本發(fā)明涉及一種化療藥物的納米載體及其制備方法，具體為一種近紅外光觸發(fā)釋放化療藥物的納米載體及其制備方法。

背景技術：

通過化學藥物殺傷腫瘤細胞的化療一直是腫瘤治療中一個主要的治療方法，但是目前抗癌藥物使用上缺少選擇性，在治療抑制腫瘤的過程中，其毒副作用對機體正常組織產生嚴重的損傷，成為化療發(fā)展的瓶頸。有效的靶向藥物傳遞體系成為解決化療發(fā)展瓶頸的突破口，其中刺激響應性能的藥物載體成為該領域研究熱點。

光敏感性材料是最近刺激響應納米材料研究的一大熱點，原因主要是因為光能夠提供其他刺激因素沒有的一些優(yōu)點。首先能夠很準確簡單的控制光的波長和強度，并且高精度的控制時間和部位，從而達到精確的藥物富集的作用。紫外可見光的組織穿透能力非常有限，通過近紅外光的雙光子吸收來產生同樣的降解反應，但是這種方法的效率非常低下，效果也不盡如人意。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述至少一種技術問題，本發(fā)明提供了一種近紅外光觸發(fā)釋放化療藥物的納米載體的制備方法，包括，將光敏單體、親水性單體及疏水性單體聚合，制得光敏聚合物；以及提供一油酸修飾的上轉換納米顆粒，將所述光敏聚合物與所述上轉換納米顆?；旌?，所述光敏聚合物作用于所述上轉換納米顆粒，制得所述納米載體；其中，所述光敏單體為二丙烯酸(1-硝基-2,5-二苯甲醇)酯，所述親水性單體選自包含丙烯酸酯的聚乙二醇衍生物，所述疏水性單體選自含有氨基的烷基長鏈。

于本發(fā)明的一實施方式中，所述親水性單體的摩爾數(shù)為所述光敏單體摩爾數(shù)的5％～10％，所述疏水性單體的摩爾數(shù)為所述光敏單體的摩爾數(shù)的100％～120％。

于本發(fā)明的一實施方式中，所述親水性單體為甲氧基聚乙二醇丙烯酸酯。

于本發(fā)明的一實施方式中，所述疏水性單體選自十二胺、1-十八胺和油胺中的一種或多種。

于本發(fā)明的一實施方式中，所述光敏聚合物與所述上轉換納米顆粒的質量比是10:1～1:1。

于本發(fā)明的一實施方式中，包括將所述光敏單體、親水性單體及疏水性單體在攪拌速度為400～1200轉/分鐘速度下，在90～100℃下熔融反應10～14小時后，制得所述光敏聚合物。

于本發(fā)明的一實施方式中，包括將油酸修飾的上轉換納米顆粒分散到環(huán)己烷中，使用探入式超聲10～30分鐘，得到疏水性的上轉換納米顆粒。

于本發(fā)明的一實施方式中，包括將所述光敏聚合物溶解于含有親油性表面活性劑的三氯甲烷中，加入所述疏水性的上轉換納米顆粒，再加入水，超聲反應，之后再攪拌，待所述環(huán)己烷、三氯甲烷蒸發(fā)完全，制得所述納米載體。

于本發(fā)明的一實施方式中，所述親油性表面活性劑選自吐溫20、吐溫60和吐溫80中的一種或多種。

本發(fā)明進一步提供了一種近紅外光觸發(fā)釋放化療藥物的納米載體，由上述任一項所述的方法制得。

本發(fā)明的近紅外光觸發(fā)釋放化療藥物的納米載體，是一種親水性很好的復合上轉換納米粒子，且呈單層殼包裹多個核的結構，因此在體內可以快速響應于近紅外光從而準確的釋放藥物，克服一般載藥納米粒子釋放效率低的問題。

附圖說明

圖1為實施例1所得疏水性的上轉換納米粒子的粒徑分布圖；

圖2為實施例1所得親水性復合上轉換納米粒子的粒徑分布圖；

圖3為應用例1的親水性復合上轉換納米粒子的發(fā)光性能圖譜；

圖4為應用例2的親水性復合上轉換納米粒子的粒徑變化圖譜；

圖5為應用例3的復合上轉換納米粒子包載的阿霉素的體外累積釋放圖。

具體實施方式

體現(xiàn)本發(fā)明特征與優(yōu)點的典型實施方式將在以下的說明中詳細敘述。應理解的是本發(fā)明能夠在不同的實施方式上具有各種的變化，其皆不脫離本發(fā)明的范圍，且其中的說明及圖示在本質上是當作說明之用，而非用以限制本發(fā)明。

相比較于傳統(tǒng)的熒光物質，近紅外激發(fā)產生紫外可見發(fā)射光的上轉換納米粒子具有更好的組織穿透力，更好的光化學穩(wěn)定性和無自熒光干擾。然而，未修飾的上轉換納米粒子不能溶于水溶液中，本發(fā)明通過對上轉換納米粒子的表面修飾，制備了生物相容的上轉換納米粒子。具體地，本發(fā)明以光敏感性兩親性聚合物結合上轉換納米結晶體，而后通過加入靶向基團，抗癌藥物，多種刺激響應基團，制備出一種多功能的腫瘤靶向藥物的新型診斷治療納米載體。該研究為多功能的高效抗腫瘤靶向藥物在臨床診斷治療應用奠定基礎，也進一步拓展了性能獨特的納米材料-上轉換納米結晶的應用前景，尤其將其在生物醫(yī)用領域的強勁潛力充分的展現(xiàn)出來。

本發(fā)明提供一種近紅外光觸發(fā)釋放化療藥物的納米載體的制備方法，包括，將光敏單體、親水性單體及疏水性單體聚合，制得光敏聚合物；提供一油酸修飾的上轉換納米顆粒，將所述光敏聚合物與所述上轉換納米顆?；旌?，再加入水超聲，之后再攪拌，待所述環(huán)己烷、氯仿蒸發(fā)完全，所述光敏聚合物作用于所述上轉換納米顆粒，制得所述納米載體。

其中，光敏單體可以為二丙烯酸(1-硝基-2,5-二苯甲醇)酯，該光敏單體可由2,5-二甲基硝基苯作為合成初始物，通過一步氧化反應(KMnO₄,NaOH,H₂O)、一步還原反應(BH₃，四氫呋喃)、最后丙烯酯化反應得到。親水性單體選自包含丙烯酸酯的聚乙二醇衍生物，其重均分子量優(yōu)選為Mw＝2k～20kDa，進一步優(yōu)選為Mw＝5000，所述疏水性單體選自含有氨基的長鏈單體，該長鏈單體可以為R-NH₂，R為優(yōu)選為含C₈～C₂₂的烷基，進一步優(yōu)選為含C₈～C₂₂的直鏈烷基，例如該疏水性單體可以為十二胺、1-十八胺或油胺。

優(yōu)選地，親水性單體占光敏單體的摩爾分數(shù)為5％～10％，疏水性單體占光敏單體摩爾分數(shù)為100％～120％。

在本發(fā)明的一實施方式中，光敏聚合物的制備過程可包括：首先將光敏單體加入到一種親水性單體和一種疏水性單體中，磁力攪拌，通入氮氣，在攪拌速度為400～1200轉/分鐘速度下，在90～100℃下熔融反應12小時后，勻速滴加氯仿，滴加完畢后得到溶液，再將乙醚加入到所得的溶液中，在25℃下沉降3小時后，產物經(jīng)過濾、真空干燥，即可得到光敏聚合物(LSP)。

在本發(fā)明的另一實施方式中，油酸(OA)修飾的上轉化納米顆粒NaYbF₄：Tm(0.5％)的制備過程可包括：在一個典型的程序中，利用稀土油酸鹽為先導的策略，預先合成鐿的油酸復合物(油酸鐿)和銩的油酸復合物(油酸銩)作為前體物質。然后，混合物油酸鐿(0.995毫摩爾)，油酸銩(0.005毫摩爾)和氟化鈉(6毫摩爾)添加到一個含有6毫升的油酸和15毫升的1-十八烯的50毫升圓口燒瓶中。隨后加熱到120攝氏度，真空去除殘留的水和氧氣，磁力攪拌45分鐘。然后，該溶液被迅速加熱到320攝氏度，在氬氣的氣氛下，并保持1小時。待反應完成后，將反應的混合物自然冷卻至室溫，然后用約20毫升無水乙醇沉淀產品。之后離心，將所獲得的產品用乙醇洗滌3次，在60攝氏度時干燥8小時作進一步使用。這一過程是按照下列文獻合成：(1)Tian G,Zheng X,Zhang X,et al.TPGS穩(wěn)定的NaYbF₄:Er上轉換納米顆粒用于熒光/CT雙模態(tài)成像并用于抗腫瘤藥物輸送來克服腫瘤多藥耐藥性。生物材料2015,40:107-116.(TPGS-stabilized NaYbF₄:Er upconversion nanoparticles for dual-modal fluorescent/CT imaging and anticancer drug delivery to overcome multi-drug resistance[J].Biomaterials,2015,40:107-116.)；(2)Yan B,Boyer J C,Habault D,et al.近紅外光觸發(fā)裝載上轉換納米顆粒的水凝膠釋放包載生物大分子的研究。美國化學協(xié)會會刊，2012,134(40):16558-16561(Near infrared light triggered release of biomacromolecules from hydrogels loaded with upconversion nanoparticles[J].Journal of the American Chemical Society,2012,134(40):16558-16561.)。

在本發(fā)明的另一實施方式中，包括將油酸修飾的上轉換納米顆粒(OA-UCNPs)分散到環(huán)己烷中，然后使用探入式超聲10～30分鐘得到分散良好的疏水性的UCNPs。

在本發(fā)明的另一實施方式中，包括將上述合成的光敏聚合物LSP溶解在含有親油性表面活性劑的三氯甲烷中，加入分散良好的上述疏水性的UCNPs中，再繼續(xù)加水，超聲30～60分鐘，通過疏水-疏水相互作用形成膠束，再攪拌24小時，將有機溶劑環(huán)己烷和氯仿攪拌蒸發(fā)完全，得到親水性的近紅外光觸發(fā)的復合上轉換納米粒子。

其中，光敏聚合物LSP與疏水性的UCNPs的質量比是10:1～1:1，疏水性表面活性劑可以為吐溫20、吐溫60或吐溫80。

本發(fā)明近紅外光觸發(fā)釋放化療藥物的納米載體的制備方法，通過熔融反應邁克爾加成制備具有雙親性的光敏聚合物LSP，高溫熱解法制備上轉換納米粒子，利用超聲作用分散成疏水性良好的UCNPs，再利用疏水-疏水相互作用來制備單層殼包裹多個核的復合上轉換納米粒子。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點：包裹有雙親性光敏聚合物的上轉換納米粒子具有很好的親水性，且呈單層殼包裹多個核的結構，因此在體內可以快速響應于近紅外光準確的釋放藥物，克服一般載藥納米粒子釋放效率低的問題。且無需使用紫外光等對細胞有損傷的短波光，在實現(xiàn)同等的治療效果的條件下，快速的釋放出藥物。本發(fā)明制備方法簡便、易于重復；另外，本發(fā)明制備的親水性復合上轉換納米粒子結構獨特，有望達到腫瘤深處，達到更好的治療效果。

下面，結合具體實施例對本發(fā)明的近紅外光觸發(fā)釋放化療藥物的納米載體的制備方法做進一步說明，實施例中所使用的二丙烯酸(1-硝基-2,5-二苯甲醇)酯均是通過前述方法制得。

其中，UCNPs納米粒子和LSP@UCNPs納米膠束的粒徑是通過馬爾文Zetasizer Nano S90激光粒度儀在0.1毫克/毫升的條件下進行測定，阿霉素的含量是通過島津UV-1800雙光束紫外可見分光光度計測定的，上轉換發(fā)射光譜是通過日立熒光分光光度計在1毫克/毫升的濃度下進行測定的。

實施例1

1)將292毫克二丙烯酸(1-硝基-2,5-二苯甲醇)酯、272微升十二胺和500毫克甲氧基聚乙二醇丙烯酸酯加入三口燒瓶中，通入氮氣至少20分鐘排出空氣，在1000轉/分鐘的攪拌速度下，在100℃下熔融反應12小時后，勻速滴加氯仿，滴加完畢后得到溶液，再將乙醚加入到所得的溶液中，在25℃下沉降3小時后，產物經(jīng)過濾、真空干燥，即可得到光敏聚合物LSP。

2)預先合成鐿的油酸復合物(油酸鐿)和銩的油酸復合物(油酸銩)作為前體物質。然后，混合物油酸鐿(0.995毫摩爾)，油酸銩(0.005毫摩爾)和氟化鈉(6毫摩爾)添加到一個含有6毫升的油酸和15毫升的1-十八烯的50毫升圓口燒瓶中。隨后加熱到120攝氏度，真空去除殘留的水和氧氣，磁力攪拌45分鐘。然后，該溶液被迅速加熱到320攝氏度，在氬氣的氣氛下，并保持1小時。待反應完成后，將反應的混合物自然冷卻至室溫，然后用約20毫升無水乙醇沉淀產品。之后離心，將所獲得的產品用乙醇洗滌3次，在60攝氏度時干燥8小時作進一步使用。得到的油酸修飾的上轉換納米顆粒UCNPs：NaYbF₄:Tm(0.5％)的粒徑為30納米。

3)將油酸修飾的上轉換納米顆粒UCNPs分散在環(huán)己烷中，濃度為1毫克/毫升。取1毫升，超聲30～60分鐘，得到分散性良好的疏水性的UCNPs。

4)將10毫克光敏聚合物LSP溶解在含有10毫克吐溫80的1毫升三氯甲烷中，然后加入5毫升的UCNPs環(huán)己烷溶液，再繼續(xù)加水，超聲反應30～60分鐘，再攪拌24小時，得到親水性的近紅外光觸發(fā)的復合上轉換納米粒子LSP@UCNPs。

所得疏水性上轉換納米粒子UCNPs的粒徑為20納米，親水性復合上轉換納米粒子LSP@UCNPs的粒徑為180納米。

圖1為疏水性上轉換納米粒子UCNPs的粒徑圖，從圖1中可以看出，疏水性上轉換納米粒子的粒徑主要在20納米附近。這是由于疏水性上轉化納米粒子的粒徑與其超聲前的粒徑有密切關系。

圖2為親水性復合上轉換納米粒子LSP@UCNPs的粒徑圖，從圖2中可以看出，經(jīng)過雙親性聚合物LSP的包裹后，疏水性復合上轉換納米粒子的粒徑有所增大，說明形成了單層殼包裹多個核的獨特結構。

實施例2

1)將300毫克二丙烯酸(1-硝基-2,5-二苯甲醇)酯、180微升油胺和500毫克甲氧基聚乙二醇丙烯酸酯加入三口燒瓶中，通入氮氣至少20分鐘排出空氣，在1000轉/分鐘的攪拌速度下，在90℃下熔融反應12小時后，勻速滴加氯仿，滴加完畢后得到溶液，再將乙醚加入到所得的溶液中，在25℃下沉降3小時后，產物經(jīng)過濾、真空干燥，即可得到光敏聚合物LSP。

2)預先合成鐿的油酸復合物(油酸鐿)、釔的油酸復合物(油酸釔)和銩的油酸復合物(油酸銩)作為前體物質。然后，混合物油酸鐿(0.25毫摩爾)，油酸釔(0.745毫摩爾)和油酸銩(0.005毫摩爾)和氟化鈉(6毫摩爾)添加到一個含有6毫升的油酸和15毫升的1-十八烯的50毫升圓口燒瓶中。隨后加熱到120攝氏度，真空去除殘留的水和氧氣，磁力攪拌45分鐘。然后，該溶液被迅速加熱到320攝氏度，在氬氣的氣氛下，并保持1小時。待反應完成后，將反應的混合物自然冷卻至室溫，然后用約20毫升無水乙醇沉淀產品。之后離心，將所獲得的產品用乙醇洗滌3次，在60攝氏度時時干燥8小時作進一步使用。得到的油酸修飾的上轉換納米顆粒UCNPs：NaYF₄:TmYb的粒徑為35nm。

3)將油酸修飾的上轉換納米顆粒UCNPs分散在環(huán)己烷中，濃度為1毫克/毫升。取1毫升，超聲30～60分鐘，得到疏水性的UCNPs。

4)將8毫克光敏聚合物LSP溶解在含有10毫克吐溫60的1毫升三氯甲烷中，然后加入5毫升的UCNPs環(huán)己烷溶液，再繼續(xù)加水，超聲反應30～60分鐘，再攪拌24小時，得到親水性的近紅外光觸發(fā)的復合上轉換納米粒子LSP@UCNPs。

所得疏水性上轉換納米粒子UCNPs的粒徑為22納米，親水性復合上轉換納米粒子LSP@UCNPs的粒徑為170納米。

實施例3

1)將280毫克二丙烯酸(1-硝基-2,5-二苯甲醇)酯、180微升1-十八烯和500毫克甲氧基聚乙二醇丙烯酸酯加入三口燒瓶中，通入氮氣至少20分鐘排出空氣，在1000轉/分鐘的攪拌速度下，在95℃下熔融反應11小時后，勻速滴加氯仿，滴加完畢后得到溶液，再將乙醚加入到所得的溶液中，在25℃下沉降3小時后，產物經(jīng)過濾、真空干燥，即可得到光敏聚合物LSP。

2)預先合成鐿的油酸復合物(油酸鐿)、釔的油酸復合物(油酸釔)和銩的油酸復合物(油酸銩)作為前體物質。然后，混合物油酸鐿(0.25毫摩爾)，油酸釔(0.745毫摩爾)和油酸銩(0.005毫摩爾)和氟化鈉(6毫摩爾)添加到一個含有6毫升的油酸和15毫升的1-十八烯的50毫升圓口燒瓶中。隨后加熱到120攝氏度，真空去除殘留的水和氧氣，磁力攪拌45分鐘。然后，該溶液被迅速加熱到320攝氏度，在氬氣的氣氛下，并保持1小時。待反應完成后，將反應的混合物自然冷卻至室溫，然后用約20毫升無水乙醇沉淀產品。之后離心，將所獲得的產品用乙醇洗滌3次，在60攝氏度時時干燥8小時作進一步使用。得到的油酸修飾的上轉換納米顆粒UCNPs：NaYF4:TmYb的粒徑為35nm。

3)將油酸修飾的上轉換納米顆粒UCNPs分散在環(huán)己烷中，濃度為1毫克/毫升。取1毫升，超聲30～60分鐘，得到疏水性的UCNPs。

4)將8毫克光敏聚合物LSP溶解在含有10毫克吐溫20的1毫升三氯甲烷中，然后加入5毫升的UCNPs環(huán)己烷溶液，再繼續(xù)加水，超聲反應30～60分鐘，再攪拌24小時，得到親水性的近紅外光觸發(fā)的復合上轉換納米粒子LSP@UCNPs。

所得疏水性上轉換納米粒子UCNPs的粒徑為25納米，親水性復合上轉換納米粒子LSP@UCNPs的粒徑為190納米。

下面，結合具體應用例對本發(fā)明的近紅外光觸發(fā)釋放化療藥物的納米載體的發(fā)光性能做進一步說明。

應用例1

按照設計，當UCNPs納米粒子被困在膠束中后，UCNPs的發(fā)射光譜將發(fā)生變化。LSP@UCNPs納米膠束的發(fā)射圖譜就是UCNPs的特定頻段被光敏聚合物層吸收重疊所致。我們知道，當使用980nm的光照射膠束時，UCNPs納米粒子會發(fā)出幾個光譜的紫外-可見區(qū)域內的波長。那些有關目前的研究是在250-400nm，因為這些波長被膠束的鄰硝基芐基吸收，同是引起這一光誘導反應。該現(xiàn)象明顯地揭示的事實，包裹在膠束中的UCNPs其紫外線可能不再被觀察到。如圖3所示，光敏聚合物層在270nm和330nm有兩個吸收峰，而由實施例3制備的UCNPs納米粒子在紫外區(qū)域的一個發(fā)射譜帶在334nm，兩個波長處有重疊。從圖3中可以看到，我們的膠束在這一區(qū)域內觀察的發(fā)射譜帶明顯減弱，而膠束不能明顯吸收區(qū)域在近紅外區(qū)域的發(fā)射譜帶。此膠束有望在細胞內和生物體內達到近紅外觸發(fā)釋放化療藥物、抑制腫瘤的良好效果。

應用例2

按照設計，當UCNPs納米粒子被兩親性光敏聚合物包裹之后，粒徑會明顯增大，這也正好能夠證明合成成功。為了在體外驗證膠束的近紅外響應性，我們將制備的納米膠束放置在980納米的近紅外光下，通過表征其粒徑進行監(jiān)測。我們知道，上轉換納米顆粒會將980納米的近紅外光，轉換成紫外可見區(qū)域的可見光。包裹在上轉換納米顆粒外層的光敏聚合物在300-400納米紫外區(qū)域有吸收，會將上轉換納米顆粒轉換來的可見光紫外區(qū)域的光吸收，鄰硝基芐基被打斷，從而實施例3制備的LSP@UCNPs納米膠束也會垮掉。從圖4中可以看出，在0分鐘時，納米膠束保持200納米不變，在980納米近紅外的光照射納米膠束1分鐘之后，出現(xiàn)一些幾十納米的小峰。隨著時間的延長，3分鐘，5分鐘之后，小的納米顆粒增多。10分鐘之后，納米膠束的粒徑出現(xiàn)了增大，這意味著納米膠束出現(xiàn)了團聚現(xiàn)象，原先集中在200納米左右的納米顆粒分散性增加。30分鐘之后，1000納米附近的納米顆粒繼續(xù)增多，1小時之后200納米左右納米顆粒僅僅剩下少許，大部分集中于1000納米左右。隨著時間的延長，納米膠束出現(xiàn)了先垮掉后聚集的現(xiàn)象，這歸根于上轉換納米顆粒與光敏聚合物的準確配合。這一實驗正好說明納米膠束在體外可以很好的響應于近紅外光釋放藥物。

應用例3

按照設計，此近紅外響應的上轉換納米膠束能夠包裹抗癌化療藥物，有望在體內準確地到達病灶部位，避免在正常細胞和組織的釋放。為了模擬此上轉換納米膠束在體外的近紅外響應性，采用阿霉素作為模型藥物(0.2毫克/毫升)，將載藥納米膠束放在透析袋中，置于裝有30毫升緩沖液的50毫升離心管中，在37攝氏度的條件下于一定的時間間隔條件下照射980納米近紅外光之后取出一定量的緩沖溶液，采用紫外可見分光光度計測定其中阿霉素的含量。

從圖5中可以看出，親水性的上轉換納米膠束表現(xiàn)出了很好的近紅外響應特性。在pH是7.4的條件下，只有30％的阿霉素從膠束中釋放出來，膠束很穩(wěn)定；加入980納米的近紅外光之后，在每一個時間點阿霉素的釋放都出現(xiàn)了臺階式的增長，在72小時達到了載藥量的40％。模擬細胞內的酸性環(huán)境進行了測定，在pH是5.0的條件下，釋放量達到了53％，這是與阿霉素本身的正電荷有關的；加入980納米近紅外光之后，由于酸性的協(xié)同作用，上轉換納米膠束的釋放量達到了載藥量的66％。

除非特別限定，本發(fā)明所用術語均為本領域技術人員通常理解的含義。

本發(fā)明所描述的實施方式僅出于示例性目的，并非用以限制本發(fā)明的保護范圍，本領域技術人員可在本發(fā)明的范圍內作出各種其他替換、改變和改進，因而，本發(fā)明不限于上述實施方式，而僅由權利要求限定。