本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)皮膚組織工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種異種高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料的制備方法。技術(shù)背景皮膚是人體最大的器官，也是人體與外界環(huán)境設(shè)置的第一道防線，其對(duì)保護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，抵御外界環(huán)境的刺激和病原菌入侵起到重要的作用。由于各種原因常常容易導(dǎo)致皮膚缺損，如燒傷、燙傷以及外界各種不可抗力等因素等。而隨著社會(huì)的發(fā)展及人口老齡化程度的加劇，越來(lái)越多的人正遭受著由褥創(chuàng)、糖尿病足、血運(yùn)障礙性潰瘍等難愈合創(chuàng)面帶來(lái)的痛苦。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年燒傷與潰瘍患者達(dá)1500萬(wàn)，其中需要進(jìn)行皮膚移植的有350萬(wàn)之多。然而，在臨床中，經(jīng)常面臨沒(méi)有完整或足夠的自身皮膚來(lái)移植的困境。所以，研究者一直在尋找人體皮膚的替代品。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)是一種無(wú)細(xì)胞成分、免疫活性低、且保留了表皮和真皮間基底膜的材料，可由動(dòng)物皮膚加工制得，用于移植后可形成真皮面和基底膜面，因而具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。但由于現(xiàn)有制備技術(shù)難以做到既徹底去除脫細(xì)胞免疫成分使其免疫原性最低，又完整保留細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)提高其滲透性。因此，突破傳統(tǒng)技術(shù)的瓶頸，制造出功能多樣、結(jié)構(gòu)完整的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)是這一產(chǎn)品推廣應(yīng)用急需解決的技術(shù)問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，尤其對(duì)于異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)在臨床使用過(guò)程中表現(xiàn)出的不足，提供一種異種高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料的制備方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種異種高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料的制備方法，具體包括以下步驟：S1.取皮：選取健康新鮮的哺乳動(dòng)物皮膚為皮源，對(duì)取皮區(qū)進(jìn)行脫毛、消毒，用取皮刀切取帶有表皮層和真皮層的斷層皮片，裁成所需尺寸，用質(zhì)量濃度0.1%的苯扎氯銨溶液浸泡20～40min，消毒殺菌；S2.脫脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮層浸泡于質(zhì)量濃度0.1~1%的乳酸中，使其接近先皮狀態(tài)，取出后低溫干燥；S3.角蛋白酶處理：將S2所得脫脂后的皮片置于角蛋白酶溶液中反應(yīng)30~60min，其中角蛋白酶溶液與皮片的質(zhì)量比為2~5，溶液pH保持在9~11之間，角蛋白酶的質(zhì)量濃度0.1~0.5%，溶液中SDS的質(zhì)量濃度0.3~0.6%；S4.脫細(xì)胞：將角蛋白酶處理后的皮片放入液氮中浸泡5~10min，取出后自然復(fù)溫，然后于微波爐中在解凍狀態(tài)下微波處理3~10min，然后放入質(zhì)量濃度3%的高滲氯化鈉溶液中浸泡10~30min，再經(jīng)數(shù)控超聲清洗器以陰陽(yáng)離子洗脫液浸泡，超聲振蕩洗滌36~72h，并于每6h更換一次洗脫液，之后再用蒸餾水在超聲振蕩下清洗12~24h，每4h更換一次蒸餾水，再經(jīng)低溫干燥即制得異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。S5.取上述2~10g異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)置于100mL蒸餾水中，溶脹30~60min，然后滴加0.001~0.002mol/L的硝酸鈰溶液，充分?jǐn)嚢瑁纬删鶆蚧旌弦?；S6.向上述混合液中加入總質(zhì)量為0.04~2g、由海藻酸丙二醇酯和多胺化合物形成的混合物，在37℃下振蕩反應(yīng)12~24h，得到經(jīng)改性的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)；S7.取出經(jīng)改性的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，冷凍干燥，然后按要求的規(guī)格尺寸進(jìn)行分切、包裝、滅菌，即得成品。優(yōu)選地，所述步驟S6的混合物海藻酸丙二醇酯和多胺化合物的摩爾比為（0.8～1.2）：1。優(yōu)選地，所述的述多胺化合物為乙二胺、丙二胺、己二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺中的一種。本發(fā)明產(chǎn)品的有益效果為：（1）采用凍融結(jié)合微波對(duì)細(xì)胞的破碎徹底去除真皮細(xì)胞。以豬體軀干部位皮膚為原材料，在脫脂后采用低溫凍融、微波解凍、陰陽(yáng)離子清洗液洗脫的方法，使細(xì)胞在微波破碎之后，其碎片易與含豐富清水基團(tuán)的陰陽(yáng)離子結(jié)合，細(xì)胞碎片洗脫徹底。（2）高滲透性脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備技術(shù)。選擇特殊的化學(xué)脫脂方法，將堿與表面活性劑SDS相結(jié)合，充分去除脂肪，同時(shí)結(jié)合后續(xù)的微波處理工藝，使真皮基質(zhì)中膠原纖維束被分散成許多細(xì)小的纖維，其空間排列更疏松，纖維束之間產(chǎn)生較大的孔隙，從而提高脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的滲透性。（3）引入功能基團(tuán)對(duì)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行改性。采用特殊的混合物海藻酸丙二醇酯和多胺化合物改性脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)，引入了具有一定吸濕性和抗菌功能的季銨基團(tuán)，從而賦予脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料較好的親水性和抗菌性能。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例5中電子顯微鏡觀察到的實(shí)驗(yàn)組的三維結(jié)構(gòu)與微觀形貌；圖2為本發(fā)明實(shí)施例5中電子顯微鏡觀察到的對(duì)照組的三維結(jié)構(gòu)與微觀形貌；圖3為本發(fā)明實(shí)施例6中空白樣0h接觸細(xì)菌生長(zhǎng)圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例6中空白樣18h接觸細(xì)菌生長(zhǎng)圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例6中實(shí)驗(yàn)組0h接觸細(xì)菌生長(zhǎng)圖；圖6為本發(fā)明實(shí)施例6中實(shí)驗(yàn)組18h接觸細(xì)菌生長(zhǎng)圖；圖7為本發(fā)明實(shí)施例6中對(duì)照組0h接觸細(xì)菌生長(zhǎng)圖；圖8為本發(fā)明實(shí)施例6中對(duì)照組18h接觸細(xì)菌生長(zhǎng)圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1一種異種高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料的制備方法，其制備過(guò)程如下：（1）取2g異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)置于100mL蒸餾水中，溶脹30min，然后滴加0.001mol/L的硝酸鈰溶液，充分?jǐn)嚢?，形成均勻混合液；?）向上述混合液中加入總質(zhì)量為2g、由海藻酸丙二醇酯和乙二胺形成的混合物（二者的摩爾比為4：5），在37℃下振蕩反應(yīng)12h，得到經(jīng)改性的高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)；（3）取出皮片基質(zhì)，冷凍干燥，然后按要求的規(guī)格尺寸進(jìn)行分切、包裝、滅菌，即得高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料。上述步驟中，所述的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，其制備工藝過(guò)程如下：（1）取皮：選取健康新鮮的豬皮膚為皮源，對(duì)取皮區(qū)進(jìn)行脫毛、消毒，用取皮刀切取帶有表皮層和真皮層的斷層皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯銨溶液浸泡20min，消毒殺菌；（2）脫脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮層浸泡于0.1%的乳酸中，使其接近先皮狀態(tài)，取出后低溫干燥；（3）角蛋白酶處理：脫脂后的皮樣置于角蛋白酶溶液中反應(yīng)60min，其中液比（用水量與皮樣的質(zhì)量比值）為2，溶液pH保持在9~11之間，角蛋白酶的質(zhì)量濃度0.1%，溶液中SDS的質(zhì)量濃度0.4%；（4）脫細(xì)胞：將角蛋白酶處理后的皮片放入液氮中浸泡5min，取出后自然復(fù)溫，然后于微波爐中在解凍狀態(tài)下微波處理3min，然后放入3%的高滲氯化鈉溶液中浸泡15min，再經(jīng)數(shù)控超聲清洗器以陰陽(yáng)離子洗脫液浸泡，超聲振蕩洗滌36h，并于每6h更換一次洗脫液，之后再用蒸餾水在超聲振蕩下清洗洗脫液12h，每4h更換一次蒸餾水，再經(jīng)低溫干燥即制得脫細(xì)胞真皮基質(zhì)材料。實(shí)施例2（1）取10g異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)置于100mL蒸餾水中，溶脹60min，然后滴加0.002mol/L的硝酸鈰溶液，充分?jǐn)嚢?，形成均勻混合液；?）向上述混合液中加入總質(zhì)量為0.04g、由海藻酸丙二醇酯和丙二胺形成的混合物（二者的摩爾比為6：5），在37℃下振蕩反應(yīng)24h，得到經(jīng)改性的高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)；（3）取出皮片基質(zhì)，冷凍干燥，然后按要求的規(guī)格尺寸進(jìn)行分切、包裝、滅菌，即得高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料。上述步驟中，所述的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，其制備工藝過(guò)程如下：（1）取皮：選取健康新鮮的牛皮膚為皮源，對(duì)取皮區(qū)進(jìn)行脫毛、消毒，用取皮刀切取帶有表皮層和真皮層的斷層皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯銨溶液浸泡40min，消毒殺菌；（2）脫脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮層浸泡于1%的乳酸中，使其接近先皮狀態(tài)，取出后低溫干燥；（3）角蛋白酶處理：脫脂后的皮樣置于角蛋白酶溶液中反應(yīng)40min，其中液比（用水量與皮樣的質(zhì)量比值）為4，溶液pH保持在9~11之間，角蛋白酶的質(zhì)量濃度0.5%，溶液中SDS的質(zhì)量濃度0.3%；（4）脫細(xì)胞：將角蛋白酶處理后的皮片放入液氮中浸泡10min，取出后自然復(fù)溫，然后于微波爐中在解凍狀態(tài)下微波處理10min，然后放入3%的高滲氯化鈉溶液中浸泡30min，再經(jīng)數(shù)控超聲清洗器以陰陽(yáng)離子洗脫液浸泡，超聲振蕩洗滌48h，并于每6h更換一次洗脫液，之后再用蒸餾水在超聲振蕩下清洗洗脫液18h，每4h更換一次蒸餾水，再經(jīng)低溫干燥即制得脫細(xì)胞真皮基質(zhì)材料。實(shí)施例3（1）取5g異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)置于100mL蒸餾水中，溶脹40min，然后滴加0.002mol/L的硝酸鈰溶液，充分?jǐn)嚢?，形成均勻混合液；?）向上述混合液中加入總質(zhì)量為1g、由海藻酸丙二醇酯和已二胺形成的混合物（二者的摩爾比為1：1），在37℃下振蕩反應(yīng)18h，得到經(jīng)改性的高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)；（3）取出皮片基質(zhì)，冷凍干燥，然后按要求的規(guī)格尺寸進(jìn)行分切、包裝、滅菌，即得高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料。上述步驟中，所述的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，其制備工藝過(guò)程如下：（1）取皮：選取健康新鮮的羊皮膚為皮源，對(duì)取皮區(qū)進(jìn)行脫毛、消毒，用取皮刀切取帶有表皮層和真皮層的斷層皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯銨溶液浸泡30min，消毒殺菌；（2）脫脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮層浸泡于0.5%的乳酸中，使其接近先皮狀態(tài)，取出后低溫干燥；（3）角蛋白酶處理：脫脂后的皮樣置于角蛋白酶溶液中反應(yīng)45min，其中液比（用水量與皮樣的質(zhì)量比值）為3，溶液pH保持在9~11之間，角蛋白酶的質(zhì)量濃度0.4%，溶液中SDS的質(zhì)量濃度0.5%；（4）脫細(xì)胞：將角蛋白酶處理后的皮片放入液氮中浸泡8min，取出后自然復(fù)溫，然后于微波爐中在解凍狀態(tài)下微波處理6min，然后放入3%的高滲氯化鈉溶液中浸泡10min，再經(jīng)數(shù)控超聲清洗器以陰陽(yáng)離子洗脫液浸泡，超聲振蕩洗滌60h，并于每6h更換一次洗脫液，之后再用蒸餾水在超聲振蕩下清洗洗脫液24h，每4h更換一次蒸餾水，再經(jīng)低溫干燥即制得脫細(xì)胞真皮基質(zhì)材料。實(shí)施例4（1）取8g異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)置于100mL蒸餾水中，溶脹50min，然后滴加0.002mol/L的硝酸鈰溶液，充分?jǐn)嚢瑁纬删鶆蚧旌弦?；?）向上述混合液中加入總質(zhì)量為0.5g、由海藻酸丙二醇酯和三乙烯三胺形成的混合物（二者的摩爾比為9：10），在37℃下振蕩反應(yīng)20h，得到經(jīng)改性的高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)；（3）取出皮片基質(zhì)，冷凍干燥，然后按要求的規(guī)格尺寸進(jìn)行分切、包裝、滅菌，即得高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料。上述步驟中，所述的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，其制備工藝過(guò)程如下：（1）取皮：選取健康新鮮的豬皮膚為皮源，對(duì)取皮區(qū)進(jìn)行脫毛、消毒，用取皮刀切取帶有表皮層和真皮層的斷層皮片，裁成所需尺寸，用1‰的苯扎氯銨溶液浸泡35min，消毒殺菌；（2）脫脂：用取皮鼓去除脂肪，切取一定厚度的真皮層浸泡于0.8%的乳酸中，使其接近先皮狀態(tài)，取出后低溫干燥；（3）角蛋白酶處理：脫脂后的皮樣置于角蛋白酶溶液中反應(yīng)30min，其中液比（用水量與皮樣的質(zhì)量比值）為5，溶液pH保持在9~11之間，角蛋白酶的質(zhì)量濃度0.2%，溶液中SDS的質(zhì)量濃度0.6%；（4）脫細(xì)胞：將角蛋白酶處理后的皮片放入液氮中浸泡9min，取出后自然復(fù)溫，然后于微波爐中在解凍狀態(tài)下微波處理8min，然后放入3%的高滲氯化鈉溶液中浸泡20min，再經(jīng)數(shù)控超聲清洗器以陰陽(yáng)離子洗脫液浸泡，超聲振蕩洗滌72h，并于每6h更換一次洗脫液，之后再用蒸餾水在超聲振蕩下清洗洗脫液20h，每4h更換一次蒸餾水，再經(jīng)低溫干燥即制得脫細(xì)胞真皮基質(zhì)材料。實(shí)施例5異種高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料的理化指標(biāo)和微觀情況選取實(shí)施例2制得的產(chǎn)品作為實(shí)驗(yàn)組與市面產(chǎn)品作為對(duì)照組進(jìn)行以下測(cè)試：（1）氨基酸分析：取約50mgADM，剪碎后浸于6mol/LHCl溶液中，110℃下水解24h，氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定羥脯氨酸(HYP)的含量。HYP是膠原蛋白的特異性氨基酸且含量穩(wěn)定，約占膠原蛋白中氨基酸總量的10%，用以計(jì)算膠原蛋白量。（2）材料孔隙率測(cè)試：取制備得到的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，切成1cm×1cm的小塊，置于一定體積（V1）乙醇中，循環(huán)抽真空至無(wú)氣泡逸出，材料和乙醇總體積記為V2，將含乙醇的材料移出后剩余乙醇體積記為V3，按以下公式計(jì)算孔隙率：[(V1－V3)/(V2－V3)]×100%。（3）掃描電子顯微鏡(SEM)觀察：將冷凍干燥的ADM剪成3mm×3mm的小片，在壓強(qiáng)8.2Pa、電流30mA真空環(huán)境中噴金鍍膜40s，SEM觀察其三維結(jié)構(gòu)與細(xì)微形貌。測(cè)試結(jié)果如下：表1異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的氨基酸分析平行次數(shù)1234平均值對(duì)照組每100gADM中HYP含量(mg)9561.279612.569490.389590.769563.748211.43表2脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料的孔隙率從圖1~2及以上的測(cè)試結(jié)果分析可知，本發(fā)明所制務(wù)的異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)膠原蛋白含量（氨基酸含量）、孔隙率等方面明顯優(yōu)于對(duì)照組，且從掃描電鏡中可進(jìn)一步觀察到本發(fā)明的孔隙率有實(shí)質(zhì)性的提升。實(shí)施例6抗菌性測(cè)試實(shí)驗(yàn)組：以實(shí)施例2制備的異種高性能脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料為實(shí)驗(yàn)組；對(duì)照組：以市面上脫細(xì)胞真皮基質(zhì)敷料為對(duì)照組；將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組采用同樣方法進(jìn)行抗菌性能測(cè)試，根據(jù)GB/T20944.3-2008紡織品抗菌性能的評(píng)價(jià)第3部分：振蕩瓶法，測(cè)定其抗菌性能。所用菌種為白色念珠菌(Candidaalbicans)，菌液濃度為105~107cfu/mL。首先在三角瓶中加入緩沖生理鹽水及敷料產(chǎn)品，在0.1MPa蒸汽及121℃高溫中滅菌20min，冷卻至室溫，用1mL無(wú)菌刻度吸管移取1mL菌液，加入上述三角瓶中。為使試樣和細(xì)菌強(qiáng)行接觸，在37℃搖床振蕩數(shù)小時(shí)。取振蕩前及振蕩后溶液0.1mL涂于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)37℃、24h恒溫培養(yǎng)后比較，每次抗菌試驗(yàn)均同時(shí)進(jìn)行空白對(duì)照試驗(yàn)，其結(jié)果如圖3~8所示。從圖3~8系列圖中對(duì)比可知，本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)白色念珠菌的抑菌率可達(dá)100%，而對(duì)照組產(chǎn)品不具備抗菌性。應(yīng)當(dāng)指出的是，具體實(shí)施方式只是本發(fā)明比較有代表性的例子，顯然本發(fā)明的技術(shù)方案不限于上述實(shí)施例，還可以有很多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，以本發(fā)明所明確公開(kāi)的或根據(jù)文件的書(shū)面描述毫無(wú)異議的得到的，均應(yīng)認(rèn)為是本專利所要保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3