本發(fā)明涉及一種體現(xiàn)腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用的中藥組合物，屬中藥領(lǐng)域。
技術(shù)背景
化療、放療和手術(shù)是目前惡性腫瘤三大常規(guī)治療手段，其中化療過(guò)程中常出現(xiàn)化療不敏感或化療達(dá)不到預(yù)期效果等問(wèn)題，或者出現(xiàn)患者在開始化療階段尚敏感、而化療進(jìn)行過(guò)程中出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致在手術(shù)后化療常常出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等，最終導(dǎo)致死亡。腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象是導(dǎo)致腫瘤化學(xué)藥物治療失敗常見因素，同時(shí)腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象也包括腫瘤細(xì)胞不僅僅對(duì)原使用過(guò)的化學(xué)藥物產(chǎn)生耐藥，對(duì)未使用過(guò)、結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)和機(jī)制各異的多種抗腫瘤藥物也均有交叉耐藥性。
目前國(guó)內(nèi)多種腫瘤患病率呈上升趨勢(shì)，90％以上腫瘤患者死亡均有不同程度上腫瘤耐藥現(xiàn)象影響，如何逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥是當(dāng)今腫瘤治療亟待解決關(guān)鍵問(wèn)題，由此也迫切需要尋求理想的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑。當(dāng)今研究表明多種機(jī)制參與腫瘤細(xì)胞多藥耐藥狀態(tài)的形成，主要包括：細(xì)胞膜P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白過(guò)度表達(dá)形成藥物外輸泵，使抗腫瘤藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)蓄積下降；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶單獨(dú)或與谷胱甘肽一起參與多種細(xì)胞毒代謝及解毒過(guò)程；與細(xì)胞凋亡相關(guān)的因子及基因如bcl-2，P53等異常。國(guó)內(nèi)外針對(duì)上述腫瘤多藥耐藥的發(fā)病機(jī)制研究較多，尋求拮抗和/或逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥現(xiàn)象有效途徑或方式，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性的化合物或生物制劑很多，但真正能進(jìn)入臨床研究的只有異博定、環(huán)孢菌素A等極少數(shù)藥物，且臨床療效不理想。
目前還沒有一種藥物或方法在臨床被廣泛接受原因在于：現(xiàn)有的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑大多為“老藥新用”，所體現(xiàn)的腫瘤逆轉(zhuǎn)耐藥作用往往不是其主要功能，臨床使用禁忌癥多，毒副作用大；生物制劑在機(jī)體內(nèi)不穩(wěn)定，難以作用到靶點(diǎn)且毒副反應(yīng)多；臨床耐藥往往數(shù)種機(jī)制同時(shí)參與，只對(duì)單一機(jī)制起作用的耐藥逆轉(zhuǎn)劑往往不能發(fā)揮其顯著效應(yīng)。某些中藥單體協(xié)同化療起到很好的增效作用，能起到逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，從而提高化療效果，具有很好的應(yīng)用和開發(fā)前景，對(duì)于這些中藥單體成分的研究結(jié)果而言，大多體外實(shí)驗(yàn)療效較好，真正能結(jié)合中醫(yī)藥理論及臨床療效研究甚少；在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，結(jié)合腫瘤化療多藥耐藥發(fā)病機(jī)制，采用中藥組合物作為腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑，體現(xiàn)中醫(yī)藥臨床療效優(yōu)勢(shì)的報(bào)道基本未見。
中國(guó)發(fā)明專利CN200710143393.1公開了“青蒿素在制備抗腫瘤多藥耐藥藥物中的應(yīng)用”，中國(guó)發(fā)明專利CN200710070320.4公開了“姜黃素在制備腫瘤多藥耐藥預(yù)防劑中的用途”，中國(guó)發(fā)明專利CN1463701公開“聯(lián)苯雙酯作為腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的新用途”；這類報(bào)道均為為中藥單體成分作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑。
中國(guó)發(fā)明專利CN102603692A公開了“一種抗腫瘤多藥耐藥抑制劑色滿和色烯衍生物及其制備方法和應(yīng)用”，中國(guó)發(fā)明專利CN101780068A公開了“片葉苔素D在制備抗腫瘤藥物和抗腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用”，中國(guó)發(fā)明專利CN102274220A公開了“索拉菲尼在制備逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的藥物中的應(yīng)用”；這類報(bào)道為化學(xué)藥物或拓展了原化學(xué)藥物的新用途。目前有關(guān)制備腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的發(fā)明專利報(bào)道基本集中在化學(xué)藥物和中藥單體成分。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中藥組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中藥組合物的制備方法。
本發(fā)明上述具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥中藥組合物的制備方法包括如下步驟：
1)稱取各原料藥破骨風(fēng)、千屈草、薺菜花和番木瓜備用。
2)按上述重量配比的破骨風(fēng)、千屈草、薺菜花和番木瓜，按照上述重量比混合，加3-5倍量水浸泡1-2小時(shí)，加熱煎煮1.5小時(shí)，過(guò)濾，藥渣再加2-3倍量水加熱煎煮1小時(shí)，過(guò)濾，合并兩次濾液，靜置0.5小時(shí)，倒出上清液。
3)上清液濃縮至相對(duì)密度1.05-1.10，進(jìn)噴霧干燥器，進(jìn)風(fēng)溫度控制120-130℃，出風(fēng)溫度105-120℃，霧化器轉(zhuǎn)速20-30轉(zhuǎn)/分鐘，進(jìn)料速度為3-5ml/分鐘，得噴霧干燥粉。
4)粉碎噴霧干燥粉，過(guò)篩后得細(xì)粉，即該中藥組合物的活性組分。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
破骨風(fēng)Jasminum lanceolarium Roxb.為木犀種植物清香藤的根及莖葉，味苦、辛，性平，具有清熱解毒、祛濕涼血功效；千屈草為千屈草科千屈草屬植物千屈菜Lythrum salicaria L.全草，味苦、性涼，具有清熱解毒、涼血止血功效；薺菜花為十字花科植物薺菜Capsellae bursa-pastoris(L.)Medic.的花序，味甘、性涼，具有清熱利濕、涼血止血功效；番木瓜為番木瓜科植物番木瓜Papaya的果實(shí)，味甘、性平，具有清熱解毒，利濕通絡(luò)功效。在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，上述中藥材配伍，體現(xiàn)其清熱解毒、利濕涼血功效；本發(fā)明中藥組合物應(yīng)用在腫瘤多藥耐藥治療中起到逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥，且該中藥組合物無(wú)毒副作用。
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述
實(shí)施例1本發(fā)明中藥組合物的制備
1.按下述重量配比稱取各原料藥
破骨風(fēng)50克、千屈草50克、薺菜花100克和番木瓜100克備用。
2.按照上述重量比藥材混合，加3倍量水浸泡1小時(shí)，加熱煎煮1.5小時(shí)，過(guò)濾，藥渣再加2倍量水加熱煎煮1小時(shí)，過(guò)濾，合并兩次濾液，靜置0.5小時(shí)，倒出上清液；上清液 濃縮至相對(duì)密度1.05時(shí)，進(jìn)噴霧干燥器，進(jìn)風(fēng)溫度控制120℃，出風(fēng)溫度105℃，霧化器轉(zhuǎn)速20轉(zhuǎn)/分鐘，進(jìn)料速度為3ml/分鐘，得噴霧干燥粉15克，粉碎過(guò)篩后可得細(xì)粉。
實(shí)施例2本發(fā)明中藥組合物的制備
1.按下述重量配比稱取各原料藥
破骨風(fēng)300克、千屈草300克、薺菜花200克和番木瓜200克備用。
2.按照上述重量比藥材混合，加5倍量水浸泡2小時(shí)，加熱煎煮1.5小時(shí)，過(guò)濾，藥渣再加3倍量水加熱煎煮1小時(shí)，過(guò)濾，合并兩次濾液，靜置0.5小時(shí)，倒出上清液；上清液濃縮至相對(duì)密度1.10時(shí)，進(jìn)噴霧干燥器，進(jìn)風(fēng)溫度控制130℃，出風(fēng)溫度120℃，霧化器轉(zhuǎn)速30轉(zhuǎn)/分鐘，進(jìn)料速度為5ml/分鐘，得噴霧干燥粉50克，粉碎過(guò)篩后可得細(xì)粉。
實(shí)施例3本發(fā)明中藥組合物的制備
1.按下述重量配比稱取各原料藥
破骨風(fēng)150克、千屈草150克、薺菜花120克和番木瓜120克備用。
2.按照上述重量比藥材混合，加3倍量水浸泡1小時(shí)，加熱煎煮1.5小時(shí)，過(guò)濾，藥渣再加2倍量水加熱煎煮1小時(shí)，過(guò)濾，合并兩次濾液，靜置0.5小時(shí)，倒出上清液；上清液濃縮至相對(duì)密度1.09時(shí)，進(jìn)噴霧干燥器，進(jìn)風(fēng)溫度控制125℃，出風(fēng)溫度110℃，霧化器轉(zhuǎn)速25轉(zhuǎn)/分鐘，進(jìn)料速度為4ml/分鐘，得噴霧干燥粉28克，粉碎過(guò)篩后可得細(xì)粉。
實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明中藥組合物逆轉(zhuǎn)多藥耐藥細(xì)胞株HL60/ADR耐藥性研究
白血病細(xì)胞株HL60/S為敏感株，HL60/ADR為白血病細(xì)胞阿霉素耐藥株；HL60/ADR是由HL60/S細(xì)胞接觸遞增濃度的ADR誘導(dǎo)而成，具有典型多藥耐藥性。細(xì)胞株均培養(yǎng)于含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。
含藥血清制備：NIH小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，稱重，根據(jù)隨機(jī)數(shù)目表隨機(jī)分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、空白對(duì)照組共4組，每組10只。
給藥方法與劑量：中藥組合物高劑量組按20g/kg灌胃給藥，中劑量組按10g/kg灌胃給藥，低劑量組按5g/kg灌胃給藥，空白對(duì)照組以生理鹽水灌胃。
上述給藥組小鼠分別給藥2h后取血離心分離血清，56℃滅活30min，用RPMI1640配制不同濃度的血清培養(yǎng)液。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HL60/ADR細(xì)胞以1×105/ml、HL60/S以0.5×105/ml分別接種于96孔培養(yǎng)板，100μl/孔。在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，加不同濃度的受試含藥血清和ADR共100μl，調(diào)零組和對(duì)照組加相應(yīng)體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)平行孔。培養(yǎng)72h后，每孔加5mg/ml MTT20μl(調(diào)零組除外)，再培養(yǎng)4h，傾去培養(yǎng)液，加DMSO100μl/孔，待完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)570nm處調(diào)零組調(diào)零后讀取吸光度(A)值。
取4孔A值的均數(shù)按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率(IR)＝[1-(試驗(yàn)孔A均值/對(duì)照孔A均值)]×100％；計(jì)算IR并求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；逆轉(zhuǎn)倍數(shù)＝空白對(duì)照組IC50/用藥組IC50。
表1 本發(fā)明中藥組合物對(duì)HL60/ADR耐藥株逆轉(zhuǎn)作用
本發(fā)明組合物含藥血清與ADR聯(lián)合使用可致ADR對(duì)HL60/ADR的IC50明顯下降，不同給藥濃度對(duì)HL60/ADR逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.16-5.62，且呈濃度正相關(guān)，提示本發(fā)明中藥組合物對(duì)HL60/ADR耐藥株具有逆轉(zhuǎn)作用。
實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明中藥組合物逆轉(zhuǎn)多藥耐藥細(xì)胞株K562/ADR耐藥性研究
白血病細(xì)胞株K562/S為敏感株，K562/ADR為白血病細(xì)胞阿霉素耐藥株；K562/ADR是由K562/S細(xì)胞接觸遞增濃度的ADR誘導(dǎo)而成，具有典型多藥耐藥性。細(xì)胞株均培養(yǎng)于含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。
含藥血清制備：NIH小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，稱重，根據(jù)隨機(jī)數(shù)目表隨機(jī)分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、空白對(duì)照組共4組，每組10只。
給藥方法與劑量：中藥組合物高劑量組按20g/kg灌胃給藥，中劑量組按10g/kg灌胃給藥，低劑量組按5g/kg灌胃給藥，空白對(duì)照組以生理鹽水灌胃。
上述給藥組小鼠分別給藥2h后取血離心分離血清，56℃滅活30min，用RPMI1640配制不同濃度的血清培養(yǎng)液。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/ADR細(xì)胞以1×105/ml、K562/S以0.5×105/ml分別接種于96孔培養(yǎng)板，100μl/孔。在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜后，加不同濃度的受試含藥血清和ADR共100μl，調(diào)零組和對(duì)照組加相應(yīng)體積的培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)平行孔。培養(yǎng)72h后，每孔加5mg/ml MTT20μl(調(diào)零組除外)，再培養(yǎng)4h，傾去培養(yǎng)液，加DMSO100μl/孔，待完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長(zhǎng)570nm處調(diào)零組調(diào)零后讀取吸光度(A)值。
取4孔A值的均數(shù)按公式計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率(IR)＝[1-(試驗(yàn)孔A均值/對(duì)照孔A均值)]×100％；計(jì)算IR并求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；逆轉(zhuǎn)倍數(shù)＝空白對(duì)照組IC50/用藥組IC50。
表2 本發(fā)明中藥組合物對(duì)K562/ADR耐藥株逆轉(zhuǎn)作用
本發(fā)明組合物含藥血清與ADR聯(lián)合使用可致ADR對(duì)K562/ADR的IC50明顯下降，不同給藥濃度對(duì)K562/ADR逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.18-3.71，且呈濃度正相關(guān)，提示本發(fā)明中藥組合物對(duì)K562/ADR耐藥株具有逆轉(zhuǎn)作用。