本發(fā)明涉及一種黃酮類化合物，特別是涉及一種從海蘆筍中總黃酮的提取制備方法。
背景技術(shù)：
海蘆筍是藜科鹽角草屬的、無(wú)葉、莖枝肉質(zhì)化的鹽生植物，在我國(guó)沿海地區(qū)有廣泛分布。作為堿性作物，海蘆筍可利用天然海水灌溉且不易患病生蟲(chóng)，是具有較好發(fā)展前景的一種新型、綠色、無(wú)公害的海水蔬菜。海蘆筍不僅含有普通蔬菜所含的氨基酸、維生素、膳食纖維等各類營(yíng)養(yǎng)成分，而且具有多種生物活性成分。因此，海蘆筍除了可作為蔬菜還具有較高的保健價(jià)值以及藥用價(jià)值。其中，黃酮類化合物作為重要的植物次生代謝產(chǎn)物，是海蘆筍中含有的一類重要抗氧化活性物質(zhì)。已有的研究表明，黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗疲勞、抗衰老、保護(hù)肝臟等多種多樣的生物活性，臨床應(yīng)用廣泛，是有效的抗氧化劑、金屬螯合劑、自由基清除劑等。因此，海蘆筍中的黃酮類化合物在食品添加劑、保健食品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域具有良好前景。
目前關(guān)于從海蘆筍中制備黃酮類化合物的方法分為兩個(gè)方面，一是粗黃酮的提取方法，主要包括乙醇浸提法以及微波輔助浸提法，通過(guò)這兩種方法得到的黃酮粗品，純度較低，無(wú)法滿足黃酮在各方面應(yīng)用的要求；二是粗黃酮的分離純化方法，包括硅膠柱層析、凝膠柱層析、液液萃取等，這些方法適用于實(shí)驗(yàn)室但都不便應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的，傳統(tǒng)上黃酮工業(yè)純化方法一般選用大孔吸附樹(shù)脂純化法，大孔樹(shù)脂對(duì)黃酮類化合物的吸附主要是物理吸附，根據(jù)其表面的空穴結(jié)構(gòu)及極性不同吸附目標(biāo)產(chǎn)物，而聚酰胺樹(shù)脂作為由酰胺聚合而成的一類高分子物質(zhì)，其黃酮類化合物的吸附機(jī)理為“氫鍵吸附”其選擇性與強(qiáng)度要強(qiáng)于物理吸附，是一種黃酮的理想吸附劑，其分子中既含有酰胺基，又含有非極性的脂肪鏈，因而具有良好的親水性與親脂性。黃酮類化合物所含有的酚羥基可以與聚酰胺中的酰胺基作用形成氫鍵，因此對(duì)黃酮具有較強(qiáng)的吸附性能，而且聚酰胺樹(shù)脂可再生后多次使用，但目前對(duì)此方法應(yīng)用于海蘆筍黃酮純化的研究鮮有報(bào)道。
因此本發(fā)明以聚酰胺樹(shù)脂與大孔樹(shù)脂對(duì)海蘆筍黃酮進(jìn)行聯(lián)合純化，根據(jù)吸附性能的不同對(duì)海蘆筍黃酮進(jìn)行選擇性吸附后，再根據(jù)洗脫劑濃度的區(qū)別控制洗脫劑極性，從而控制所得產(chǎn)物，以此得到具有較高純度、適用于多種要求的海蘆筍總黃酮。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種從海蘆筍中總黃酮的制備方法，實(shí)現(xiàn)低成本大量制備具有較高純度的海蘆筍總黃酮，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的空白與不足。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的具體技術(shù)方案為：
一種海蘆筍中總黃酮的制備方法，包括以下步驟：
1)首先清洗海蘆筍，烘干、粉碎并過(guò)篩，然后加入乙醇溶液中進(jìn)行攪拌浸提；浸提結(jié)束后，將浸提液離心取上清液；并將殘?jiān)俅渭尤胍掖既芤航?，浸提后離心取上清；
2)將步驟1)中得到的上清液合并后進(jìn)行減壓蒸發(fā)，除盡乙醇得到海蘆筍總黃酮的粗品溶液；
3)聚酰胺樹(shù)脂的活化預(yù)處理；
4)預(yù)處理過(guò)的聚酰胺樹(shù)脂按1:5～1:8的徑高比濕法裝柱后，將步驟2)制備的粗黃酮溶液過(guò)聚酰胺樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附，上樣結(jié)束后，靜置，使黃酮與聚酰胺樹(shù)脂充分接觸后，先用3～5個(gè)柱體積的蒸餾水對(duì)聚酰胺樹(shù)脂柱進(jìn)行洗脫，除去殘留在柱上的多糖等水溶性雜質(zhì)后，再通過(guò)乙醇溶液進(jìn)行洗脫；
5)將洗脫液濃縮后，再按步驟4)進(jìn)行吸附洗脫，最后將洗脫液濃縮、離心取上清后，水洗沉淀超聲波促溶再次離心取上清合并、低溫干燥后得到純度較高的海蘆筍總黃酮。
進(jìn)一步的，上述制備方法還包括第6)步，將D101型與HPD600型大孔樹(shù)脂按照0:1～2:3的比例混合均勻后濕法裝柱，將上述步驟5)得到的海蘆筍總黃酮配制成一定濃度、調(diào)節(jié)pH為4～7后上樣吸附，水洗雜質(zhì)后，以乙醇溶液洗脫得到海蘆筍總黃酮。
進(jìn)一步的，上述步驟1)中海蘆筍粉末于20～80℃，用料液比為1：30～1：70的乙醇溶液攪拌浸提，乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為60％。
優(yōu)選的，上述步驟1)中乙醇溶液浸提溫度為35℃。
進(jìn)一步的，上述步驟3)預(yù)處理具體為：將40～100目的聚酰胺樹(shù)脂浸泡在95％的乙醇溶液中，攪拌除去氣泡后濕法裝柱，以3～5個(gè)柱體積的95％乙醇溶液淋洗后，用蒸餾水洗至流出液沒(méi)有醇味，再依次用2～3個(gè)柱體積的5％的NaOH溶液，2～3個(gè)柱體積的蒸餾水，2～3個(gè)柱體積的10％醋酸溶液淋洗，最后用蒸餾水淋洗至中性。
進(jìn)一步的，上述步驟4)中將粗黃酮溶液通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂柱進(jìn)行吸附時(shí)，將粗黃酮溶液調(diào)節(jié)至pH＝3。
以往對(duì)聚酰胺樹(shù)脂的研究中，多采用粗黃酮原液與聚酰胺樹(shù)脂混合后吸附，但本發(fā)明研究結(jié)果表明當(dāng)海蘆筍黃酮上樣液pH為3時(shí)與聚酰胺樹(shù)脂柱結(jié)合效果最佳。原理分析：聚酰胺樹(shù)脂主要通過(guò)自身的酰胺鍵與黃酮的酚羥基結(jié)合形成氫鍵從而完成吸附過(guò)程，pH＝3時(shí)，溶液呈酸性，此時(shí)黃酮類化合物在溶液中以分子狀態(tài)存在，更易與聚酰胺形成氫鍵，從而有利于吸附。
上述步驟4)中采用90％的乙醇溶液進(jìn)行洗脫。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明制備步驟簡(jiǎn)單，所使用的聚酰胺樹(shù)脂和大孔樹(shù)脂，價(jià)格低廉，可再生多次重復(fù)使用。經(jīng)本發(fā)明研究，當(dāng)海蘆筍粗黃酮溶液pH＝3時(shí)，在聚酰胺樹(shù)脂柱上的吸附效果最佳，吸附效率高達(dá)86％；在解吸過(guò)程，以90％的乙醇溶液作為黃酮洗脫劑時(shí)，洗脫率最高，達(dá)到77％。利用本發(fā)明制備得到海蘆筍黃酮純度達(dá)到80％以上，得率較高，原料和提取材料易得價(jià)廉，產(chǎn)品呈淡黃色，質(zhì)量好，易溶于水，能夠滿足在功能性食品、食品添加劑、化妝品等領(lǐng)域的推廣應(yīng)用，為海蘆筍的開(kāi)發(fā)利用提供了新思路。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步解釋和說(shuō)明。
實(shí)施例1：海蘆筍總黃酮粗品提取
取10g的粉碎海蘆筍，用200ml～700ml的、體積分?jǐn)?shù)分別為40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇溶液在30～50℃分別恒溫水浴振蕩提取2.5個(gè)小時(shí)，離心，殘?jiān)昧弦罕?：10～1：40的乙醇溶液浸提，離心后合并上清液，上清液經(jīng)過(guò)低溫減壓濃縮，得到的海蘆筍總黃酮粗品溶液。
以海蘆筍黃酮的提取率為考察指標(biāo)，分析可得，當(dāng)乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為60％時(shí)，提取效果最佳，提取率為6.7％，小于60％或者大于60％都會(huì)使海蘆筍總黃酮的提取率降低。
實(shí)施例2：海蘆筍總黃酮粗品提取
取10g海蘆筍粉末，用200ml～700ml的、體積分?jǐn)?shù)分別為60％、的乙醇溶液在25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃下分別恒溫水浴振蕩提取2.5個(gè)小時(shí)，離心，殘?jiān)昧弦罕?：10～1：40的60％乙醇溶液浸提，離心后合并上清液，上清液經(jīng)過(guò)低溫減壓濃縮，得到的海蘆筍總黃酮粗品溶液。
以海蘆筍黃酮的提取率為考察指標(biāo)，溫度對(duì)提取率結(jié)果的影響，由結(jié)果可知，浸提溫度為35℃時(shí)，提取率顯著優(yōu)于其他溫度，繼續(xù)升高溫度其他雜質(zhì)的溶出會(huì)相繼增多，與黃酮爭(zhēng)奪溶劑，且溫度升高會(huì)造成溶劑濃度的改變從而造成海蘆筍總黃酮的提取率降低。
實(shí)施例3：通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂對(duì)海蘆筍黃酮進(jìn)行吸附
室溫下，將預(yù)處理過(guò)的聚酰胺樹(shù)脂以蒸餾水為裝柱液濕法上柱，取50～100mL的粗黃酮溶液，利用鹽酸溶液調(diào)節(jié)其分別為pH＝3、pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝7，以流速為30～150mL/h進(jìn)行吸附。
通過(guò)對(duì)海蘆筍總黃酮在聚酰胺樹(shù)脂上的吸附率的分析表明，當(dāng)粗黃酮溶液pH＝3時(shí)，聚酰胺樹(shù)脂的吸附效果最佳，pH>3時(shí)，黃酮的吸附效果隨著pH升高，吸附率降低，損失增加。
實(shí)施例4：對(duì)聚酰胺樹(shù)脂吸附的黃酮進(jìn)行洗脫
取50～100mL的、pH調(diào)為3的粗黃酮溶液，在室溫通過(guò)上聚酰胺樹(shù)脂柱吸附后，以3～5倍柱體積的蒸餾水洗去殘留的多糖類水溶性雜質(zhì)后，分別用體積為5～10倍柱體積的、體積分?jǐn)?shù)為40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇溶液洗脫，流速30～180mL/h。洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，低溫干燥得到海蘆筍總黃酮。
通過(guò)對(duì)海蘆筍總黃酮的洗脫率的分析表明，當(dāng)洗脫劑濃度為90％時(shí)，洗脫效果最好，洗脫率達(dá)77％，黃酮回收率為67％，隨著乙醇溶液濃度的降低，黃酮的洗脫率降低，而黃酮回收率也隨之降低。
實(shí)施例5：對(duì)海蘆筍粗黃酮進(jìn)行聚酰胺-聚酰胺-混合大孔樹(shù)脂三次聯(lián)合純化
取50～100mL的、經(jīng)鹽酸溶液調(diào)pH為3的粗黃酮溶液，以30～150mL/h的流速通過(guò)聚酰胺樹(shù)脂柱吸附后，以3～5倍柱體積的蒸餾水洗去殘留的多糖類水溶性雜質(zhì)后，再用5～10倍柱體積的、體積分?jǐn)?shù)為90％的乙醇溶液洗脫，流速30～180mL/h。洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，6000rm/min離心，將沉淀加適量水超聲波促溶混勻，再次離心后，合并上清液；將所得黃酮溶液調(diào)節(jié)濃度與pH后，按照上述步驟再次過(guò)聚酰胺樹(shù)脂柱純化，經(jīng)90％洗脫得到的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后離心，離心所得沉淀加水混勻后再次離心后、合并上清液；所得黃酮溶液調(diào)節(jié)至一定濃度后，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為5～7，以30～120mL/h的流速過(guò)混合大孔樹(shù)脂柱純化，以3～5倍柱體積的蒸餾水洗去雜質(zhì)后，以6～12倍柱體積的乙醇溶液洗脫得到洗脫液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，低溫干燥得到具有較高純度的海蘆筍總黃酮。
采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)制備的海蘆筍總黃酮進(jìn)行測(cè)定，測(cè)出經(jīng)三次聯(lián)合純化的海蘆筍總黃酮純度達(dá)80％以上。
本發(fā)明的提取方法及確定的最佳純化工藝條件，可以低成本的大量制備海蘆筍總黃酮，所制備的海蘆筍總黃酮可在功能性食品、食品添加劑、化妝品等多方面應(yīng)用。