本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)單克隆抗體的穩(wěn)定制劑。
背景技術(shù)：
：有研究表明，腫瘤血管形成是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)(FolkmanJ.NEnglJMed，1971，285(21)：1182)。腫瘤新生血管的形成是腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的重要條件。大多數(shù)實(shí)體惡性腫瘤能分泌多種促血管生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)血管生成，支持腫瘤生長(zhǎng)(FolkmanJ，Science，1987，235(4787)：442)。在迄今發(fā)現(xiàn)的20多種多肽類血管生長(zhǎng)因子中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞特異性最高，促血管生長(zhǎng)作用最強(qiáng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子(FerraraN.EndocrRev，1997，18(1)：4)，在多種原發(fā)性惡性腫瘤組織中均呈高表達(dá)(BrownLF等HumanPathol，1995，26(1)：86)。Takahashi(CancerRes，1995，55(18)：3964)發(fā)現(xiàn)VEGF高表達(dá)與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系，提示VEGF在原位腫瘤的形成和生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移瘤的形成中均起著舉足輕重的作用。已經(jīng)證實(shí)其它多種血管生長(zhǎng)因子是通過直接或間接誘導(dǎo)、刺激VEGF表達(dá)而發(fā)揮作用的，如TGF-α、bFGF、TGF-β、TNF-α、KGF等均可上調(diào)VEGF的表達(dá)(LiJ，HamptonT等，JClinInvest，1997，100(1)：18；BrownLF等，DetmarM，ClaffeyK，etal.Vascularpermeabilityfactor/vascularendothelialgrowthfactor：amultifunctionalangiogeniccytokine.Exs，1997，79：233)。因此，VEGF是阻斷腫瘤血供的理想靶點(diǎn)。目前已經(jīng)有相關(guān)的抗VEGF單克隆抗體應(yīng)用于臨床，并顯示出了良好的抗腫瘤效果。貝伐單抗(bevacizumab，Avastin，阿瓦斯汀)是2004年獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)人源化抗VEGF單克隆抗體，成為晚期轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者的一線治療藥物。貝伐單抗是第一個(gè)獲批上市的血管生成抑制劑。貝伐單抗通過抑制新生血管的形成，減少腫瘤的血供、氧供和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。研究顯示，貝伐單抗與標(biāo)準(zhǔn)IFL方案(依立替康+5-氟尿嘧啶+亞葉酸鈣)聯(lián)用，可 顯著延長(zhǎng)結(jié)直腸癌患者的生存期。中國(guó)專利申請(qǐng)201410850230.7公開了一種重組抗VEGF單克隆抗體及其應(yīng)用，申請(qǐng)人構(gòu)建了一種具有高親和力的重組抗VEGF單克隆抗體，其比現(xiàn)有的抗VEGF抗體具有更高的親和力，能夠更加有效的識(shí)別VEGF靶點(diǎn)。重組抗VEGF單克隆抗體是一類大分子蛋白質(zhì)。通常，蛋白質(zhì)具有非常短的半衰期，并且在暴露于各種因素(如不適宜溫度、水-氣界面、高壓、物理/機(jī)械應(yīng)力、有機(jī)溶劑和微生物污染)之后經(jīng)歷變性(如聚集、解離和吸附在容器表面等)。因此，變性蛋白失去內(nèi)在的理化性質(zhì)和生理活性。蛋白質(zhì)的變性通常是不可逆的，因此蛋白質(zhì)一旦變性，它們的天然性質(zhì)可能不會(huì)恢復(fù)到初始狀態(tài)。在生物制藥行業(yè)中，使用基因重組技術(shù)制備的蛋白質(zhì)在水性制劑中的長(zhǎng)期儲(chǔ)存通常是一項(xiàng)困難的任務(wù)。為了克服水性制劑中的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性問題，通過凍干(冷凍干燥)制備了更加穩(wěn)定的治療性蛋白產(chǎn)品。但是，凍干產(chǎn)品通常伴隨有用于復(fù)原的無菌水性介質(zhì)。在復(fù)原之后，這些制劑典型地具有短的有效貯存壽命，即使在低溫(例如，5℃)下保存時(shí)也是如此。針對(duì)治療用途，蛋白質(zhì)藥物如單克隆抗體以高濃度使用，可以通過靜脈內(nèi)輸注遞送至患者，也可以優(yōu)選配制該蛋白質(zhì)治療藥用于皮下注射。然而，用于皮下注射的藥物溶液的體積比靜脈內(nèi)輸注體積小得多，從而蛋白質(zhì)必然以更高的濃度存在。在每毫升數(shù)十毫克的高的治療性蛋白質(zhì)濃度上，維持治療性蛋白質(zhì)穩(wěn)定溶解持續(xù)延長(zhǎng)的時(shí)間段是重要的。高濃度的蛋白質(zhì)溶液增加了有利于聚集的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的可能性。聚集造成許多問題，包括活性蛋白的生物利用率減少，藥物代謝動(dòng)力學(xué)改變和不想要的免疫原性(Frokjaer，S.和Otzen，D.Ε.，Nat.Rev.Drug.Discov.4:298_306(2005)；Jiskoot,W.和Crommelin，D.J.A.，EJHPPractice12：20-21(2006))。因此，防止聚集已經(jīng)變成蛋白質(zhì)藥物配制的重要事項(xiàng)。目前防止聚集常見策略之一是通過添加賦形劑至蛋白質(zhì)溶液，常使用的穩(wěn)定劑包括糖、鹽、游離氨基酸、多元醇、聚乙二醇(PEG)和可以減少蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的其他聚合物，如聚山梨酯(polysorbates)或泊洛沙姆(Nema,S.^A,PDAJournalofPharmaceuticalScienceandTechnology51:166-171(1997))?；蛘咄ㄟ^加入適當(dāng)?shù)馁x形劑(包括凍干保護(hù)劑)低壓凍干來防止蛋白質(zhì)聚集。聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)簡(jiǎn)稱PVP，是一種非離子型高分子化合物，是N-乙烯基酰胺類聚合物中最具特色，且被研究得最深、最廣泛的精細(xì)化學(xué)品品種。已發(fā)展成為非離子、陽離子、陰離子3大類，工業(yè)級(jí)、醫(yī)藥級(jí)、食品級(jí)3種規(guī)格，相對(duì)分子質(zhì)量從數(shù)千至一百萬以上的均聚物、共聚物和交聯(lián)聚合物系列產(chǎn)品，并以其優(yōu)異獨(dú)特的性能獲得廣泛應(yīng)用。其中分子量低于30000道爾頓的PVP通過腎小球?yàn)V過作用從體循環(huán)中移除。目前，PVP已經(jīng)在制藥工業(yè)中廣泛用作片劑包衣助劑并且在眼用和局部用制品中用作增黏劑。PVP也已經(jīng)最初作為血漿增容劑用于腸胃外施用并且隨后在可注射制劑(例如，抗生素、激素、鎮(zhèn)痛藥)中用來產(chǎn)生黏度。這些制劑限于通常小于500道爾頓的小分子化合物或小蛋白如激素。含有PVP的當(dāng)前可用藥品包括BicillinC-RTM(Wyeth),WycillinTM(Wyeth)和PfiZerpenTM(PfiZer)，它們均含有小分子青霉素G，以及非常低濃度(≥0.6％)的PVP。Depo-SubQProvera104TM(PharmaciaandUpjohn)含有5％PVP連同小分子醋酸甲羥孕酮。BexxarTM(GlaxoSmithKline)含有放射性標(biāo)記的抗CD20抗體連同4.4-6.6％PVP。在Bexxar的例子中，PVP特異地用作放射防護(hù)劑以減少放射性標(biāo)記的抗體因所附著放射性同位素而自輻射分解(美國(guó)專利號(hào)5，961，955和美國(guó)專利號(hào)6，338，835)。貝伐單抗公開的液體制劑配方為：bevacizumab25mg/ml，D-海藻糖60mg/ml，一水磷酸二氫鈉5.8mg/ml，無水磷酸氫二鈉1.2mg/ml，聚山梨醇酯200.4mg/ml，PH值為6.2。目前，尚未看到蛋白濃度高于25mg/ml的抗VEGF單克隆抗體的穩(wěn)定制劑組合物。如果開發(fā)更高濃度的抗VEGF單克隆抗體制劑，需要克服穩(wěn)定性問題，尤其要有效防止蛋白分子的聚集，以及保持制劑組合物具有較長(zhǎng)的貯存壽命。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明研發(fā)人員經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)，研究出一種穩(wěn)定的高濃度抗VEGF單克隆抗體制劑，該制劑包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，該制劑可有效減少高濃度抗VEGF單克隆抗體制劑中蛋白分子的聚集。在一些實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定的高濃度抗VEGF單克隆抗體制劑，優(yōu)選包 含25mg/ml至150mg/ml濃度范圍的抗VEGF單克隆抗體和1％至20％具有2000至54000道爾頓分子量范圍的PVP，更優(yōu)選1％至10％具有7000至11000道爾頓分子量范圍的PVP。優(yōu)選地，抗VEGF單克隆抗體濃度是50mg/ml至100mg/ml，更優(yōu)選50mg/ml。在一些實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定的高濃度抗VEGF單克隆抗體制劑，所述制劑其還包含糖，至少一種緩沖劑，和無菌注射用水，其中所述制劑的PH范圍為6-8。所述糖可選自蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和海藻糖及其混合物，優(yōu)選海藻糖，更優(yōu)選為60mg/ml至240mg/ml含量的海藻糖。緩沖劑可選自：包括但不限于，磷酸鹽緩沖劑、碳酸氫鹽緩沖劑、丁二酸鹽緩沖劑、乙酸鹽緩沖劑、檸檬酸鹽緩沖劑、氨基酸類、以及Tris緩沖劑，它們單獨(dú)地或者以適當(dāng)?shù)慕M合而使用，提供所希望的6-8范圍的pH值。優(yōu)選磷酸鹽緩沖劑，可以是二氫鹽和一氫鹽的混合物。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述穩(wěn)定的高濃度抗VEGF單克隆抗體制劑，其進(jìn)一步包含表面活性劑，表面活性劑可選自：包括但不限于聚山梨酯(例如聚山梨酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；山梨坦酯及其衍生物；Triton；十二烷基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；十二烷基、十四烷基、亞油酰-或硬脂酰-磺基甜菜堿；十二烷基、十四烷基、亞油?；蛴仓?肌氨酸；亞油酰、十四烷基或十六烷基-甜菜堿；月桂酰胺丙基、椰油酰胺丙基、亞油酰胺丙基、肉豆蘧酰胺丙基、棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基甜菜堿(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蘧酰胺丙基、棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油?；；撬徕c或甲基油?；M酸二鈉；和M0NAQUATTM系列(MonaIndustries,Inc.，Paterson,N.J.)；聚乙二醇、聚丙醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，Pluronics,PF68等)。在一些實(shí)施方案中，其中所述抗VEGF單克隆抗體可以是貝伐單抗(中國(guó)專利號(hào)98805914.2)或是其生物類似藥(Biosimilars)，也可以是相關(guān)改良抗體(Biobetters)，如中國(guó)專利申請(qǐng)201410850230.7中公開的抗VEGF單克隆抗體。本發(fā)明的制劑可有效防止抗VEGF單克隆抗體在長(zhǎng)期儲(chǔ)存過程中發(fā)生聚集，為我們提供了一種具有更好穩(wěn)定性的抗VEGF單克隆抗體制劑，即使在常溫下也能具有較好的穩(wěn)定性，保證制劑合理的保質(zhì)期。本發(fā)明的制劑可作為注射用水性溶液而被使用，可以根據(jù)需要稀釋成一定濃度的水性溶液靜脈注射使用，或者優(yōu)選的充裝在預(yù)充式注射器中通過皮下注射使用。本發(fā)明的制劑可用于治療人類的腫瘤疾病，尤其是結(jié)直腸癌患者。具體實(shí)施方式下面的實(shí)施例是為了舉例說明本發(fā)明并幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行和使用本發(fā)明。這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中，抗VEGF單克隆抗體(以下簡(jiǎn)寫Anti-VEGF)參照中國(guó)專利號(hào)98805914.2中公開的方法制備得到。以下實(shí)施例中，PVP購自上海舉微國(guó)際貿(mào)易有限公司，除特別注明外，PVP的含量％均為質(zhì)量體積百分比濃度(w/v)，其中：BASFKollidon30(重均分子量44K-54K道爾頓)BASFKollidon17PF(重均分子量7K-11K道爾頓)BASFKollidon12PF(重均分子量2K-3K道爾頓)BASFKollidon90F(重均分子量1M-1.5M道爾頓)。其它未標(biāo)注來源的其它材料均是通過公開的商業(yè)途徑購買得到。以下實(shí)施例中，穩(wěn)定性試驗(yàn)，相關(guān)生物學(xué)檢驗(yàn)按照中國(guó)藥典的規(guī)范進(jìn)行。SDSPAGE【聚集(非還原)和片段化(還原)】SDS-PAGE被用作一種分析技術(shù)，可以根據(jù)分子量從天然蛋白質(zhì)中分離出游離的和高分子量的種類。由于在高濃度的大分子蛋白的情況下具有高的聚集傾向，非還原SDS-PAGE被用來評(píng)定共價(jià)聚集體。由于抗體結(jié)構(gòu)輕重鏈之間，包括鉸鏈區(qū)存在許多二硫鍵，在還原SDS-PAGE下檢查蛋白質(zhì)的片段化。SE-HPLC(聚集和片段化)用尺寸排阻色譜法分離蛋白質(zhì)及其有關(guān)雜質(zhì)(基于它們的尺寸)，上述技術(shù)對(duì)于檢測(cè)單克隆抗體的聚集和片段化是有用的。差示掃描量熱法(DSC)DSC是一種用來測(cè)定蛋白質(zhì)的熱力學(xué)穩(wěn)定性的技術(shù)。單克隆抗體具有三個(gè)過渡區(qū)，Tm1相對(duì)于Fab部分，Tm2相對(duì)于Fc部分的CH2結(jié)構(gòu)域，Tm3相對(duì)于Fc部分的CH3結(jié)構(gòu)域(較高的Tm決定了較高的穩(wěn)定性)。任何本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)理解的是，將被包括在組合物中的各種組分的組合可以以任何適當(dāng)?shù)捻樞騺硗瓿桑?，可以首先添加、在中間添加或在最后添加緩沖劑，并且也以可首先添加、在中間添加或在最后添加表面活性劑等。同樣，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將會(huì)理解的是，在某些組合中這些化學(xué)物質(zhì)中的一些是不相容的，并且因此，它們可以容易地被具有相似性質(zhì)但在有關(guān)混合物中是相容的不同的化學(xué)物質(zhì)取代。實(shí)施例1PVP分子量對(duì)抗VEGF單克隆抗體蛋白制劑的影響研究25℃下含有不同分子量PVP的抗VEGF單克隆抗體蛋白制劑的穩(wěn)定性。所述制劑除PVP外還含有其它如表1所列的賦形劑。表1：含不同分子量PVP的抗VEGF單克隆抗體蛋白制劑上述樣品制劑在25℃下孵育一個(gè)月，然后通過SDS-PAGE進(jìn)行分析。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，與F1、F2和F3制劑相比，F(xiàn)4具有更多的聚集和降解，但是F1、F2和F3的聚集體和片段沒有太多差異。由于F1、F2和F3在25℃溫度下沒有觀察到顯著性差異，因此我們?cè)?0℃的溫度下進(jìn)一步研究這三個(gè)制劑的聚集情況。為了在F1、F2和F3之間找出最佳的聚集抑制劑，使這三個(gè)制劑均在50℃下帶電3天。然后通過SE-HPLC和差示掃描量熱法(DSC)進(jìn)行分析。表2：不同分子量水平的PVP對(duì)制劑穩(wěn)定性的影響(備注：F0*表示不含有PVP，但含有其他如表1所列賦形劑的抗體制劑)結(jié)果表明，低分子量PVP抑制蛋白的聚集和片段化。所用PVP的分子量是重要的。高分子量PVP(重均MW1.2百萬道爾頓)的添加導(dǎo)致聚集的增加。分子量范圍2000至54000道爾頓的低分子量PVP能抑制蛋白質(zhì)的聚集，因而可改善其溶解度。更優(yōu)選的低分子量PVP范圍為7000至11000道爾頓。實(shí)施例2PVP含量對(duì)抗VEGF單克隆抗體蛋白制劑的影響研究了含有不同含量低分子量PVP的蛋白制劑。所述制劑除PVP外還含有其它如表3所列的賦形劑。表3：制劑成分表如表3中各制劑在50℃下帶電3天，然后通過SE-HPLC和差示掃描量熱法(DSC)進(jìn)行分析。表4：不同含量的低分子量PVP對(duì)制劑穩(wěn)定性的影響結(jié)果表明，添加1％至20％的低分子量PVP可以更好抑制高濃度蛋白的聚集和片段化。優(yōu)選的低分子量PVP含量范圍為1％至10％，更優(yōu)選的含量范圍為1％至5％。實(shí)施例3糖對(duì)抗VEGF單克隆抗體蛋白制劑的影響評(píng)價(jià)不同水平的糖對(duì)抗VEGF單克隆抗體蛋白制劑穩(wěn)定性的影響。我們將樣品放置于-20℃、8℃和25℃，60％濕度的條件下并在不同時(shí)間點(diǎn)通過SE-HPLC方法檢測(cè)制劑中蛋白質(zhì)的聚集化情況。表5：抗VEGF單克隆抗體蛋白制劑配方表Anti-VEGF150mg/ml聚山梨酯201mg/ml一水磷酸二氫鈉8.7mg/ml無水磷酸氫二鈉1.8mg/mlKollidon17PF10％海藻糖具體見表6PH6-8表6：糖對(duì)抗VEGF單克隆抗體蛋白制劑穩(wěn)定性的影響由表6可知，糖對(duì)抗VEGF單克隆抗體蛋白制劑穩(wěn)定性有很大影響。當(dāng)海藻糖為60mg/ml至240mg/ml時(shí)，4℃貯存一年，蛋白純度仍可達(dá)到98％以上，保持制劑合理的貯存壽命。實(shí)施例4抗VEGF單克隆抗體制劑的配制及穩(wěn)定性試驗(yàn)表7：抗VEGF單克隆抗體溶液制劑配方Anti-VEGF50mg/ml海藻糖60mg/ml一水磷酸二氫鈉5.8mg/ml無水磷酸氫二鈉1.2mg/mlKollidon17PF5％帕洛沙姆1888mg/mlPH6-7先按表7中除抗體蛋白以外的賦形劑濃度配置溶液，使各賦形劑組分充分溶解在80％-90％的水溶液中；然后加入純化后的抗體蛋白原液，調(diào)整濃度至50mg/ml，并定容至100％。按上述方法配制表7所述配方的溶液制劑。然后在-20℃、5±3℃和25±2℃下儲(chǔ)存抗VEGF單克隆抗體溶液制劑，在儲(chǔ)存零時(shí)間、1個(gè)月、3個(gè)月以及6個(gè)月之后，通過SE-HPLC分析該溶液制劑的穩(wěn)定性。結(jié)果見表8。表8：溶液制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(-20℃、5±3℃、25±2℃)(備注：每個(gè)溫度測(cè)定3組平行制劑取平均值)另外，我們還將配制好的表7所述配方的抗VEGF單克隆抗體溶液制劑在空氣層流下用0.2μm過濾器滅菌并在45℃下儲(chǔ)存。通過SE-HPLC分析該制劑在儲(chǔ)存零時(shí)間、7天、15天、21天之后的穩(wěn)定性。結(jié)果見表9。表9：溶液制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(45℃)測(cè)定a零時(shí)間7天15天21天30天SE-HPLC測(cè)定的聚集化％0.051.201.802.804.50SE-HPLC測(cè)定的片段化％00.100.200.401.20(備注：每個(gè)溫度測(cè)定3組平行制劑取平均值)由上述表8-表9可知，本發(fā)明的抗VEGF單克隆抗體溶液制劑穩(wěn)定性較好，即使在常溫或更高溫度的情況下仍具有較好的穩(wěn)定性。上述實(shí)施例中的F1-F3、F5-F8，以及表5-表6中的各制劑，按照實(shí)施例4所述方法進(jìn)行配制并開展穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果均顯示出蛋白聚集受到抑制以及良好的穩(wěn)定性。當(dāng)前第1頁1 2 3