)至20h，期間通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。真空抽干DMF，通過(guò)進(jìn)一步純化得到產(chǎn)品Mc-Val-Cit-PAB-MMAE10.7g，純度為99.3％。步驟五、偶聯(lián)體LDC10B的合成：稱取上一步制備的得到Mc-Val-Cit-PAB-MMAE6.59g(5mmol)加入到5000ml單口燒瓶中，并加入3300ml磷酸緩沖液，攪拌，保持PH＝7.2至澄清，加入中間體10.5g(5.02mmol)Folate-P10，室溫反應(yīng)2h，期間HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)完全后，過(guò)濾，通過(guò)HPLC制備，凍干得到14.53gLDC10B,純度99.2％，收率為85.02％。同理，通過(guò)以上方法可獲得具有偶聯(lián)體LDC11B，LDC12B，LDC13B。LDC10B，LDC11B，LDC12B，LDC13B的化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別如下表2所示：表2：LDCB系列偶聯(lián)體化學(xué)結(jié)構(gòu)式示意表偶聯(lián)體性能測(cè)試：其中涉及的偶聯(lián)體為：LDC1為Folate-(PEG)3-MC-Val-Cit-PAB-MMAELDC10A為P10-MC-Val-Cit-PAB-MMAELDC11A為P11-MC-Val-Cit-PAB-MMAE偶聯(lián)體LDC10B細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)照樣品：MMAE，LDC1，LDC10A主要細(xì)胞株：人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，人肺癌細(xì)胞A549，人前列腺癌細(xì)胞PC-3，人胚腎細(xì)胞293A，人肺癌細(xì)胞H1299，慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562，人肺癌細(xì)胞H460，卵巢癌細(xì)胞SKOV3，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人胃癌細(xì)胞N87，人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3。培養(yǎng)基：RPMI1640Medium,nofolicacid實(shí)驗(yàn)方法：1)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，人肺癌細(xì)胞A549，人前列腺癌細(xì)胞PC-3，人胚腎細(xì)胞293A，人肺癌細(xì)胞H1299，慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562，人肺癌細(xì)胞H460，卵巢癌細(xì)胞SKOV3，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人胃癌細(xì)胞N87，人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3,細(xì)胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細(xì)胞2-3天傳一次。2)將人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，人肺癌細(xì)胞A549，人前列腺癌細(xì)胞PC-3，人胚腎細(xì)胞293A，人肺癌細(xì)胞H1299，慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562，人肺癌細(xì)胞H460，卵巢癌細(xì)胞SKOV3，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人胃癌細(xì)胞N87，人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3,以1×103個(gè)細(xì)胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2 下培養(yǎng)8-12個(gè)小時(shí)。3)向鋪好細(xì)胞的板中加入連續(xù)稀釋好的偶聯(lián)體藥物(加入藥物：吸出孔中培養(yǎng)液，將稀釋好的藥物樣品，100uL/well，并設(shè)對(duì)照)，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)半小時(shí)。半小時(shí)后，換無(wú)藥物培養(yǎng)液培養(yǎng)，150uL/well。在37℃，5％CO2下培養(yǎng)2-3天并觀察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)進(jìn)行顯色，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)箱中1個(gè)小時(shí)。5)在本酶標(biāo)儀上490nm對(duì)培養(yǎng)板進(jìn)行讀數(shù)，比較經(jīng)處理和未處理培養(yǎng)物的細(xì)胞存活，測(cè)定50％細(xì)胞死亡所需的LDC藥物濃度(IC50值)。結(jié)果與分析：LDC10B對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，人肺癌細(xì)胞A549，人前列腺癌細(xì)胞PC-3，人肺癌細(xì)胞H1299，慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562，人肺癌細(xì)胞H460，卵巢癌細(xì)胞SKOV3，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人胃癌細(xì)胞N87，人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3等大多種瘤細(xì)胞都有殺死腫瘤細(xì)胞抑制生長(zhǎng)，且IC50值低于LDC1，LDC10A對(duì)照。LDC10B是同時(shí)能和葉酸受體和SOR-C13受體結(jié)合的雙靶向雙靶向配體-藥物偶聯(lián)體。從表3結(jié)果可以看出其細(xì)胞毒性大于(IC50值小于)單配體偶聯(lián)體LDC1或LDC10A的近10倍，從而顯示出雙配體的協(xié)同效應(yīng)和對(duì)藥效的貢獻(xiàn)。表3:偶聯(lián)體LDC10B細(xì)胞活性(IC50值)對(duì)照表單位(摩爾/升，M)細(xì)胞名稱H1299K562H460SKOV3HCC1954N87SK-BR-3293AMMAE0.86×10-90.54×10-90.77×10-90.62×10-90.45×10-90.68×10-90.52×10-91.15×10-9LDC12.62×10-79.31×10-81.92×10-71.02×10-79.44×10-82.39×10-79.82×10-85.10×10-7LDC10A5.09×10-71.11×10-74.83×10-71.25×10-71.06×10-75.17×10-71.09×10-79.28×10-7LDC10B5.88×10-81.48×10-85.04×10-81.57×10-81.41×10-87.51×10-81.59×10-84.33×10-7LDC11B偶聯(lián)體對(duì)相關(guān)腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)樣品：LDC11B對(duì)照樣品：MMAE，LDC1，LDC11A主要細(xì)胞株：人子宮頸鱗癌細(xì)胞SIHA，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A，人肝癌細(xì)胞hepG2，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，人肺癌細(xì)胞A549，人前列腺癌細(xì)胞PC-3，人胚腎細(xì)胞293A，慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562，人肺癌細(xì)胞H460，卵巢癌細(xì)胞SKOV3，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3。培養(yǎng)基：RPMI1640Medium,nofolicacid實(shí)驗(yàn)方法：1)人子宮頸鱗癌細(xì)胞SIHA，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A，人肝癌細(xì)胞hepG2，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，人肺癌細(xì)胞A549，人前列腺癌細(xì)胞PC-3，人胚腎細(xì)胞293A，慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562，人肺癌細(xì)胞H460，卵巢癌細(xì)胞SKOV3，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3,細(xì)胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細(xì)胞2-3天傳一次。2)將人子宮頸鱗癌細(xì)胞SIHA，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A，人肝癌細(xì)胞hepG2，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，人肺癌細(xì)胞A549，人前列腺癌細(xì)胞PC-3，人胚腎細(xì)胞293A，慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562，人肺癌細(xì)胞H460，卵巢癌細(xì)胞SKOV3，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3,以1×103個(gè)細(xì)胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)8-12個(gè)小時(shí)。3)向鋪好細(xì)胞的板中加入連續(xù)稀釋好的偶聯(lián)體藥物(加入藥物：吸出孔中培養(yǎng)液，將稀釋好的藥物樣品，100uL/well，并設(shè)對(duì)照)， 在37℃，5％CO2下培養(yǎng)半小時(shí)。半小時(shí)后，換無(wú)藥物培養(yǎng)液培養(yǎng)，150uL/well。在37℃，5％CO2下培養(yǎng)2-3天并觀察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)進(jìn)行顯色，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)箱中1個(gè)小時(shí)。5)然后在本酶標(biāo)儀上490nm對(duì)培養(yǎng)板進(jìn)行讀數(shù)，比較經(jīng)處理和未處理培養(yǎng)物的細(xì)胞存活，測(cè)定50％細(xì)胞死亡所需的LDC藥物濃度(IC50值)。結(jié)果與分析：LDC11B對(duì)人子宮頸鱗癌細(xì)胞SIHA，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A，人肝癌細(xì)胞hepG2，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，人肺癌細(xì)胞A549，人前列腺癌細(xì)胞PC-3，人胚腎細(xì)胞293A，慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562，人肺癌細(xì)胞H460，卵巢癌細(xì)胞SKOV3，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3等大多種瘤細(xì)胞都有殺死腫瘤細(xì)胞抑制生長(zhǎng)，且IC50值低于LDC1，LDC11A對(duì)照，具體結(jié)果如表4所示。L11B是同時(shí)能和葉酸受體和LHRH受體結(jié)合的雙靶向雙靶向配體-藥物偶聯(lián)體。從表4結(jié)果可以看出其細(xì)胞毒性大于(IC50值小于)單配體偶聯(lián)體LDC1或LDC11A的近10倍，從而顯示出雙配體的協(xié)同效應(yīng)和對(duì)藥效的貢獻(xiàn)。表4：LDC11B偶聯(lián)體對(duì)相關(guān)腫瘤細(xì)胞毒性(IC50值)對(duì)照表單位(摩爾/升，M)細(xì)胞名稱H460SKOV3293AMMAE0.58×10-90.44×10-90.86×10-9LDC15.26×10-72.95×10-77.15×10-7LDC11A6.67×10-73.41×10-71.31×10-6LDC11B8.13×10-84.38×10-85.24×10-7LDC12B偶聯(lián)體對(duì)相關(guān)腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)樣品：LDC12B對(duì)照樣品：MMAE主要細(xì)胞株：人肺癌細(xì)胞H460，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人胃癌細(xì)胞N87。培養(yǎng)基：RPMI1640Medium,nofolicacid實(shí)驗(yàn)方法：1)人肺癌細(xì)胞H460，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人胃癌細(xì)胞N87，細(xì)胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細(xì)胞2-3天傳一次。2)將人肺癌細(xì)胞H460，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人胃癌細(xì)胞N87，以1×103個(gè)細(xì)胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)8-12個(gè)小時(shí)。3)向鋪好細(xì)胞的板中加入連續(xù)稀釋好的偶聯(lián)體藥物(加入藥物：吸出孔中培養(yǎng)液，將稀釋好的藥物樣品，100uL/well，并設(shè)對(duì)照)，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)半小時(shí)。半小時(shí)后，換無(wú)藥物培養(yǎng)液培養(yǎng)，150uL/well。在37℃，5％CO2下培養(yǎng)2-3天并觀察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)進(jìn)行顯色，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)箱中1個(gè)小時(shí)。5)在本酶標(biāo)儀上490nm對(duì)培養(yǎng)板進(jìn)行讀數(shù)，比較經(jīng)處理和未處理培養(yǎng)物的細(xì)胞存活，測(cè)定50％細(xì)胞死亡所需的LDC藥物濃度(IC50值)。結(jié)果與分析：LDC12B對(duì)人肺癌細(xì)胞H460，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人胃癌細(xì)胞N87等大多種瘤細(xì)胞都有殺死腫瘤細(xì)胞抑制生長(zhǎng)，具體結(jié)果如表5所示。表5：LDC12B偶聯(lián)體對(duì)相關(guān)腫瘤細(xì)胞毒性對(duì)照表細(xì)胞名稱HCT-116GTL-16HEC-1ASH-SY5YN87MMAE1.27×10-86.38×10-98.74×10-92.4×10-83.83×10-9LDC12B8.26×10-76.12×10-76.31×10-73.96×10-71.2×10-6LDC13B偶聯(lián)體對(duì)相關(guān)腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)樣品：LDC13B對(duì)照樣品：MMAE主要細(xì)胞株：人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1A，人前列腺癌細(xì)胞PC-3，人胃癌細(xì)胞N87。培養(yǎng)基：RPMI1640Medium,nofolicacid實(shí)驗(yàn)方法：1)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1A，人前列腺癌細(xì)胞PC-3，人胃癌細(xì)胞N87，細(xì)胞使用含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細(xì)胞2-3天傳一次。2)將人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1A，人前列腺癌細(xì)胞PC-3，人胃癌細(xì)胞N87，以1×103個(gè)細(xì)胞/孔加入到96孔板中，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)8-12個(gè)小時(shí)。3)向鋪好細(xì)胞的板中加入連續(xù)稀釋好的偶聯(lián)體藥物(加入藥物：吸出孔中培養(yǎng)液，將稀釋好的藥物樣品，100uL/well，并設(shè)對(duì)照)，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)半小時(shí)。半小時(shí)后，換無(wú)藥物培養(yǎng)液培養(yǎng)，150uL/well。在37℃，5％CO2下培養(yǎng)2-3天并觀察。4)用CellTiterAQueousOneSolutionCellProliferationAssay(Promega)進(jìn)行顯色，在37℃，5％CO2下培養(yǎng)箱中1個(gè)小時(shí)。5)在本酶標(biāo)儀上490nm對(duì)培養(yǎng)板進(jìn)行讀數(shù)，比較經(jīng)處理和未處 理培養(yǎng)物的細(xì)胞存活，測(cè)定50％細(xì)胞死亡所需的LDC藥物濃度(IC50值)。結(jié)果與分析：LDC13B對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116，人胃癌細(xì)胞株GTL-16，人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1A，人前列腺癌細(xì)胞PC-3，人胃癌細(xì)胞N87等腫瘤細(xì)胞都有殺傷作用，具體結(jié)果如表6所示。表6：LDC13B偶聯(lián)體對(duì)相關(guān)腫瘤細(xì)胞毒性(IC50值)對(duì)照表單位(摩爾/升，M)細(xì)胞名稱HCT-116GTL-16HEC-1APC-3N87MMAE1.27×10-86.38×10-98.74×10-91.28×10-83.83×10-9LDC13B1.07×10-67.55×10-79.4×10-71.18×10-63.26×10-7偶聯(lián)體動(dòng)物模型藥效研究實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)小鼠的腫瘤治療模型，了解偶聯(lián)體的抗腫瘤藥效偶聯(lián)體LDC10B對(duì)移植腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：裸鼠，6-8周齡，雌性；實(shí)驗(yàn)方法人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460，人肺癌細(xì)胞A549，卵巢癌細(xì)胞SKOV3,乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，細(xì)胞使用含10％胎牛血清IMDM培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細(xì)胞2-3天傳一次。腫瘤產(chǎn)生，將7×106腫瘤細(xì)胞注射到裸鼠背部皮下，待腫瘤長(zhǎng)到100左右，開(kāi)始分組給藥治療。治療過(guò)程：小鼠以3只為1組，用5、10mg/kg劑量，7天間隔注射4次LDC10B及對(duì)照MMAE，PBS進(jìn)行治療。監(jiān)控動(dòng)物的身體表現(xiàn)、體重和腫瘤尺寸。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡數(shù)。結(jié)果與討論：LDC10B能抑制人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460，人肺癌細(xì)胞A549,卵巢癌細(xì)胞SKOV3,乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，大多腫瘤在5、10mg/kg劑量連續(xù)3次給藥后萎縮消失，具體結(jié)果如表7所示。表7：LDC10B偶聯(lián)體對(duì)移植腫瘤抑制的效果對(duì)照表LDC11B系列偶聯(lián)體對(duì)移植腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：裸鼠，6-8周齡，雌性；實(shí)驗(yàn)方法人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460，卵巢癌細(xì)胞SKOV3,乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3，細(xì)胞使用含10％胎牛血清IMDM培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細(xì)胞2-3天傳一次。腫瘤產(chǎn)生，將7×106腫瘤細(xì)胞分別注射到裸鼠背部皮下，待腫瘤長(zhǎng)到100～200mm3左右，開(kāi)始給藥治療。治療過(guò)程：小鼠以3只為1組，用10mg/kg劑量，7天間隔4次注射，LDC11B進(jìn)行治療。監(jiān)控動(dòng)物的身體表現(xiàn)、體重和腫瘤尺寸。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡數(shù)。結(jié)果與討論：LDC11B能抑制人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460，卵巢癌細(xì)胞SKOV3,乳腺癌細(xì)胞株HCC1954，人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3腫瘤的生長(zhǎng)，大多腫瘤在10mg/kg劑量連續(xù)3次給藥后萎縮消失，具體結(jié)果如表8所示。表8：LDC11B偶聯(lián)體對(duì)移植腫瘤抑制的對(duì)照數(shù)據(jù)表偶聯(lián)體LDC10B在移植腫瘤動(dòng)物體內(nèi)濃度變化檢測(cè)動(dòng)物：裸鼠，6-8周齡，雌性；實(shí)驗(yàn)方法人卵巢癌細(xì)胞SKOV3，細(xì)胞使用含10％胎牛血清IMDM培養(yǎng)基在37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)，細(xì)胞2-3天傳一次。腫瘤產(chǎn)生，將7×106腫瘤細(xì)胞注射到裸鼠背部皮下，待腫瘤長(zhǎng)到100～200mm3，開(kāi)始分組給藥。給藥：用10mg/kg劑量，給小鼠腹膜注射。采血：給藥前采血設(shè)定為0，給藥后20min、2h、4h、24h采血，采血后離心取血清冷凍保存。檢測(cè)：采用鼠抗MMAEElisa試劑盒檢測(cè)血清中MMAE，LDC10B、及其代謝物的總含量。結(jié)果與討論：LDC10B在給藥后24小時(shí)后，血液中只剩下少量藥物。具體結(jié)果如表9及圖2所示。表9：偶聯(lián)體LDC10B在移植腫瘤動(dòng)物體內(nèi)濃度變化數(shù)據(jù)對(duì)照表時(shí)間濃度ug/ml給藥前020min10.82h5.0354h0.5324h0.1179當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3