本發(fā)明涉及巴布劑技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種憂遁草酵素液巴布劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

憂遁草屬于爵床科鱷嘴花屬，除了憂遁草的別名外，它還有鱷嘴花、扭序花、青箭、沙巴蛇草、柔刺草竹節(jié)黃、竹葉青、竹兒王、小接骨、剽黃等的美稱。在馬來西亞和中國臺灣等地作為傳統(tǒng)中藥，具有抗菌、抗炎、抗病毒的作用，可以用于治療皮疹、蚊蟲叮咬、毒蛇咬傷等。早期的文獻中報道了從該植物的莖和葉中分離得到街醇、三菇、黃酮，以及含硫糖昔、腦樸脂和類葉綠素類化合物的研究報告，但是這些研究不能全面表達它的功效。直至2011年馬來西亞某淋巴癌末期患者服用憂遁草康復(fù)后，其藥用價值很快引起了世界各地醫(yī)藥科研工作者的廣泛關(guān)注，據(jù)報道，其中的化學(xué)成分大部分已被現(xiàn)代抗腫瘤藥理實驗研究證實。截止到目前，國內(nèi)、外學(xué)者已從憂遁草中分離、鑒定出了多種化學(xué)成分，包括三萜類、碳苷黃酮類、含硫化合物、植物甾醇類、脫鎂葉綠素類、腦苷類、氨基酸、微量元素、生物堿以及多種小分子化合物等。最新研究總結(jié)了憂遁草的主要藥理活性有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等，還有一些作用等待研究者去發(fā)現(xiàn)。

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)，還可以稱為經(jīng)皮治療系統(tǒng)，是指皮膚貼敷方式用藥，即通過皮膚的貼敷方式使藥物以一定的速率通過皮膚經(jīng)毛細血管吸收進入體循環(huán)產(chǎn)生藥效的一種給藥方式。它與其他給藥方式相比具有一定的優(yōu)點。如可以不經(jīng)過肝臟的“首過效應(yīng)”和胃腸道的破壞，提高生物利用度，具有較長的作用時間，也有透皮吸收的優(yōu)點。它還可以降低藥物毒性和副作用，維持穩(wěn)定、持久的血藥濃度，減少給藥次數(shù)，提高療效，給藥方便，操作簡單等等。

經(jīng)皮給藥制劑之一-巴布劑是指藥物提取物、藥物于適宜的親水性基質(zhì)混合后，涂布于背襯材料上的外用劑型。巴布劑具有使用方便、給藥準(zhǔn)確的優(yōu)點，而且不會弄臟衣服。同時，因為不經(jīng)過口服給藥，所以不經(jīng)肝臟和消化道，就避免了藥效受胃液的干擾。

目前憂遁草民間用于抗腫消炎若搗碎鮮外敷效果明顯，但使用不方便且不易控制用藥量，藥效不能充分發(fā)揮，對原藥功效成分利用率低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種憂遁草酵素液巴布劑及其制備方法，目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)用藥量不易控制、使用不方便且藥效發(fā)揮不充分的問題。

為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明提出的基本技術(shù)方案為：

一種憂遁草酵素液巴布劑，包括憂遁草酵素液、水溶性基質(zhì)、背襯層以及保護膜，以質(zhì)量份數(shù)計，其中；

所述憂遁草酵素液 40～80份

所述水溶性基質(zhì)包括以下組分：

以及，一種憂遁草酵素液巴布劑的制備方法，包括以下步驟：

步驟S01：將處方量的憂遁草酵素液經(jīng)0.2-0.4微米超濾膜超濾，濾液經(jīng)截留分子量為300-1000的納濾膜納濾，合并納濾和超濾截留物，用蒸餾水溶解制成與憂遁草酵素液相同體積的憂遁草酵素液處理液；

步驟S02：將處方量的甘油加入真空攪拌器內(nèi)，再將處方量的聚丙烯酸鈉、陶瓷粉、甘羥鋁、乙二胺四乙酸加入其中，攪拌5min，得到甘油相，將聚乙烯毗咯烷酮、檸檬酸共同溶于蒸餾水中，得混合物，將混合物與憂遁草酵素液處理液共同一次性加入甘油相中，攪拌12min，得到膏體；

步驟S03：將膏體轉(zhuǎn)移至涂布切割機上，進行涂布切割，得到憂遁草酵素液巴布劑半成品，將憂遁草酵素液巴布劑半成品置于濕度55％、溫度30℃條件下，存放18h，再置于濕度75％、溫度20℃條件下，存放12h，進行包裝，包裝后，再置于陰涼處靜置96h，即得憂遁草酵素液巴布劑。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明通過將憂遁草制備成巴布劑，用藥量易于控制，使用方便，藥效顯著穩(wěn)定，藥效大大提高，一方面可以覆蓋傷口阻斷感染物，另一方面可以加入促透劑皮膚給藥，進行跌打腫脹治療。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的憂遁草酵素液HPLC色譜圖(λ＝280nm)；

圖2是本發(fā)明實施例提供的憂遁草巴布劑2小時透皮液HPLC色譜圖(λ＝280nm)；

圖3是本發(fā)明實施例提供的憂遁草巴布劑4小時透皮液HPLC色譜圖(λ＝280nm)；

圖4是本發(fā)明實施例提供的憂遁草巴布劑6小時透皮液HPLC色譜圖(λ＝280nm)

圖5是本發(fā)明實施例提供的憂遁草巴布劑8小時透皮液HPLC色譜圖(λ＝280nm)；

圖6是本發(fā)明實施例提供的時間與透過量的線性關(guān)系圖；

圖7是本發(fā)明實施例提供的空白基質(zhì)組致炎前后對比圖；

圖8是本發(fā)明實施例提供的阿 司 匹 林 組致炎前后對比圖；

圖9是本發(fā)明實施例提供的憂 遁 草 巴 布 劑 高 劑 量 組致炎前后對比圖；

圖10是本發(fā)明實施例提供的憂 遁 草 巴 布 劑 中 劑 量 組致炎前后對比圖；

圖11是本發(fā)明實施例提供的憂 遁 草 巴 布 劑 低 劑 量 組致炎前后對比圖；

圖12是本發(fā)明實施例提供的憂遁草巴布劑對雞蛋清致小鼠足跖腫脹的影響不同時間對比圖；

圖13是本發(fā)明實施例提供的各組大鼠圓形創(chuàng)面修復(fù)情況不同時間對比圖；

圖14是本發(fā)明實施例提供的憂遁草酵素的大腸桿菌抑菌圈實驗結(jié)果圖；

圖15是本發(fā)明實施例提供的憂遁草酵素的金黃色葡萄球菌抑菌圈實驗結(jié)果圖。

具體實施方式

以下將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但不應(yīng)以此來限制本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明提供了一種憂遁草酵素液巴布劑，包括憂遁草酵素液、水溶性基質(zhì)、背襯層以及保護膜，以質(zhì)量份數(shù)計，其中；

所述憂遁草酵素液 40～80份

所述水溶性基質(zhì)包括以下組分：

所述憂遁草酵素液按下述步驟得到：

將6份水、3份憂遁草葉子、1份黑糖在常溫下發(fā)酵得到所述憂遁草酵素液。

背襯層所使用的背襯材料可以采用棉布、無紡布、紙中的一種；保護膜所使用的蓋襯材料可以采用防粘紙、聚乙烯塑料薄膜、鋁箔聚乙烯復(fù)合膜、硬質(zhì)紗布中的一種。具體的，本發(fā)明實施例中背襯層所使用的背襯材料均采用無紡布，保護膜所使用的蓋襯材料均采用聚乙烯塑料薄膜。

本發(fā)明還提供了一種上述憂遁草酵素液巴布劑的制備方法，具體包括如下步驟：

步驟S01：將處方量的憂遁草酵素液經(jīng)0.2-0.4微米超濾膜超濾，濾液經(jīng)截留分子量為300-1000的納濾膜納濾，合并納濾和超濾截留物，用蒸餾水溶解制成與憂遁草酵素液相同體積的憂遁草酵素液處理液；

步驟S02：將處方量的甘油加入真空攪拌器內(nèi)，再將處方量的聚丙烯酸鈉、陶瓷粉、甘羥鋁、乙二胺四乙酸加入其中，攪拌5min，得到甘油相，將聚乙烯毗咯烷酮、檸檬酸共同溶于蒸餾水中，得混合物，將混合物與憂遁草酵素液處理液共同一次性加入甘油相中，攪拌12min，得到膏體；

步驟S03：將膏體轉(zhuǎn)移至涂布切割機上，進行涂布切割，得到憂遁草酵素液巴布劑半成品，將憂遁草酵素液巴布劑半成品置于濕度55％、溫度30℃條件下，存放18h，再置于濕度75％、溫度20℃條件下，存放12h，進行包裝，包裝后，再置于陰涼處靜置96h，即得憂遁草酵素液巴布劑。

本發(fā)明憂遁草酵素液巴布劑的制備方法，通過選擇特定組成和配比的原料，按照特定的順序加料，得到上述的憂遁草酵素液巴布劑，該方法工藝簡單，易操作。

實施例1：

所述憂遁草酵素液巴布劑包括以下組分，按質(zhì)量份數(shù)計：取6份聚丙烯酸鈉，0.15份甘羥鋁，1.5份聚乙烯毗咯烷酮，35份甘油，0.15份陶瓷粉，0.05份乙二胺四乙酸，0.05份檸檬酸，60份憂遁草酵素液。

按照如下步驟制備憂遁草巴布劑：

將處方量的憂遁草酵素液經(jīng)0.2-0.4微米超濾膜超濾，濾液經(jīng)截留分子量為300-1000的納濾膜納濾，合并納濾和超濾截留物，用蒸餾水溶解制成與憂遁草酵素液相同體積的憂遁草酵素液處理液；

將處方量的甘油加入真空攪拌器內(nèi)，再將處方量的聚丙烯酸鈉、陶瓷粉、甘羥鋁、乙二胺四乙酸加入其中，攪拌5min，得到甘油相，將聚乙烯毗咯烷酮、檸檬酸共同溶于蒸餾水中，得混合物，將混合物與憂遁草酵素液處理液共同一次性加入甘油相中，攪拌12min，得到膏體；

將膏體轉(zhuǎn)移至涂布切割機上，進行涂布切割，得到憂遁草酵素液巴布劑半成品，將憂遁草酵素液巴布劑半成品置于濕度55％、溫度30℃條件下，存放18h，再置于濕度75％、溫度20℃條件下，存放12h，覆蓋上保護膜，再置于陰涼處靜置96h，即得憂遁草酵素液巴布劑。

綜合感官評價、質(zhì)量評價、體外經(jīng)皮滲透實驗、藥效動物實驗、急性毒性實驗以及長期毒性實驗

一、綜合感官評價

對上述實施例1制備的憂遁草酵素液巴布劑按照表2巴布劑綜合感官評價指標(biāo)進行評價，巴布劑綜合感官評價指標(biāo)是根據(jù)膏體外觀性狀、貼于皮膚上的舒適性、剝離強度、皮膚黏附性、反復(fù)揭貼性等主觀指標(biāo)，采用評分法，總指標(biāo)滿分為5分，評分方式如表1所示。

表1 憂遁草巴布劑綜合感官評價指標(biāo)

上述實施例1制備的憂遁草酵素液巴布劑評價結(jié)果為4.6分。

二、質(zhì)量評價

2.1質(zhì)量評價方法

根據(jù)《中國藥典》2010版規(guī)定，制備三批上述實施例1制備的憂遁草酵素液巴布劑，進行質(zhì)量評價試驗，包括含膏量試驗、賦型性試驗、初黏力試驗、持黏力試驗、高溫試驗、高濕試驗。

2.1.1含膏量試驗

分別取三批上述實施例1制備的憂遁草酵素液巴布劑各2片(6cm×9cm)，除去保護膜，精密稱定，置燒杯中，加適量水，加熱煮沸至背襯無殘留膏體，晾干，在105℃干燥30min，移置干燥器中，冷卻30min，精密稱定，減失重量即為膏量，按標(biāo)示面積換算成100cm²的膏體。

2.1.2賦型性試驗

分別取三批上述實施例1制備的憂遁草酵素液巴布劑各2片，置于37℃，相對濕度64％的恒溫恒濕箱中30min后取出，用夾子將供試品固定在一平整鋼板上，鋼板與水平面的傾斜角為60°，放置24小時，膏面應(yīng)無流淌現(xiàn)象。

2.1.3初黏力試驗

采用斜坡滾球測定，取一塊巴布劑除去防黏層，置于與水平面成15°傾斜扳中央，膏面向上，斜面上部10cm及下部15cm用0.025mm厚的滌綸薄膜覆蓋，中間留出5cm膏面，將不同規(guī)格的鋼球，自斜面頂端自由滾下，記錄可以粘住的鋼球號。

2.1.4持黏力試驗

實驗前將試驗板和加載板用無水乙醇擦洗干凈后，將上述實施例1制備的憂遁草酵素液巴布劑粘性面粘貼于實驗板表面，垂直放置，沿供試品的長度方向懸掛一300g的砝碼，記錄供試品從垂直放置到滑移至脫落所需時間。

2.1.5高溫試驗

將同一批號的憂遁草酵素液巴布劑置恒溫恒濕箱中，在溫度為60°相對濕度為65％條件下放置20天，對其性狀、含膏量、初黏力、持黏力進行檢測，于0、10、20天取樣檢測。

2.1.6高濕試驗

將同一批號的憂遁草酵素液巴布劑置恒溫恒濕箱中在溫度為25°，相對濕度為90％條件下放置20天，對其性狀，含膏量，初粘力，持粘力，吸濕增重進行檢測，于0，10，20天取樣檢測。

2.2質(zhì)量評價結(jié)果

2.2.1含膏量的測定

含膏量的測定結(jié)果見表2

表2 含膏量測定結(jié)果

2.2.2賦形型的測定

賦形性的測定結(jié)果表明，三批巴布劑賦形性良好，均無任何流淌現(xiàn)象。

2.2.3初黏力測定

初黏力的測定結(jié)果見表3和表4。

表3 測試鋼球的直徑與體積

表4 粘著力測定結(jié)果

測定結(jié)果表明該憂遁草酵素液巴布劑能粘住7號鋼球，鋼球重為11.269g。

測定結(jié)果表明該憂遁草巴布劑持黏力的時間為72S。

2.2.4高溫試驗

高溫試驗的測定結(jié)果見表5。

表5 高溫試驗檢測結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)基質(zhì)變色嚴(yán)重，膏體變硬，根據(jù)高溫試驗穩(wěn)定性考察指導(dǎo)原則，改為在40℃

2.2.5高濕試驗

高濕試驗的測定結(jié)果見表6。

表6 高濕試驗檢測結(jié)果

結(jié)果顯示在溫度為25℃、相對濕度為90％狀態(tài)下，巴布劑各檢查項目均無明顯改變，吸濕在2％以下，各項指標(biāo)相對穩(wěn)定。建議產(chǎn)品密封包裝。

三、體外經(jīng)皮滲透實驗

3.1材料

3.1.1實驗動物

昆明種小鼠，體重18-22g，

3.1.2藥物：上述實施例1制備的憂遁草酵素液巴布劑

3.2方法

3.2.1離體小鼠皮膚的制備與處理

取雄性昆明小鼠，實驗前給其注射0.3微升的戊巴比妥鈉將其麻醉，用電動剃毛刀除去腹部鼠毛，再以溶液涂布腹部皮膚，后以溫水反復(fù)洗凈干凈，禁食不禁水。實驗時頸椎脫臼處死，用眼科剪分離腹部皮膚，并將其平鋪于干凈的玻璃板上，角質(zhì)層朝下，用棉簽小心擦除皮下組織和脂肪。選取沒有破損的完整皮膚用無菌生理鹽水沖洗數(shù)次，直至皮膚白色為止，用鋁箔包裹，于-20℃低溫冰箱中保存，24h內(nèi)用完。實驗前自然恢復(fù)至室溫，并檢查鼠皮的完整性，不能有任何破損。

3.2.2試用巴布劑的制備

按照1％氮酮、2％丙二醇作為促透劑，制備成巴布劑，放置恒溫恒濕箱中至成型，作為供試巴布劑。

3.2.3體外經(jīng)皮滲透實驗

采用實驗室改良的擴散池，上層為供給室，下層為接收室，接收室的一側(cè)用于取樣，補充藥液和排除氣泡用。

將制備好的離體皮膚從冰箱中取出，浸泡于生理鹽水中解凍，用濾紙吸干表面水分后，將優(yōu)盾草巴布劑貼在皮膚的角質(zhì)層面，然后將處理好的皮膚固定于擴散池的供給室與接受室之間，角質(zhì)層面向供給室，接受池中加入空白接受液(乙醇∶水＝3∶7)30ml，排凈氣泡。磁力攪拌速度約為200r/min，水浴溫度士30℃。以開啟磁力攪拌器時計時，分別于2h、4h、6h、8h取樣，每次取樣1ml，同時補加1ml空白接受液。樣品溶液用水濾膜濾過，用HPLC測定其中含量。

色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250mm×4.6mm，5μm)

流動相：乙睛為30％一水為70％進行等度洗脫

流速：1.0ml/min

柱溫：30℃

進樣量：10μL

檢測波長：λ＝280nm

3.3.實驗結(jié)果

3.3.1供試品溶液的制備

從接受池中取出全部接受液，水浴上蒸至有成分析出，殘液過水濾膜，即得。

3.3.2藥液原液與透皮液液相色譜研究結(jié)果如圖1至圖6所示，

表7 時間與透過量的線性測定結(jié)果

本實驗采用歸一法對峰面積進行計算，實驗結(jié)果表明，透皮時間與透皮量呈良好的線性關(guān)系，即透皮時間越長，透皮量越多表明藥效越好。

憂遁草酵素原液的一部分可以透過皮膚，其余可能是大分子物質(zhì)，推測這部分為超濾截留物，雖然不能透過皮膚，但是可能有促進傷口愈合的功效。巴布劑將超濾及納濾截留物合并，具有抗腫消炎及促進傷口愈合兩種功效。

四、藥效動物實驗

4.1材料：

4.1.1實驗動物

昆明種小鼠310只，體重18-22g，

4.1.2儀器及試劑

打孔器 電子分析天平 一次性注射器 手術(shù)刀

角叉菜膠 二甲苯 鮮雞蛋

4.1.3藥物：為上述實施例1制備的憂遁草酵素液巴布劑

4.2方法

4.2.1抗腫消炎

A：小鼠耳廓腫脹實驗

取健康昆明種小白鼠50只，雌雄各半，體重18-22g，隨機分為6組，每組10只，分別為空白對照組(僅含基質(zhì)巴布劑組)，阿司匹林組(陽性對照組)，憂遁草酵素液巴布劑高、中、低劑量組，按憂遁草生葉子重量計，高劑量組為生藥800mg/kg，中劑量組為400mg/kg，低劑量組為200mg/kg。阿司匹林組給予阿司匹林粉末灌胃(400mg/kg)，每日一次，空白基質(zhì)組及憂遁草酵素液巴布劑組分別在小鼠左耳敷貼。每12小時更換一次，連續(xù)用藥6次。末次給藥1h后在每組小鼠左耳前后兩面涂0.02ml二甲苯，15min后將小鼠脫臼處死，沿耳廓基線剪下雙耳，用8mm打孔器在相同部位打下等面積雙耳，用電子分析天平稱重，左右耳作對照。計算每只小鼠左耳的腫脹度和該組的腫脹抑制率。

腫脹度＝致炎側(cè)耳片重量-非致炎側(cè)耳片重量

腫脹率(％)＝(致炎側(cè)耳片-非致炎側(cè)耳片重量)/非致炎側(cè)耳片重量×100％

腫脹抑制率(％)＝(對照組平均腫脹率-給藥組平均腫脹率)/對照組平均腫脹率×100％)

B：雞蛋清致小鼠足趾腫脹實驗

取健康昆明種小白鼠50只，雌雄各半，體重18-22g，隨機分為6組，每組10只，分別為空白對照組(僅含基質(zhì)巴布劑組)，阿司匹林組(陽性對照組)，憂遁草酵素液巴布劑高、中、低劑量組。阿～匹林組給予阿司匹林粉末灌胃(400mg/kg)，空白基質(zhì)組及憂遁草酵素液巴布劑組分別在小鼠右后足跖敷貼。每12小時更換一次，連續(xù)用藥10次。末次給藥1h后用排水法測定每組小鼠右后肢正常足跖容積后，立即將小鼠后肢拉直，先自小鼠右后足跖中部皮下向上一部分10％新鮮雞蛋清(25℃)，然后調(diào)轉(zhuǎn)針頭向下注射完(0.2ml/只)致炎，分別于致炎后1，2，4h用排水法測小鼠足跖容積，計算得到各劑量組的腫脹抑制率以及不同時間的抗炎效應(yīng)數(shù)據(jù)。按下式計算

腫脹率(％)＝(致炎后足趾容積值-致炎前足趾容積值)/致炎前足趾容積值×100％

腫脹抑制率(％)＝(對照組平均腫脹率-給藥組平均腫脹率)/對照組平均腫脹率×100％

C：角叉菜膠致小鼠足跖腫脹實驗

取健康昆明種小白鼠50只，雌雄各半，體重18-22g，隨機分為6組，每組10只，分別為空白對照組(僅含基質(zhì)巴布劑組)，阿司匹林組(陽性對照組)，憂遁草酵素液巴布劑高、中、低劑量組。阿司匹林組給予阿司匹林粉末灌胃(400mg/kg)，空白基質(zhì)組及憂遁草酵素液巴布劑組分別在小鼠右后足跖敷貼。每12小時更換一次，連續(xù)用藥10次。末次給藥1h后用排水法測定每組小鼠右后肢正常足跖容積后，立即將小鼠后肢拉直，先自小鼠右后足跖中部皮下向上一部分1％角叉菜膠混懸液，然后調(diào)轉(zhuǎn)針頭向下注射完(0.1ml/只)致炎，分別于致炎后1，2，4，6h用排水法測小鼠足跖容積，計算得到各劑量組的腫脹抑制率以及不同時間的抗炎效應(yīng)數(shù)據(jù)。計算公式同上。

4.2.2促傷口愈合

A：大鼠“十字”物理創(chuàng)傷實驗

選用SD大鼠50只，雌雄各半，SPF級，隨機分為5組，分別為空白對照(僅含基質(zhì)巴布劑)組，陽性對照(云南白藥粉末)組，憂遁草巴布劑高、中、低劑量組，首先用戊巴比妥鈉10mg/kg給予大鼠腹腔注射麻醉，在其背部用消毒手術(shù)刀劃上直徑約3cm的十字傷口，深及筋膜肌肉。陽性對照組給予小鼠創(chuàng)傷部位涂抹云南白藥粉末；空白對照組及憂遁草巴布劑組給予小鼠創(chuàng)傷部位敷貼憂遁草巴布劑，每24小時更換一次。觀察各組小鼠在不同時間3，6，9，15d傷口的愈合情況。

B：小鼠“圓形”物理創(chuàng)傷實驗

選用昆明種小鼠60只，雌雄各半，SPF級，隨機分為6組，分別為空白對照(僅含基質(zhì)巴布劑)組，陽性對照(云南白藥粉末)組，陽性對照(林可霉素利多卡因凝膠劑)組，憂遁草酵素液巴布劑高、中、低劑量組，首先用戊巴比妥鈉40μg/g給予小鼠腹腔注射麻醉，在背部切取直徑為1.5cm大小的皮膚，深及筋膜肌肉。陽性對照組給予小鼠創(chuàng)傷部位涂抹云南白藥粉末，空白對照組及憂遁草酵素液巴布劑組給予小鼠創(chuàng)傷部位敷貼憂遁草酵素液巴布劑，每24小時更換一次，采用數(shù)碼照相的方法記錄1，3，6，9，12，15，20d的傷口面積，使用圖像軟件分析創(chuàng)面面積。計算創(chuàng)面皮膚愈合率，開始結(jié)痂、脫痂天數(shù)和愈合天數(shù)作為結(jié)果評價受試藥物的作用。末次用藥后次日監(jiān)測大鼠血樣，然后脫頸處死，剪取創(chuàng)傷部位皮膚，固定于10％甲醛溶液中，石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察比較各組小鼠割傷皮膚的表皮修復(fù)、真皮膠原纖維束修復(fù)、真皮毛囊增生、真皮及皮下組織炎癥細胞浸潤的愈合程度。

4.2.3抗菌活性

菌懸培養(yǎng)液法

(1)牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的制備

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方如下：

牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂15-20g、水1000ml、pH 7.4-7.6(7.0-18.0)

操作方法：

按培養(yǎng)基配方所指示的比例依次準(zhǔn)確地稱取牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉放入燒杯中。牛肉膏用玻棒挑取，放在培養(yǎng)基單面中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。我查到蛋白胨很易吸潮，所以快速準(zhǔn)確的稱取蛋白胨。在上述燒杯中可先加入少于1000ml的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再繼續(xù)加熱溶化，在瓊脂溶化的過程中，不斷攪拌，最后補足所失的水分。

在未調(diào)pH前，先用玻璃棒蘸取培養(yǎng)液放到pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH值，直至pH達7.6左右。培養(yǎng)基制作完畢后，在大三角燒瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。將培養(yǎng)基以121.3℃，20分鐘用高壓蒸汽鍋滅菌。滅菌一次時間大約2小時。裁取大約直徑6mm的濾紙片，放入干燥的培養(yǎng)皿上，進行121.3℃滅菌20分鐘，隨后可浸入各個液體中1小時，在無菌操作臺中操作。將配置好的培養(yǎng)基分裝到多個已高溫消毒的小三角燒杯中。

(2)菌液注入

用0.1ml無菌移液槍吸取0.01mL已充分混勻的大腸桿菌及0.01ml金黃葡萄球菌菌懸液，注射入分裝好的小三角燒瓶的未凝固的培養(yǎng)基中振蕩，使菌液充分混勻，倒平板常溫放置，備用。

濾紙片擴散法抑菌：

將蘸有各種濃度的藥液的濾紙片貼到上述兩種方法冷卻凝固后的培養(yǎng)基上。放置恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，每隔4小時觀察效果。

抗菌時間測定：在培養(yǎng)期間，每隔4小時觀察一次，記錄抑菌圈變化，找到抑菌圈最大直徑時間。

4.3實驗結(jié)果

4.3.1憂遁草酵素液巴布劑對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

結(jié)果見表8及圖7至圖11。由表8可知，與空白基質(zhì)組相比較，阿司匹林(陽性對照)組及憂遁草酵素液巴布劑高、中、低劑量組均能使小鼠耳廓的腫脹度降低，即使其腫脹得到一定的抑制。由表中數(shù)據(jù)顯示，其中憂遁草酵素液巴布劑高劑量組(800mg/kg)在各小組中腫脹抑制率最高(70.12％)，遠超過了阿司匹林組(陽性對照)400mg/kg劑量的腫脹抑制作用(43.53％)，憂遁草酵素液巴布劑中劑量組(400mg/kg)的腫脹抑制作用則與阿司匹林組的幾乎相當(dāng)，憂遁草酵素液巴布劑低劑量組(200mg/kg)也有較好的腫脹抑制作用，這表明，憂遁草酵素液巴布劑對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹有顯著的抑制作用，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

表8 憂遁草酵素液巴布劑對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響(n＝10)

與空白基質(zhì)組比較^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001

4.3.2憂遁草酵素液巴布劑對雞蛋清致小鼠足跖腫脹的影響

結(jié)果見表9及圖12。10％新鮮雞蛋清注射小鼠足跖后，阿司匹林(陽性對照)組及憂遁草酵素液巴布劑高、中、低劑量組在給藥后，均能較大程度降低小鼠足跖腫脹率，持續(xù)與模型組比較，有顯著差異(P＜0.001)；從腫脹抑制率的數(shù)據(jù)顯示，1h后與其他組相比較得出，憂遁草酵素液巴布劑高劑量組的腫脹抑制率65.05％最高，遠高于阿司匹林組腫脹抑制率46.87％。再查看2h、4h的腫脹抑制率，也是憂遁草酵素液巴布劑高劑量組的腫脹抑制率最高，憂遁草酵素液巴布劑中劑量組的腫脹抑制率與阿司匹林組的抑制效果幾乎相當(dāng)，而憂遁草酵素液巴布劑低劑量組的腫脹抑制率相對而言較差些。綜合來看，可以得出憂遁草酵素液巴布劑對新鮮雞蛋清所致小鼠足跖腫脹有顯著的抑制作用，從各劑量的結(jié)果表明，憂遁草酵素液巴布劑對抑制雞蛋清致小鼠足跖腫脹有一定的劑量依賴性。

表9 憂遁草酵素液巴布劑對雞蛋清致小鼠足跖腫脹的影響(±s，n＝10)

(1)

(2)

4.3.3憂遁草酵素液巴布劑對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響結(jié)果見表10

表10 憂遁草酵素液巴布劑對角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(n＝10)

(1)

(2)

4.3.4憂遁草酵素液巴布劑對小鼠背部“圓形”創(chuàng)面的促愈合作用，見表11及圖13，

表11 憂遁草酵素液巴布劑對小鼠背部“圓形”創(chuàng)面的促愈合作用

(1)

(2)

數(shù)據(jù)處理：

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，小鼠耳廊腫脹試驗數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，小鼠足址腫脹試驗數(shù)據(jù)組間比較采用多因素方差分析(Two-way ANOVA)，P＜0.05或P＜0.01時，組間差異判斷為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

4.3.5抗菌活性

菌懸培養(yǎng)液法

(1)憂遁草酵素萃取液的抗菌活性

憂遁草酵素的大腸桿菌抑菌圈實驗結(jié)果如圖14所示，

憂遁草酵素對大腸桿菌抑菌圈實驗結(jié)果如圖14所示，濾紙片上方是納濾液的大腸桿菌抑菌圈，左下方是憂遁草酵素10倍濃縮液，右下方是酵素5倍濃縮液。

表12 憂遁草酵素對大腸桿菌的抗菌活性

憂遁草酵素對金黃色葡萄球菌抑菌圈實驗結(jié)果如圖15所示，濾紙片上方是納濾液，下方左邊的是憂遁草原液的10倍濃縮液，右邊的是憂遁草原液5倍濃縮液。

表13 憂遁草酵素對金黃色葡萄球菌的抗菌活性

從表12和表13可以看出，憂遁草酵素納濾液的抑菌圈直徑最大，5倍濃縮液抑菌圈很小，10倍濃縮液抑菌圈近乎沒有。我們得出結(jié)論，憂遁草酵素乙酸乙酯提取液具有強抗菌活性，但是在高溫濃縮后，抗菌活性很低，則高溫環(huán)境會破壞憂遁草酵素的抗菌活性。

五、急性毒性實驗

5.1材料

5.1.1實驗動物：昆明種小鼠24只，體重18-22g，

5.1.2藥物：為上述實施例1制備的憂遁草酵素液巴布劑

5.2方法

將健康的昆明系清潔級小鼠24只，隨機分為A、B、C、D、E、F6組，雌雄數(shù)目相近，四個實驗組為完整皮膚高、低劑量組A、B，和破損皮膚高、低劑量組C、D，另外兩個對照組為完整皮膚對照組E和破損皮膚對照組F。高劑量憂遁草酵素液巴布劑為40ml的含藥量，低劑量憂遁草酵素液巴布劑為20ml的含藥量，破損皮膚組用消毒后的針頭劃痕，以滲血為度。實驗前24h用蒸餾水配置1％的戊巴比妥鈉溶液，每只小鼠腹腔注射約0.3ml，待小鼠麻醉后，用脫毛膏將其脊柱兩側(cè)毛脫凈，去毛區(qū)約為小鼠體表面積的15％，去毛后12h檢查去毛區(qū)的皮膚是否遭到損傷，確保完整皮膚組的準(zhǔn)確度。

兩個對照組貼上巴布劑基質(zhì)，高劑量的兩個組貼上含藥量為40ml的憂遁草酵素液巴布劑，低劑量的兩個組貼上20ml含藥量的憂遁草酵素液巴布劑，所有小鼠背上的巴布劑都用長寬合適的紗布纏繞固定，小鼠分籠飼養(yǎng)。受試24h后去除巴布劑，并用棉簽蘸取溫水將小鼠皮膚上的殘留物洗凈。主要觀察指標(biāo)為受試后小鼠的體重、皮膚、毛發(fā)、眼黏膜、四肢活動、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，觀察時間為去除受試物后1h、24h、48h、72h。

5.3實驗結(jié)果

6組小鼠的體重變化如下，結(jié)果見表14、表15、表16：

表14 完整皮膚高低劑量組各小鼠的體重變化

表15 破損皮膚高低劑量組各小鼠的體重變化

表16 對照組各小鼠的體重變化

由以上三表可以看出，完整皮膚組及破損皮膚組小鼠在高劑量和低劑量巴布劑的作用下，體重未發(fā)生明顯變化，作為對照的E、F兩組各小鼠的體重也變化不明顯，處于一個正常的狀態(tài)，因此可以得出，憂遁草酵素液巴布劑在高低劑量下，對小鼠的體重不會產(chǎn)生影響。

在觀察時間內(nèi)，各組小鼠的毛發(fā)、眼黏膜未見異常，四肢活動正常，能夠行走攀爬，呼吸平穩(wěn)，與實驗前無異，綜合以上觀察數(shù)據(jù)，可以看出小鼠受試后并未出現(xiàn)任何的中毒表現(xiàn)，因此，憂遁草酵素液巴布劑對小鼠沒有毒性。

六、長期毒性實驗

6.1材料

6.1.1實驗動物：昆明種小鼠40只，體重18-22g，

6.1.2藥物：為上述實施例1制備的憂遁草酵素液巴布劑

6.2方法

將健康的昆明系清潔級小鼠40只，重量20g左右，隨機分為4組，雌雄數(shù)目相近，其中兩個實驗組為完整皮膚組A、破損皮膚組B，另外兩個對照組為完整皮膚組C、破損皮膚組D，每組10只，每只小鼠分籠飼養(yǎng)。實驗前24h用蒸餾水配置1％的戊巴比妥鈉溶液，每只小鼠腹腔注射約0.3ml，待小鼠麻醉后，用脫毛膏將其脊柱兩側(cè)毛脫凈，去毛后12h檢查去毛區(qū)的皮膚是否遭到損傷，破損皮膚組用消毒后的針頭劃痕，以皮膚破損滲血為度。

實驗組受試憂遁草酵素液巴布劑，對照組受試空白基質(zhì)，每只小鼠的受試部位用潔凈紗布纏繞固定巴布劑。每天用藥一次，每次持續(xù)8h，每天觀察用藥處小鼠皮膚的變化情況，同時觀察其毛發(fā)、四肢活動、精神狀態(tài)等，每周脫毛一次、稱重一次。連續(xù)用藥8周后，每組均處死5只小鼠，剩余小鼠在停藥1周內(nèi)繼續(xù)觀察，一周后處死。

每只小鼠在處死后，快速打開胸腔暴露心臟，持10ml注射器經(jīng)左心室插入抽取5-8ml血液標(biāo)本，測定血液生化指標(biāo)，即天門冬氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、兩氣酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHOL)并比較組間差異，取心、肺、肝、脾、腎稱重，計算臟器指數(shù)，并與對照組比較。

6.3實驗結(jié)果

6.3.1一般變化

表17 給藥期間實驗動物一般情況觀察

表18 停藥期間實驗動物一般情況觀察

由表17及表18可以看出，用藥組和對照組在8周內(nèi)及停藥1周期間，外觀均無明顯變化，毛發(fā)未見不正常脫落，色澤正常，四肢活動正常，無腹瀉不進食等變化。

6.3.2體重變化

表19 憂遁草巴布劑對小鼠體重的影響(x±s)

從表19可以看出，實驗組的小鼠體重處于正常增長狀態(tài)，且每周的體重變化波動不大，與對照組無較大差異，表明憂遁草巴布劑不會影響到小鼠的體重變化。

6.3.3生化指標(biāo)變化

表20 給藥8周后對小鼠生化指標(biāo)的影響(x±s)

表21 停藥1周后對小鼠生化指標(biāo)的影響(x±s)

由表20表21可以看出，長期外用憂遁草酵素液巴布劑的各組小鼠血液生化指標(biāo)與對照組相比并無明顯差異。

6.3.4臟器系數(shù)變化

表22 給藥8周后對小鼠臟器系數(shù)的影響(x±s)

表23 停藥1周后對小鼠臟器系數(shù)的影響(x±s)

小鼠解剖未發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠的心、肝、脾、肺、腎有明顯異常，且由表22表23可以看出，實驗組小鼠的臟器系數(shù)與對照組無明顯差異。

6.4分析

實驗結(jié)果表明，長期外用憂遁草酵素液巴布劑的小鼠皮膚毛發(fā)、四肢活動、飲食等皆正常，體重變化與對照組小鼠幾乎無異，血液生化指標(biāo)也處于正常狀態(tài)，解剖發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟均無病變，因此可以得出，長期使用憂遁草酵素液巴布劑對小鼠不會有毒性作用。

根據(jù)上述說明書的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對上述實施方式進行變更和修改。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實施方式，對本發(fā)明的一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術(shù)語，但這些術(shù)語只是為了方便說明，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。