本發(fā)明涉及中醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種適用于痰濕質(zhì)的抗肺癌藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：肺癌為當(dāng)前世界各地最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。癌癥的發(fā)生是綜合因素引起，其中和人的體質(zhì)有很大關(guān)系。中醫(yī)界認(rèn)為，人的體質(zhì)可分為9種，即平和質(zhì)、氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、濕熱質(zhì)、氣郁質(zhì)、痰濕質(zhì)、血瘀質(zhì)、特稟質(zhì)。除了平和質(zhì)，其他8種均屬于“偏頗”體質(zhì)。通過多年臨床總結(jié)，醫(yī)生們發(fā)現(xiàn)，氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、氣郁質(zhì)、痰濕質(zhì)、血瘀質(zhì)，這6種體質(zhì)的人易患腫瘤。其中，痰濕質(zhì)是諸多體質(zhì)中的一種重要的體質(zhì)，指當(dāng)人體臟臟功能失調(diào)，易引起氣血津液運化失調(diào)，水濕停聚，聚濕成痰而成痰濕內(nèi)蘊表現(xiàn)，常表現(xiàn)為體形肥胖，腹部肥滿，胸悶，痰多，容易困倦，身重不爽，喜食肥甘醇酒，舌體胖大，舌苔白膩，多因寒濕侵襲、飲食不節(jié)，先天稟賦、年老久病、缺乏運動而發(fā)病。中醫(yī)認(rèn)為，環(huán)境中有“風(fēng)寒暑濕燥火”六淫邪氣而“濕”為其中之一。由于濕氣到痰濕，濕氣是基礎(chǔ)。中醫(yī)講“濕聚成痰”，當(dāng)陽氣不足，即過多的濕氣不被運化，聚集在一起，就形成黏滯不化的痰濕。臨床表現(xiàn)有平時可以看到的，如從肺咳出來的痰，還有看不到的，如在脾胃表現(xiàn)為噯氣腹脹、飲食不振，在腸道表現(xiàn)為息肉，在婦科表現(xiàn)為子宮肌瘤，在肺部就可能發(fā)展成肺癌。肺癌患者在確診時絕大多數(shù)已屬中晚期，應(yīng)用單一治療方法均難以獲得滿意療效。目前，包括中醫(yī)藥在內(nèi)的綜合治療已經(jīng)顯示出較好的療效，中醫(yī)藥治療腫瘤是我國的特色和優(yōu)勢，通過辨證論治配合化療等可以起到減毒增效，帶瘤延年的良好效果。但是，目前中醫(yī)多根據(jù)肺癌不同分型進(jìn)行治療，例如，申請?zhí)?01410668907.5、發(fā)明名稱為“一種適用于熱毒熾盛型的肺抑瘤膏及其制備方法”的專利申請公開了一種對熱毒熾盛型肺癌起到抑癌抗瘤的效果的藥物，但上述發(fā)明專利申請針對的是熱毒熾盛型肺癌，并不一定適用其他類型肺癌且起到很好的治療效果。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種適用于痰濕質(zhì)的抗肺癌藥物及其制備方法，該藥物根據(jù)中醫(yī)理論，以扶正祛邪、解郁散瘀為治則，可以明顯抑制痰濕質(zhì)肺癌腫瘤的增長和轉(zhuǎn)移。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種適用于痰濕質(zhì)的抗肺癌藥物，所述藥物包括以下原料藥材：黨參、蛇舌草、半枝蓮、夏枯草、山慈菇、荔枝核、生薏米、浙貝、厚樸、半夏和甘草；所有所述原料藥材均為炮制后的飲片。所述藥物由以下重量份數(shù)的原料藥材制成：黨參8-22份、蛇舌草27-35份、半枝蓮27-32份、夏枯草18-24份、山慈菇20-28份、荔枝核20-26份、生薏米27-35份、浙貝15-20份、厚樸7-17份、半夏7-13份和甘草5-15份。所述藥物優(yōu)選地由以下重量份數(shù)的原料藥材制成：黨參12-16份、蛇舌草28-31份、半枝蓮28-32份、夏枯草23-25份、山慈菇22-25份、荔枝核22-25份、生薏米28-32份、浙貝15-19份、厚樸10-13份、半夏7-11份和甘草6-11份。所述藥物還可以優(yōu)選為由以下重量份數(shù)的原料藥材制成：黨參15份、蛇舌草30份、半枝蓮30份、夏枯草24份、山慈菇24份、荔枝核24份、生薏米30份、浙貝18份、厚樸12份、半夏9份和甘草9份。所述藥物又可以優(yōu)選為由以下重量份數(shù)的原料藥材制成：黨參8份、蛇舌草35份、半枝蓮27份、夏枯草24份、山慈菇20份、荔枝核20份、生薏米35份、浙貝15份、厚樸17份、半夏13份和甘草5份。所述藥物由以下重量份數(shù)的原料藥材制成：黨參22份、蛇舌草27份、半枝蓮32份、夏枯草18份、山慈菇28份、荔枝核26份、生薏米27份、浙貝20份、厚樸7份、半夏7份和甘草15份。所述藥物優(yōu)選地由以下重量份數(shù)的原料藥材制成：黨參16份、蛇舌草28份、半枝蓮28份、夏枯草25份、山慈菇22份、荔枝核22份、生薏米32份、浙貝15份、厚樸10份、半夏7份和甘草6份。為了更好的實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了一種適用于痰濕質(zhì)的抗肺癌藥物的制備方法，其制備方法包括：(1)按所述重量份數(shù)稱取所有原料藥材，加入涼水，浸泡2-3小時，然后煮沸2-3小時，過濾，得藥液一，藥渣備用；(2)向步驟(1)中的藥渣加溫水，煎煮1-2小時，過濾，得藥液二和藥渣；(3)將藥液一和藥液二合并后過濾，繼續(xù)加熱煎煮，在煎煮過程中并加入阿膠、黃酒和蜂蜜，并不斷攪拌，煎煮至阿膠完全烊化，過濾后繼續(xù)加熱直至攪拌成膏滋；其中，阿膠、黃酒和蜂蜜的添加量分別為10-14重量份、9-11重量份和12-17重量份；優(yōu)選地，阿膠、黃酒和蜂蜜的添加量分別為12重量份、10重量份和15重量份；(4)將膏滋趁熱倒入自動分裝機內(nèi)進(jìn)行分裝工作，按照每袋20g進(jìn)行分裝，得到成品，放置在干燥環(huán)境備取。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的藥物依據(jù)中醫(yī)藥理論，縱觀全方，配伍合理，組方嚴(yán)謹(jǐn)，藥精力專，符合中醫(yī)藥理論，諸藥合用，共奏滋陰清熱、化痰祛濕、扶正祛邪、抑癌抗瘤之效。附圖說明圖1為本發(fā)明對比試驗中藥物試驗(七)的樣品基因組DNA電泳圖。圖2為本發(fā)明對比試驗中藥物試驗(七)的樣品PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。具體實施方式中醫(yī)體質(zhì)是中醫(yī)基礎(chǔ)理論的重要組成部分，是一門新興學(xué)科。體質(zhì)現(xiàn)象是人類生命活動的一種重要表現(xiàn)形式，是指人體生命過程中，在先天稟賦和后天獲得的基礎(chǔ)上所形成的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能和心理狀態(tài)方面綜合的、相對穩(wěn)定的固有特質(zhì)，是人類在生長、發(fā)育過程中所形成的與自然、社會環(huán)境相適應(yīng)的人體個性特征。體質(zhì)與證既有著本質(zhì)的差別，又有著密切聯(lián)系，體質(zhì)在許多情況下決定著機體對某些疾病的易罹性和病變過程中的傾向性。體質(zhì)的差異導(dǎo)致病證的多變性：病因相同，體質(zhì)不同，證亦不同；疾病相同，體質(zhì)不同，證亦不同；疾病不同，體質(zhì)相同，證亦相同，即體質(zhì)是同病異證、異病同證的基礎(chǔ)。本發(fā)明正是從體質(zhì)出發(fā)，針對痰濕體質(zhì)肺癌提供了一種具有抑瘤抗癌功效的藥物，包括以下原料藥材：黨參、蛇舌草、半枝蓮、夏枯草、山慈菇、荔枝核、生薏米、浙貝、厚樸、半夏和甘草。其中，黨參為君藥。黨參甘、平，歸脾、肺二經(jīng)，能補脾肺氣，補血、生津?！侗静菡x》：“補脾養(yǎng)胃，潤肺生津，健運中氣，本與人參不甚相遠(yuǎn)”；《本草從新》：“補中益氣，和脾胃，除煩渴。中氣微虛，用以調(diào)補，甚為平安”。白花蛇舌草、半枝蓮、薏苡仁、厚樸、半夏為臣藥。白花蛇舌草微苦、甘，寒，歸胃、大腸、小腸經(jīng)。善解毒清熱，利濕通淋。半枝蓮味辛、微苦，平，入心、小腸、肺經(jīng)，具清熱解毒、利水消腫、活血化瘀之效。薏苡仁甘、淡，涼，歸脾、胃、肺經(jīng)，有健脾利水、消腫、除痹、清熱排膿之效?！侗静菥V目》：“薏苡仁，陽明藥也，能健脾益胃。虛則補其母，故肺痿、肺癰用之”。厚樸苦、辛、溫，歸脾、胃、肺、大腸經(jīng)。其功效為燥濕消痰、下氣除滿。半夏辛、溫。歸脾、胃、肺經(jīng)。燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)。浙貝、夏枯草、山慈菇、荔枝核為佐藥。浙貝苦、寒，歸肺、心經(jīng)，有清熱解毒、散結(jié)消癰之功效?！侗静菥V目拾遺》：“解毒利痰，開宣肺氣，凡肺家夾風(fēng)火有痰者宜此。”夏枯草辛、苦，寒，歸肝、膽二經(jīng)，清熱瀉火，散結(jié)消腫。《重慶堂筆記》：“夏枯草，味辛而甘，故散結(jié)之中，兼有合陽養(yǎng)陰之功?！鄙酱裙礁省⑽⑿?，涼，歸肝、脾二經(jīng)，清熱解毒，散結(jié)消癰。荔枝核辛、微苦，溫。歸肝、胃經(jīng)。行氣散結(jié)，散寒止痛。甘草甘、平，功效補中益氣，祛痰止咳，緩急止痛，清熱解毒。生用甘草主取其清熱解毒之效，又調(diào)和諸藥，為使藥?？v觀全方，配伍合理，組方嚴(yán)謹(jǐn)，藥精力專，符合中醫(yī)藥理論，諸藥合用，共奏滋陰清熱、化痰祛濕、扶正祛邪、抑癌抗瘤之效。以下采用實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，借此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題，并達(dá)成技術(shù)效果的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。實施例1本發(fā)明實施例提供了一種用于治療痰濕質(zhì)肺癌的藥物，由以下重量份數(shù)的原料藥材制成：黨參150g、蛇舌草300g、半枝蓮300g、夏枯草240g、山慈菇240g、荔枝核240g、生薏米300g、浙貝180g、厚樸120g、半夏90g和甘草90g；所有原料藥材均為炮制后的飲片；其制備方法為：(1)按上述重量稱取所有原料藥材，加入涼水，浸泡3小時，然后煮沸2小時，過濾，得藥液一，藥渣備用；(2)向步驟(1)中的藥渣加溫水，煎煮1小時，過濾，得藥液二和藥渣；(3)將藥液一和藥液二合并后過濾，繼續(xù)加熱煎煮，在煎煮過程中并加入阿膠、黃酒和蜂蜜，并不斷攪拌，煎煮至阿膠完全烊化，過濾后繼續(xù)加熱直至攪拌成膏滋；其中，阿膠、黃酒和蜂蜜的添加量分別為100g、90g和170g；(4)將膏滋趁熱倒入自動分裝機內(nèi)進(jìn)行分裝工作，按照每袋20g進(jìn)行分裝，得到成品，放置在干燥環(huán)境備取。實施例2本發(fā)明實施例提供了一種用于治療痰濕質(zhì)肺癌的藥物，由以下重量份數(shù)的原料藥材制成：黨參80g、蛇舌草350g、半枝蓮270g、夏枯草240g、山慈菇200g、荔枝核200g、生薏米350g、浙貝150g、厚樸170g、半夏130g和甘草50g；所有原料藥材均為炮制后的飲片；其制備方法為：(1)按上述重量稱取所有原料藥材，加入涼水，浸泡2.5小時，然后煮沸2小時，過濾，得藥液一，藥渣備用；(2)向步驟(1)中的藥渣加溫水，煎煮1.5小時，過濾，得藥液二和藥渣；(3)將藥液一和藥液二合并后過濾，繼續(xù)加熱煎煮，在煎煮過程中并加入阿膠、黃酒和蜂蜜，并不斷攪拌，煎煮至阿膠完全烊化，過濾后繼續(xù)加熱直至攪拌成膏滋；其中，阿膠、黃酒和蜂蜜的添加量分別為120g、100g和150g；(4)將膏滋趁熱倒入自動分裝機內(nèi)進(jìn)行分裝工作，按照每袋20g進(jìn)行分裝，得到成品，放置在干燥環(huán)境備取。實施例3本發(fā)明實施例提供了一種用于治療痰濕質(zhì)肺癌的藥物，由以下重量份數(shù)的原料藥材制成：黨參220g、蛇舌草270g、半枝蓮320g、夏枯草180g、山慈菇280g、荔枝核260g、生薏米270g、浙貝200g、厚樸70g、半夏70g和甘草150g；所有原料藥材均為炮制后的飲片；其制備方法為：(1)按上述重量稱取所有原料藥材，加入涼水，浸泡2小時，然后煮沸3小時，過濾，得藥液一，藥渣備用；(2)向步驟(1)中的藥渣加溫水，煎煮2小時，過濾，得藥液二和藥渣；(3)將藥液一和藥液二合并后過濾，繼續(xù)加熱煎煮，在煎煮過程中并加入阿膠、黃酒和蜂蜜，并不斷攪拌，煎煮至阿膠完全烊化，過濾后繼續(xù)加熱直至攪拌成膏滋；其中，阿膠、黃酒和蜂蜜的添加量分別為140g、110g和120g；(4)將膏滋趁熱倒入自動分裝機內(nèi)進(jìn)行分裝工作，按照每袋20g進(jìn)行分裝，得到成品，放置在干燥環(huán)境備取。實施例4本發(fā)明實施例提供了一種用于治療痰濕質(zhì)肺癌的藥物，由以下重量份數(shù)的原料藥材制成：黨參160g、蛇舌草280g、半枝蓮280g、夏枯草250g、山慈菇220g、荔枝核220g、生薏米320g、浙貝150g、厚樸100g、半夏70g和甘草60g；所有原料藥材均為炮制后的飲片；其制備方法為：(1)按上述重量稱取所有原料藥材，加入涼水，浸泡2小時，然后煮沸2小時，過濾，得藥液一，藥渣備用；(2)向步驟(1)中的藥渣加溫水，煎煮2小時，過濾，得藥液二和藥渣；(3)將藥液一和藥液二合并后過濾，繼續(xù)加熱煎煮，在煎煮過程中并加入阿膠、黃酒和蜂蜜，并不斷攪拌，煎煮至阿膠完全烊化，過濾后繼續(xù)加熱直至攪拌成膏滋；其中，阿膠、黃酒和蜂蜜的添加量分別為140g重量份、90g和120g；(4)將膏滋趁熱倒入自動分裝機內(nèi)進(jìn)行分裝工作，按照每袋20g進(jìn)行分裝，得到成品，放置在干燥環(huán)境備取。證候是中醫(yī)的核心和靈魂，而動物實驗又是連接醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與臨床的橋梁與紐帶，因此開展以病證結(jié)合原則為指導(dǎo)的動物實驗是中醫(yī)基礎(chǔ)研究的必經(jīng)之路。但是由于動物和人體之間的差異性(如語言表述癥狀、舌象、脈象、膚色和情志癥狀等)，決定了中醫(yī)證候在動物身上模擬與判斷的難度較大。因此，以中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)為綱，與動物身上特有的具有診斷意義的信息特征進(jìn)行整合對比、等效關(guān)聯(lián)，并結(jié)合精確、量化的現(xiàn)代生理病理生化指標(biāo)，是評價中藥對動物疾病與證候療效的有效途徑。因此，本發(fā)明通過動物模型進(jìn)行以下對比試驗，用于證明本發(fā)明的藥物在治療痰濕質(zhì)肺癌具有明顯優(yōu)勢。對比試驗本實驗主要試劑及藥品如下：干擾素-γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫分析試劑盒：南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-2(IL-2)酶聯(lián)免疫分析試劑盒：南京建成生物工程研究所中；南海牌香煙：北京卷煙廠生產(chǎn)，焦油量8mg，煙氣煙堿量：0.8mg，煙氣一氧化碳含量：10mg；氫化可的松注射液，購自天津藥業(yè)焦作有限公司；鹽酸腎上腺素注射液，規(guī)格1ml：1mg，購自上海禾豐制藥有限公司；小鼠促甲狀腺素(TSH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒；促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)酶聯(lián)分析試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供；睪酮(T)放射免疫試劑盒，由天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司提供；環(huán)磷酸腺苷(cAMP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒：南京建成生物工程研究所；促卵泡素(FSH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒：南京建成生物工程研究所；高脂飼料，購于山東省疾病控制和預(yù)防中心；白細(xì)胞介素放射免疫測試試劑盒(IL-6)，購自南京建成生物工程研究所；血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)酶聯(lián)免疫分析試劑盒：南京建成生物工程研究所；DAB顯色劑：購于北京中杉金橋生物科技有限公司；OVA(Grade)、AI(OH)3購自Sigma，USA；0.9％氯化鈉注射液，購自中國大冢制藥有限公司。實驗器材如下：超凈工作臺：北京長城空氣凈化工程公司動物染毒箱：上海玉研科學(xué)儀器有限公司高壓滅菌鍋：日本Sanyo公司酶標(biāo)儀：美國Thermo公司倒置顯微鏡：日本Olympus公司解剖顯微鏡：日本Nikon公司CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：德國Teraeus公司游標(biāo)卡尺：上海實驗測量設(shè)備公司超速冷凍離心機：德國Hermle公司精密分析天平：瑞士Mettler公司-80℃冰箱：日本Sanyo公司普通冰箱：青島海爾股份有限公司細(xì)胞計數(shù)板：上海精密儀器儀表有限公司微量移液器：德國Eppendor公司自動血流變測試儀，由山東省疾病控制中心提供。一、建立平和體質(zhì)和痰濕體質(zhì)模型1實驗動物動物品系C57BL/6近交系小黑鼠，等級SPF級別，雄性，6-8周齡，體重18±2g，80只，質(zhì)量檢測單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，出售單位：北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2009-0004。2試驗方法2.1喂養(yǎng)方法喂養(yǎng)于SPF級動物房(山東省疾病控制中心動物房)，室溫(22±2)℃，濕度(55±5)％，人工光照明暗各12h，通風(fēng)良好；小鼠維持飼料，購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司，許可證號：SCXK(京)2009-0012；自由飲水；根據(jù)墊料情況及時更換墊料。2.2分組及造模方法2.2.1分組方法：將80只Lewis小鼠隨機分為兩個實驗組，每個實驗組40只，分別為平和質(zhì)組和痰濕質(zhì)組。2.2.2造模方法：以不同的飼養(yǎng)條件分別飼養(yǎng)兩組小鼠兩周，兩個實驗組的飼養(yǎng)條件具體如下：(1)平和質(zhì)組：喂以普通飼料，自由飲水，室溫(22±2)℃，濕度(55±5)％，人工光照明暗各12h。通風(fēng)良好條件下,連續(xù)喂養(yǎng)14天。(2)痰濕質(zhì)組：在上述平和質(zhì)組飼養(yǎng)環(huán)境相同的情況下，僅將普通飼料更改為小鼠高脂飼料，連續(xù)喂養(yǎng)14天。3實驗評價指標(biāo)及結(jié)果3.1小鼠體重觀察各實驗組動物在實驗開始前和實驗結(jié)束后各測一次體重。體重測量時間為9:00am-10:00am，計算出兩個實驗組小鼠實驗前后的平均體重，結(jié)果如表1所示。表1兩實驗組小鼠實驗前后平均重量對照表由上述數(shù)據(jù)可知，痰濕質(zhì)組與平和質(zhì)組小鼠體重進(jìn)行比較，經(jīng)兩獨立樣本的T檢驗，P＜0.05，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，各組數(shù)據(jù)體重存在差異性。其中，痰濕質(zhì)組小鼠平均體重明顯小于平和質(zhì)組小鼠平均體重。3.2小鼠宏觀表征觀察每日觀察并記錄兩個實驗組小鼠的生活習(xí)性、精神狀態(tài)、進(jìn)食量、毛發(fā)情況、大小便情況、皮膚及脈絡(luò)顏色、淤血改變等情況。觀察結(jié)果如下：(1)平和質(zhì)組：小鼠表現(xiàn)為活潑好動，反應(yīng)靈敏，背部毛色有光澤,進(jìn)食水量正常；(2)痰濕質(zhì)組：小鼠表現(xiàn)為倦怠懶動，行動緩慢，體重增加較快，形體較平和組肥胖，前期毛色油亮發(fā)光，后期皮毛泛潮，小鼠逐漸進(jìn)食、飲水量減少，且有撓口行為。3.3血液指標(biāo)檢測及方法于實驗第15天，自兩組小鼠各隨機抽取5只小鼠，采用眼眶取血方法取血，取血后加入無抗凝劑的試管中，室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心25分鐘(2500轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上層血清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。將血清利用酶聯(lián)免疫檢測儀(酶標(biāo)儀)檢測TG、CHOL、LDL的含量。結(jié)果如表2所示。其中TG、CHOL、LDL由山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科提供表2兩組小鼠血清中TG、CHOL、LDL含量對照表組別CHOL(mmol/L)TG(mmol/L)LDL(mmol/L)平和質(zhì)組1.61±0.300.38±0.100.27±0.10痰濕質(zhì)組14.02±2.89*1.53±0.15**12.51±2.73***由上述數(shù)據(jù)可知，痰濕質(zhì)組與平和質(zhì)組小鼠血清中TG、CHOL、LDL相比顯著差異，且有意義(P＜0.05)。綜上，由表1和表2的數(shù)據(jù)以及宏觀表征觀察可知，兩組小鼠在體重和表征上出現(xiàn)明顯差異，血清中TG、CHOL、LDL含量也存在顯著差異，且痰濕質(zhì)組小鼠從表征及測定數(shù)據(jù)均與痰濕體質(zhì)小鼠特征相吻合，說明本體質(zhì)建模實驗穩(wěn)定有效，建模成功。二、建立平和體質(zhì)和痰濕體質(zhì)的肺癌模型1實驗動物及細(xì)胞株于上述體質(zhì)建模后的兩個實驗組小鼠(每組40只)作為本次建模的實驗動物，且分別作為平和質(zhì)組和痰濕質(zhì)組。Lewis肺癌細(xì)胞株，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供并予以接種，接種用小鼠自鼠種隨機抽取5只進(jìn)行荷瘤。接種成功后送往實驗室進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。2實驗方法及步驟2.1首次腫瘤細(xì)胞接種取荷Lewis肺癌細(xì)胞的C57BL/6小鼠的腫瘤作為瘤源，將小鼠脫頸椎處死，超凈工作臺無菌條件下剝離出生長良好淡粉色無壞死的腫瘤組織。用組織剪剪成小塊，按瘤(g)：生理鹽水(ml)1:3的比例用玻璃勻漿器單向研磨成勻漿，過200目尼龍網(wǎng)，成單細(xì)胞懸液，收集于離心管內(nèi)。用超速冷凍離心機，1000r/min離心3min，棄上清，加入生理鹽水，同法離心洗滌一次。取腫瘤細(xì)胞懸液,加入0.4％臺盼藍(lán)染液，臺盼藍(lán)拒染實驗示活細(xì)胞大于95％，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0*107/ml。在無菌條件下，用注射器在兩個實驗組小鼠的腋窩處接種腫瘤細(xì)胞懸液0.2ml/只(約含瘤細(xì)胞2.0*106個)，每次接種前混勻懸液，細(xì)胞注射完成后稍適按壓針孔，防止液體溢出。接種后第5天，觀察兩試驗組小鼠荷瘤成功與否，荷瘤成功小鼠即為肺癌建模成功。三、藥物實驗分別選取上述兩組中荷瘤成功的小鼠30只，作為藥物實驗的動物模型，并每組30只小鼠隨機分成兩個小組，分別為平和質(zhì)對照組、平和質(zhì)給藥物、痰濕質(zhì)對照組和痰濕質(zhì)給藥組，每個小組15只小鼠。具體給藥方法如表3所示：表3各實驗小組小鼠的給藥方法注：上述給藥劑量相當(dāng)于70kg成人按體表面積折算劑量的等效劑量，同時相當(dāng)于單位體重人用量的10倍。藥效檢測指標(biāo)及結(jié)果：(一)體重：按照上述給藥方式連續(xù)用藥四周后，用電子天平稱各組小鼠體重并記錄結(jié)果如表4所示；表4給藥后各實驗小組小鼠平均體重對照表由上述數(shù)據(jù)可以看出，單因素方差分析，大組間差異示：P＜0.05，具有顯著的差異性；進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，每種體質(zhì)分組的給藥組與非給藥組比較：P＜0.05，具有顯著差異性；不同體質(zhì)給藥組之間進(jìn)行單因素方差分析：P＞0.05，不具有差異性。(二)腫瘤體積：于接種后第7天、10天、13天、16天、19天、22天、25天、28天，用精度為0.1mm的游標(biāo)卡尺測量并記錄小鼠皮下瘤結(jié)節(jié)大小，計算腫瘤體積，計算公式：V(cm3)＝0.52×ab2(a為瘤體最長徑，b為最短徑)。計算每小組小鼠腫瘤體積的平均值，結(jié)果如表5所示。表5給藥期間各小組小鼠腫瘤平均體積改變情況(cm3)通過上述數(shù)據(jù)可以看出，平和質(zhì)對照組、平和質(zhì)給藥組和痰濕質(zhì)對照組的小鼠腫瘤體積增長速度基本相同，在藥物作用下，自中期開始給藥組體積增長速度逐漸放慢，而對照組組的腫瘤增長速度有較前增快的趨勢。每種體制給藥組和對照組進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05。(三)瘤重及抑瘤率：于接種后28天后引頸脫臼處死各小組小鼠，迅速剝離小鼠皮下腫瘤，稱瘤重，計算各組腫瘤抑制率，結(jié)果如表6所示。其中，腫瘤抑制率的計算公式為：腫瘤抑制率＝(平和質(zhì)對照組平均瘤重－待測組平均瘤重)/平和質(zhì)對照組平均瘤重×100％。表6各實驗小組小鼠瘤體最終重量對照表(g)組別數(shù)量(只)瘤重(g)抑瘤率(％)平和質(zhì)對照組157.86±1.270平和質(zhì)給藥組155.91±1.4324.81痰濕質(zhì)對照組159.02±1.11-14.76痰濕質(zhì)給藥組155.61±1.1328.63通過上述數(shù)據(jù)可以看出，每種體質(zhì)兩個小組經(jīng)行比較：平和質(zhì)給藥組與平和質(zhì)對照組比較：P＜0.05，具有極顯著差異性；痰濕質(zhì)給藥組與痰濕質(zhì)對照組比較：P＜0.05，具有顯著差異性。各種不同體質(zhì)給藥組比較P>0.05，無明顯差異。說明本發(fā)明的藥物對小鼠腫瘤的生長有明顯的抑制作用，且對兩種體質(zhì)模型小鼠腫瘤抑制效果均表現(xiàn)良好，兩種體質(zhì)小鼠抑瘤率無明顯差異。(四)肺轉(zhuǎn)移抑制率：小鼠處死后，剝離出兩側(cè)肺臟。用4％多聚甲醛溶液固定24h。于解剖顯微鏡下計數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤灶，轉(zhuǎn)移灶為白色或者乳白色結(jié)節(jié)樣的隆起。本試驗采用計數(shù)在雙盲條件下完成，結(jié)果如表7所示。其中，肺轉(zhuǎn)移抑制率的計算公式為：肺轉(zhuǎn)移抑制率(％)＝(平和質(zhì)對照組平均肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)-待測組各自平均肺表面轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù))/平和質(zhì)對照組平均肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)×100％。表7各實驗小組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶個數(shù)及肺轉(zhuǎn)移抑制率組別數(shù)量(只)肺轉(zhuǎn)移灶個數(shù)(個)肺轉(zhuǎn)移抑制率(％)平和質(zhì)對照組1511.30±2.950平和質(zhì)給藥組158.35±1.7826.10痰濕質(zhì)對照組1512.20±1.50-7.96痰濕質(zhì)給藥組158.45±2.2025.22通過上述數(shù)據(jù)可以看出，每種體質(zhì)兩個小組進(jìn)行比較：平和質(zhì)給藥組與平和質(zhì)對照組比較：P＜0.05，具有極顯著差異性；痰濕質(zhì)給藥組與痰濕質(zhì)對照組比較：P＜0.05，具有顯著差異；各種不同體質(zhì)給藥組比較P>0.05，無明顯差異。說明本發(fā)明的藥物可以降低小鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移率，而且針對上述兩種體質(zhì)無明顯差異。(五)腫瘤組織的VEGF免疫組化檢測各實驗小組隨機抽取10只小鼠的腫瘤組織制成標(biāo)本，并將其分別放入10％中性福爾馬林溶液中固定24h，行4μM連續(xù)切片2張，行VEGF染色，微波抗原修復(fù)，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。按照SABC法染色試劑盒的說明進(jìn)行免疫組化的操作。采用免疫組織化學(xué)法SP法計數(shù)檢測VEGF-C表達(dá)，所有標(biāo)本經(jīng)固定、包埋、切片后常規(guī)行HE染色。一抗為兔抗鼠單克隆抗體，1：100稀釋，生物素化二抗為山羊抗小鼠IgG。各實驗小組VEGF免疫組化結(jié)果如表8所示。表8各實驗小組腫瘤組織中陽性細(xì)胞VEGF-C平均光密度對照表組別數(shù)量(只)平均光密度平和質(zhì)對照組100.158±0.033平和質(zhì)給藥組100.131±0.040痰濕質(zhì)對照組100.184±0.032痰濕質(zhì)給藥組100.143±0.015通過上述數(shù)據(jù)可以看出，每種體質(zhì)兩個小組進(jìn)行比較：平和質(zhì)給藥組與平和質(zhì)對照組比較：P＜0.05，具有極顯著差異性；痰濕質(zhì)給藥組與痰濕質(zhì)對照組比較：P＜0.05，具有顯著差異性。兩種不同體質(zhì)給藥組間比較：P>0.05，無明顯差異。說明本發(fā)明藥物能夠降低VEGF表達(dá)減少腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤生長。(六)血清檢測指標(biāo)(TC、TG、LDL-C含量)在實驗結(jié)束后處死之前，在潔凈的環(huán)境下分別對痰濕質(zhì)對照組和痰濕質(zhì)給藥組的小鼠眼底取血，并將血樣放在抗凝血試管中。用酶聯(lián)免疫法測定外周血血清中TC、TG、LDL-C含量，結(jié)果如表9所示。表9兩實驗小組小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量(pg/ml)由上述數(shù)據(jù)可知，痰濕質(zhì)給藥組的小鼠血清中TC、TG、LDL-C含量明顯低于痰濕質(zhì)對照組，且結(jié)合體質(zhì)造模的數(shù)據(jù)可知，痰濕質(zhì)給藥組小鼠血清中的TC、TG、LDL-C含量非常接近體質(zhì)造模中平和質(zhì)組小鼠的數(shù)值，說明本發(fā)明的藥物具有降低總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇的效果，進(jìn)而抑制腫瘤的生長，起到抗癌的作用。(七)EGFR基因的18，19，20，21號外顯子測序1.1材料和試劑1)組織樣本：每小組隨機抽取10只lewis荷瘤小鼠，取出瘤體稱重后，每個瘤體取2塊米粒大小的腫瘤組織,同一瘤體選取其中一個腫瘤組織作為待測樣品,將待測樣品分別放入標(biāo)好號的進(jìn)口無RNA酶的EP管中，立刻放入液氮中；2)TaqDNA聚合酶：寶生物公司產(chǎn)品3)DNA分子量Marker：寶生物公司產(chǎn)品4)測序試劑：ABIBigDye3.11.2儀器設(shè)備1)PCR儀：ABI97002)凝膠成像分析儀：BIO-RAD3)電泳儀(DYY-6C型)：北京六一儀器廠4)測序儀：ABI3730XL1.3實驗方法(1)引物序列fw-18：TCAGGTCTGCTCCCTTCTTCrs-18：CAGCTACATTCCCAGTCTACGTfw-19：TTGGATTTGTAATGTAGAGCCCrs-19：AACTAAGGAAGCAAGATTGACCfw-20：AGTCTTGCATAACCTGACACTTGrs-20：TCATCCTTGCTGCTTTTCTTfw-21：AGGATGCCCAGATGGTTCArs-21：GCTGGTCTTTTGAGGGGTG(2)PCR擴增1)PCR反應(yīng)體系(50ul)10×PCRBuffer5μldNTP(10uM)1ulprimer-fw(10μM)2μlprimer-rs(10μM))2μlTemplate2μlDMSO1.5μlddH2O37.5μlTotal50μl2)PCR反應(yīng)條件95℃5min1cycle95℃30s50℃30s35cycles*72℃30s72℃10min1cycle1.4測序結(jié)果及分析測序結(jié)果如圖1和圖2所示,40個樣品的18，19，20，21號外顯子均測序合格；其中20號外顯子含polyA和polyG結(jié)果，已經(jīng)進(jìn)行加測反應(yīng)；40個樣品均顯示無明顯突變。通過對四組腫瘤組織的EGFR基因的18，19，20，21號外顯子測序,最終比對結(jié)果(參見圖1和圖2)顯示無明顯突變,表明無論是平和質(zhì)對照組、痰濕質(zhì)對照組，還是痰濕質(zhì)給藥組、痰濕質(zhì)給藥組，均無EGFR基因突變，表明肺抑瘤膏對EGFR非突變的非小細(xì)胞性肺癌亦有較顯著療效。綜上，通過上述動物模型試驗，能夠看出本發(fā)明的藥物能夠降低VEGF表達(dá)，減少腫瘤血管生成以及降低總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇的效果，具有降低痰濕質(zhì)小鼠的體重和明顯的抑瘤抗癌的效果，即本發(fā)明的藥物對痰濕質(zhì)肺癌人群能夠具有非常好抑瘤抗癌的功效。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3