本發(fā)明涉及一種逆轉腫瘤多藥耐藥的中藥組合物，屬中藥領域。
技術背景
惡性腫瘤嚴重影響人類健康，化療是目前治療惡性腫瘤的三大手段之一，臨床應用中常常出現(xiàn)化療不敏感或化療達不到預期效果等實際問題，或者患者在開始化療階段尚敏感，而化療進行過程中出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，耐藥導致在手術后化療常常出現(xiàn)的腫瘤轉移、復發(fā)等，最終導致死亡。腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導致腫瘤化學藥物治療失敗的常見因素，同時腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象也包括腫瘤細胞不單對原來使用過的藥物產生耐藥，對未接觸過、結構無關、機制各異的多種抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性。目前國內腫瘤患病率呈上升趨勢，90％的腫瘤患者死亡在不同程度上受腫瘤耐藥影響，如何逆轉腫瘤多藥耐藥是當今腫瘤治療亟待解決問題，由此也急切尋求理想的耐藥逆轉劑。
研究結果表明多種機制參與腫瘤細胞多藥耐藥形成，主要包括：細胞膜P-糖蛋白、多藥耐藥相關蛋白過度表達形成藥物外輸泵，使抗腫瘤藥物在腫瘤細胞內蓄積下降；谷胱甘肽-S-轉移酶單獨或與谷胱甘肽一起參與多種細胞毒代謝及解毒過程；與細胞凋亡相關的因子及基因如bcl-2，P53等異常。國內外針對上述環(huán)節(jié)進行了廣泛研究，以尋求拮抗和/或逆轉腫瘤細胞多藥耐藥，體外證實具有逆轉耐藥活性的化合物或生物制劑很多，但真正進入臨床研究的只有異博定、環(huán)孢菌素A等極少數(shù)藥物，且臨床療效不理想。目前還沒有一種藥物或方法在臨床被廣泛接受原因在于：現(xiàn)有逆轉劑大多為“老藥新用”，逆轉耐藥往往不是其主要功能，臨床使用禁忌癥多，毒副作用大；生物制劑在體內不穩(wěn)定，難以作用到靶點且毒副反應多；臨床耐藥往往數(shù)種機制同時參與，只對單一機制起作用的逆轉劑難以發(fā)揮顯著效應。某些中藥協(xié)同化療起到很好的增效作用，能起到逆轉腫瘤多藥耐藥，從而提高化療效果，具有很好的應用和開發(fā)前景；對于有些中藥或有效單體成分研究結果而言，大多體外實驗效果較好，真正能結合臨床療效和中醫(yī)藥理論的甚少；因此，在中醫(yī)藥理論指導下，結合腫瘤化療多藥耐藥發(fā)病機制，采用中藥復方作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑應用，體現(xiàn)臨床療效優(yōu)勢。
中國發(fā)明專利CN200710143393.1公開了“青蒿素在制備抗腫瘤多藥耐藥藥物中的應用”，中國發(fā)明專利CN200710070320.4公開了“姜黃素在制備腫瘤多藥耐藥預防劑中的用途”，中國發(fā)明專利CN1463701公開“聯(lián)苯雙酯作為腫瘤多藥耐藥逆轉劑的新用途”；這類藥物為中藥單體成分作為耐藥逆轉劑。中國發(fā)明專利CN102603692A公開了“一種抗腫瘤多藥耐藥抑制劑色滿和色烯衍生物及其制備方法和應用”，中國發(fā)明專利CN101780068A公開了“片葉苔素D在制備抗腫瘤藥物和抗腫瘤多藥耐藥逆轉藥物中的應用”，中國發(fā)明專利CN102274220A公開了“索拉菲尼在制備逆轉腫瘤多藥耐藥性的藥物中的應用”；這類藥物為化學藥物或拓展了原藥物的新用途。目前有關制備腫瘤多藥耐藥逆轉劑的發(fā)明專利報道基本集中在化學藥物和中藥單體成分，結合中醫(yī)藥理論和臨床療效的中藥復方組合物不多。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種逆轉腫瘤多藥耐藥中藥組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種逆轉腫瘤多藥耐藥中藥組合物的制備方法。
本發(fā)明上述具有逆轉腫瘤多藥耐藥中藥組合物的制備方法包括如下步驟：
1)稱取各原料藥火絨草、化香樹、紅頭草、紅背葉、虎耳草備用。
2)按上述重量配比的火絨草、化香樹、紅頭草、紅背葉、虎耳草，按照上述重量比混合，加3-5倍量水浸泡1-2小時，加熱煎煮1.5小時，過濾，藥渣再加2-3倍量水加熱煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，靜置0.5小時，倒出上清液。
3)上清液濃縮至相對密度1.08-1.10，進噴霧干燥器，進風溫度控制120-130℃，出風溫度105-120℃，霧化器轉速20-30轉/分鐘，進料速度為3-5ml/分鐘，得噴霧干燥粉。
4)粉碎噴霧干燥粉，過篩后得細粉，即該中藥組合物的活性組分。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
火絨草Leontopodium leontopodiaoides(Willd)Beauv.為菊科植物火絨草的地上部分，味苦、性寒，具有清熱解毒作用；化香樹Platycarya strobilacea Sieb.et Zucc.為胡桃科化香樹屬植物化香樹的葉，味苦、性寒，具有清熱解毒作用；紅頭草為菊科艾納香屬植物見霜黃Blumea lacera DC.的全草，味苦、性寒，具有清熱解毒作用；紅背葉為大戟科山麻桿屬植物紅背山麻桿Alchornea trewioides(Benth.)Muell.-Arg.的根，味甘、性涼，具有清熱散瘀作用；虎耳草為虎耳草科植物虎耳草Saxifraga stolonifera Meerb.的全草，味苦、性寒，具有清熱解毒作用；在中醫(yī)藥理論指導下，上述中藥材配伍，體現(xiàn)其清熱解毒化瘀功效；本發(fā)明中藥組合物應用在腫瘤多藥耐藥治療中起到逆轉腫瘤多藥耐藥，且該中藥組合物無毒副作用。
以下結合實施例對本發(fā)明作進一步的闡述
實施例1本發(fā)明中藥組合物的制備(以十倍原料配比量為例)
1.按下述重量配比稱取各原料藥
火絨草100克、化香樹100克、紅頭草50克、紅背葉50克和虎耳草50克備用。
2.按照上述重量比藥材混合，加3倍量水浸泡1小時，加熱煎煮1.5小時，過濾，藥渣再加2倍量水加熱煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，靜置0.5小時，倒出上清液；上清液濃縮至相對密度1.08時，進噴霧干燥器，進風溫度控制120℃，出風溫度105℃，霧化器轉速20轉/分鐘，進料速度為3ml/分鐘，得噴霧干燥粉18克，粉碎過篩后可得細粉。
實施例2本發(fā)明中藥組合物的制備(以十倍原料配比量為例)
1.按下述重量配比稱取各原料藥
火絨草300克、化香樹300克、紅頭草250克、紅背葉250克和虎耳草200克備用。
2.按照上述重量比藥材混合，加3倍量水浸泡1小時，加熱煎煮1.5小時，過濾，藥渣再加2倍量水加熱煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，靜置0.5小時，倒出上清液；上清液濃縮至相對密度1.10時，進噴霧干燥器，進風溫度控制130℃，出風溫度120℃，霧化器轉速30轉/分鐘，進料速度為5ml/分鐘，得噴霧干燥粉70克，粉碎過篩后可得細粉。
實施例3本發(fā)明中藥組合物的制備(以十倍原料配比量為例)
1.按下述重量配比稱取各原料藥
火絨草120克、化香樹120克、紅頭草100克、紅背葉100克和虎耳草100克備用。
2.按照上述重量比藥材混合，加3倍量水浸泡1小時，加熱煎煮1.5小時，過濾，藥渣再加2倍量水加熱煎煮1小時，過濾，合并兩次濾液，靜置0.5小時，倒出上清液；上清液濃縮至相對密度1.09時，進噴霧干燥器，進風溫度控制125℃，出風溫度110℃，霧化器轉速25轉/分鐘，進料速度為4ml/分鐘，得噴霧干燥粉30克，粉碎過篩后可得細粉。
實驗例1本發(fā)明中藥組合物逆轉多藥耐藥細胞株HL60/ADR耐藥性研究
白血病細胞株HL60/S為敏感株，HL60/ADR為白血病細胞阿霉素耐藥株；HL60/ADR是由HL60/S細胞接觸遞增濃度的ADR誘導而成，具有典型多藥耐藥性。細胞株均培養(yǎng)于含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。
含藥血清制備：NIH小鼠適應性飼養(yǎng)3天后，稱重，根據(jù)隨機數(shù)目表隨機分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、空白對照組共4組，每組10只。
給藥方法與劑量：中藥組合物高劑量組按40g/kg灌胃給藥，中劑量組按20g/kg灌胃給藥，低劑量組按10g/kg灌胃給藥，空白對照組以生理鹽水灌胃。
上述給藥組小鼠分別給藥2h后取血離心分離血清，56℃滅活30min，用RPMI1640配制不同濃度的血清培養(yǎng)液。
取對數(shù)生長期HL60/ADR細胞以1×105/ml、HL60/S以0.5×105/ml分別接種于96孔培養(yǎng)板，100μl/孔。在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)過夜后，加不同濃度的受試含藥血清和ADR共100μl，調零組和對照組加相應體積的培養(yǎng)液，每組設4個平行孔。培養(yǎng)72h后，每孔加5mg/ml MTT20μl(調零組除外)，再培養(yǎng)4h，傾去培養(yǎng)液，加DMSO100μl/孔，待完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長570nm處調零組調零后讀取吸光度(A)值。
取4孔A值的均數(shù)按公式計算細胞抑制率，細胞抑制率(IR)＝[1-(試驗孔A均值/對照孔A均值)]×100％；計算IR并求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，以上實驗重復3次；逆轉倍數(shù)＝空白對照組IC50/用藥組IC50。
表1本發(fā)明中藥組合物對HL60/ADR耐藥株逆轉作用
本發(fā)明組合物含藥血清與ADR聯(lián)合使用可致ADR對HL60/ADR的IC50明顯下降，不同給藥濃度對HL60/ADR逆轉倍數(shù)為1.56-4.38，且呈濃度正相關，提示本發(fā)明中藥組合物對HL60/ADR耐藥株具有逆轉作用。
實驗例2本發(fā)明中藥組合物逆轉多藥耐藥細胞株K562/ADR耐藥性研究
白血病細胞株K562/S為敏感株，K562/ADR為白血病細胞阿霉素耐藥株；K562/ADR是由K562/S細胞接觸遞增濃度的ADR誘導而成，具有典型多藥耐藥性。細胞株均培養(yǎng)于含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。
含藥血清制備：NIH小鼠適應性飼養(yǎng)3天后，稱重，根據(jù)隨機數(shù)目表隨機分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、空白對照組共4組，每組10只。
給藥方法與劑量：中藥組合物高劑量組按40g/kg灌胃給藥，中劑量組按20g/kg灌胃給藥，低劑量組按10g/kg灌胃給藥，空白對照組以生理鹽水灌胃。
上述給藥組小鼠分別給藥2h后取血離心分離血清，56℃滅活30min，用RPMI1640配制不同濃度的血清培養(yǎng)液。
取對數(shù)生長期K562/ADR細胞以1×105/ml、K562/S以0.5×105/ml分別接種于96孔培養(yǎng)板，100μl/孔。在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)過夜后，加不同濃度的受試含藥血清和ADR共100μl，調零組和對照組加相應體積的培養(yǎng)液，每組設4個平行孔。培養(yǎng)72h后，每孔加5mg/ml MTT20μl(調零組除外)，再培養(yǎng)4h，傾去培養(yǎng)液，加DMSO100μl/孔，待完全溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在波長570nm處調零組調零后讀取吸光度(A)值。
取4孔A值的均數(shù)按公式計算細胞抑制率，細胞抑制率(IR)＝[1-(試驗孔A均值/對照孔A均值)]×100％；計算IR并求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，以上實驗重復3次；逆轉倍數(shù)＝空白對照組IC50/用藥組IC50。
表1本發(fā)明中藥組合物對K562/ADR耐藥株逆轉作用
本發(fā)明組合物含藥血清與ADR聯(lián)合使用可致ADR對K562/ADR的IC50明顯下降，不同給藥濃度對K562/ADR逆轉倍數(shù)為1.44-3.20，且呈濃度正相關，提示本發(fā)明中藥組合物對K562/ADR耐藥株具有逆轉作用。