本實施方案總體上涉及硫酸葡聚糖，具體地涉及具有改善的生物效應(yīng)和低毒性的新型硫酸葡聚糖。

背景

葡聚糖是復雜的支鏈葡聚糖(glucan)，即由葡萄糖單元構(gòu)成的多糖，其由通常為1千或數(shù)千道爾頓(da)高至數(shù)十萬da的不同長度的鏈組成。

葡聚糖的直鏈由葡萄糖單元之間的α-1,6糖苷鍵組成，而分支通常始于α-1,3鍵。葡聚糖由某些乳酸菌，諸如腸膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)、變形鏈球菌(streptococcusmutans)和短乳桿菌(lactobacillusbrevis)從蔗糖合成。

硫酸葡聚糖是葡聚糖的聚陰離子衍生物，其中一些c2-c4以及端基c1和c6位置被硫酸化。硫酸葡聚糖已為人所知數(shù)十年，特別是在抗凝療法中作為肝素的潛在替代品。

硫酸葡聚糖分子可以有不同的分子量、不同的支化水平和不同的硫酸根含量和硫酸化模式。硫酸葡聚糖分子之間的這些物理和化學差異會產(chǎn)生不同的生物效應(yīng)和毒性效應(yīng)。

需要具有改善的生物效應(yīng)，同時在藥物相關(guān)劑量下仍然沒有毒性的硫酸葡聚糖。

概述

總體目標是提供具有改善的生物效應(yīng)同時在藥物相關(guān)劑量下仍然沒有毒性的硫酸葡聚糖。

該目標和其它目標由本文公開的實施方案來實現(xiàn)。

實施方案的一個方面涉及具有如通過核磁共振(nmr)光譜測量的在1850da至3500da的區(qū)間內(nèi)的數(shù)均分子量(mn)的硫酸葡聚糖或其鹽。硫酸葡聚糖或其鹽還具有在2.5至3.0的區(qū)間內(nèi)的每個葡萄糖單元的平均硫酸根數(shù)。此外，硫酸葡聚糖或其鹽的葡萄糖單元中c2位置的平均硫酸化為至少90％。

相較于市售的類似硫酸葡聚糖糖分子，實施方案的硫酸葡聚糖具有改善的生物效應(yīng)和/或降低的毒性。

附圖簡述

通過參考以下結(jié)合附圖的描述，可以最好地理解實施方案及其進一步的目標和有利方面，其中：

圖1是聚焦在具有葡聚糖信號的區(qū)域上的葡聚糖原料的1d¹hnmr譜的擴展。

圖2是葡聚糖起始原料與實施方案的硫酸葡聚糖(批號3)的1d¹hnmr譜的比較。

圖3舉例說明覆蓋有硫酸葡聚糖起始原料的相應(yīng)譜的實施方案的硫酸葡聚糖(批號1)在25℃下的2d¹³c-¹hhsqc譜。

圖4舉例說明實施方案的硫酸葡聚糖(批號3)在25℃下的1d¹hnmr譜。

圖5舉例說明實施方案的硫酸葡聚糖(批號3)在25℃下的2d¹³c-¹hhsqc譜。每個峰對應(yīng)于不同化學環(huán)境的c-h鍵。峰面積與每個c-h鍵的群體大致成比例。

圖6舉例說明根據(jù)實施方案的硫酸葡萄糖分子(頂部-批號1，中間-批號2，底部-批號3)的1d¹hnmr譜的硫酸葡聚糖區(qū)域的比較。

圖7舉例說明實施方案的硫酸葡聚糖(批號3)在25℃下的2d¹³c-¹hhsqc譜。

圖8舉例說明硫酸葡聚糖對外周血中的白細胞的作用。通過以50mg/kg的劑量單次i.v.注射不同平均分子量的硫酸葡聚糖來處理動物。緩沖鹽水(nacl)用作媒介物對照。用巴比妥五鈉(pnb)替代異氟烷來鎮(zhèn)靜一些動物，以比較不同麻醉方法的作用。誤差棒顯示平均值的標準誤差(sem)。使用學生t檢驗來評估相較于對照組的統(tǒng)計學上的顯著性差異(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

圖9舉例說明硫酸葡聚糖對動員造血祖細胞移動至外周血中的功效。通過單次i.v.注射不同平均分子量的硫酸葡聚糖或利用媒介物(nacl)來處理動物。誤差棒顯示sem。使用學生t檢驗來評估相較于對照組的統(tǒng)計學上的顯著性差異(*p<0.05)。

圖10舉例說明硫酸葡聚糖對升高外周血中的hgf水平的功效。通過單次i.v.注射不同平均分子量的硫酸葡聚糖或用媒介物(nacl)來處理動物。誤差棒顯示sem。使用學生t檢驗來評估相較于對照組的統(tǒng)計學上的顯著差異(***p<0.001)。

圖11舉例說明施用的硫酸葡聚糖5hs(30.0mg/kg)和實施方案的硫酸葡聚糖(批次3，30mg/kg)以及媒介物對累積疾病指數(shù)的作用。

圖12是舉例說明用于實施方案的硫酸葡聚糖的生產(chǎn)的生產(chǎn)方法的流程圖。

圖13舉例說明根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的硫酸葡聚糖的1d¹hnmr譜。

圖14舉例說明根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的硫酸葡聚糖的2d¹³c-¹hhsqc光譜。

詳述

本實施方案總體上涉及硫酸葡聚糖，具體地涉及具有改善的生物效應(yīng)和低毒性的新型硫酸葡聚糖。

本實施方案基于令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，即硫酸葡聚糖分子具有顯著不同的生物效應(yīng)，盡管所述硫酸葡聚糖分子具有相似的化學和物理性質(zhì)。因此，已制得具有導致相較于市售的類似硫酸葡萄糖分子的改善的生物效應(yīng)和低毒性的數(shù)均分子量和硫酸化含量以及模式的硫酸葡聚糖。

常規(guī)地，已使用大小排阻色譜(sec)，諸如sec高效液相色譜(hplc)(或簡稱為se-hplc)在分子量參數(shù)方面表征了硫酸葡聚糖分子。sec在本領(lǐng)域也被稱為凝膠過濾色譜、凝膠滲透色譜(gpc)或分子篩色譜。用于測量硫酸葡聚糖和相關(guān)葡聚糖的分子量參數(shù)的其它常用技術(shù)是光散射，諸如靜態(tài)光散射(sls)或基于粘度的技術(shù)。

然而，這些測定硫酸葡聚糖的分子量參數(shù)的技術(shù)報告了分子體積和形狀函數(shù)，而不是其分子量。這意味著如果硫酸葡聚糖分子在測量期間形成聚集體或復合物，則測定了較高的表觀分子量。

此外，測量中使用的幾個因素和設(shè)置影響硫酸葡聚糖分子的表觀分子量，諸如色譜柱和洗脫劑的選擇、流速設(shè)置、校準程序(包括校準程序中使用的葡聚糖標準)、硫酸葡聚糖分子的電荷等。

另外，間接方法反而報告了分子體積和形狀，所述分子體積和形狀可以不僅在批次間顯著不同，而且可在相同批次中的樣品間顯著不同，這取決于例如硫酸葡聚糖是被如何儲存的，其在測量前是如何制備的等。

已使用更精確的技術(shù)來測定硫酸葡聚糖的分子量參數(shù)，所述技術(shù)提供真實的分子量參數(shù)，而不是受大小影響的參數(shù)。進一步將該技術(shù)與上述常規(guī)使用的技術(shù)進行比較。

為了能夠通過不同的方法直接比較分子量/大小測定，重要的是要理解如下所列的常用分子大小定義。參數(shù)ni表示樣品或批次中分子量為mi的硫酸葡聚糖分子的數(shù)量。

數(shù)均分子量(mn)：通常通過端基測定例如核磁共振(nmr)光譜或色譜法產(chǎn)生的。如果假定正態(tài)分布，則可在mn的每一側(cè)發(fā)現(xiàn)相同數(shù)量的硫酸葡聚糖分子，即樣品中分子量低于mn的硫酸葡聚糖分子的數(shù)量等于樣品中分子量高于mn的硫酸葡聚糖分子的數(shù)量。

重均分子量(mw)：通常用于對分子大小而非數(shù)值敏感的方法，例如光散射和sec方法。如果假定正態(tài)分布，則在mw的每一側(cè)上的重量相同，即樣品中分子量低于mw的硫酸葡聚糖分子的總重量等于樣品中分子量高于mw的硫酸葡聚糖糖分子的總重量。

平均分子量或粒徑平均平均分子量(sizeaveragemolecularweights)(mz)：通常用于測量分子運動的方法如擴散技術(shù)或沉淀。通常地，對高分子量聚合物更敏感。值得注意的是，n＝0給出mn，n＝1給出mw。

多分散指數(shù)(pdi)(mw/mn)，分子量分布寬度的常用量度。值1表示單分散聚合物，1.02至1.10對于充分受控制的合成聚合物而言是常見的，1.5至2對于鏈式反應(yīng)產(chǎn)物是常見的，而～2對于步驟聚合產(chǎn)物是常見的。

分子量分布模式(mp)表示液相色譜(lc)色譜圖中最高峰的分子量。常用于標準聚合物的狹窄分布，并通過gpc/sec或光散射測定。

實施方案的一個方面涉及特征在于如通過nmr光譜測量的在1850da至3500da的區(qū)間內(nèi)的數(shù)均分子量(mn)的硫酸葡聚糖或其鹽。所述硫酸葡聚糖或其鹽還具有在2.5至3.0的區(qū)間內(nèi)的每個葡萄糖單元的平均硫酸根數(shù)，并且所述硫酸葡聚糖或其鹽的葡萄糖單元中的c2位置的平均硫酸化度為至少90％。

實施方案的硫酸葡聚糖或其鹽具有非常窄的分子量參數(shù)值的范圍，即數(shù)均分子量(mn)。該數(shù)均分子量(mn)通過如本文進一步描述的基于nmr譜的端基測定來測量。與常規(guī)使用的gpc、sec和光散射技術(shù)相比，nmr譜測量提供了在分子量參數(shù)測定方面更一致的結(jié)果。此外，nmr譜測量提供了不受任何聚集或復合物形成影響(這在常規(guī)使用的技術(shù)中是常見的問題)的硫酸葡聚糖分子的真實或正確的數(shù)均分子量(mn)。

在一個具體的實施方案中，硫酸葡聚糖或其鹽具有如通過nmr光譜測量的在1850da至2500da的區(qū)間內(nèi)，優(yōu)選在1850da至2300da的區(qū)間內(nèi)的數(shù)均分子量(mn)。在具體的實施方案中，硫酸葡聚糖或其鹽(不包括任何抗衡離子)具有如通過nmr光譜測量的在1850da至2200da的區(qū)間內(nèi)，優(yōu)選在1850da至2100da的區(qū)間內(nèi)，更優(yōu)選在1850da至2000da的區(qū)隔內(nèi)的數(shù)均分子量(mn)。

在實施方案中，硫酸葡聚糖的鹽是鈉鹽或鉀鹽，優(yōu)選鈉鹽。該鹽優(yōu)選為硫酸葡聚糖的藥學上可接受的鹽。

在具體的實施方案中，包括na⁺抗衡離子的硫酸葡聚糖的鈉鹽具有如通過nmr光譜測定的在1850da至3500da的區(qū)間內(nèi)，優(yōu)選在2000da至2500da的區(qū)間內(nèi)，更優(yōu)選在2000da至2400da的區(qū)間內(nèi)，諸如在2100da至2300da的區(qū)間內(nèi)的數(shù)均分子量(mn)。

在實施方案中，硫酸葡聚糖或其鹽優(yōu)選具有在4.0至6.0的區(qū)間內(nèi)的葡萄糖單元的平均數(shù)。在優(yōu)選實施方案中，硫酸葡聚糖或其鹽具有在4.5至5.5的區(qū)間內(nèi)，更優(yōu)選在5.0至5.2的區(qū)間內(nèi)(諸如5.1)的葡萄糖單元的平均數(shù)。

在實施方案中，硫酸葡聚糖或其鹽具有在2.5至2.8的區(qū)間隔內(nèi)，優(yōu)選在2.6至2.7的區(qū)間內(nèi)的每個葡萄糖的平均硫酸根數(shù)。

在4.0至6.0的區(qū)間內(nèi)的葡萄糖單元的平均數(shù)目和在2.5至3.0的區(qū)間內(nèi)的每個葡萄糖單元的平均硫酸根數(shù)導致在10.0至18.0的區(qū)間內(nèi)的硫酸葡聚糖或其鹽中的硫酸根原子的總數(shù)。在實施方案中，硫酸葡聚糖或其鹽優(yōu)選具有在11.25至15.4的區(qū)間內(nèi)，優(yōu)選在13.0至14.0的區(qū)間內(nèi)的硫酸根原子的總數(shù)。

通常，具有平均5.1個葡萄糖單元和2.6至2.7的每個葡萄糖單元的平均硫酸根數(shù)的實施方案的硫酸葡聚糖分子通常導致如通過nmr光譜測量的在1850da至2000da的區(qū)間隔內(nèi)的數(shù)均分子量(mn)。

下式示意性地表示具有3個葡萄糖單元和最大數(shù)目的硫原子的硫酸葡聚糖分子，即可被硫酸化的葡聚糖核心中的每個位點或位置在結(jié)構(gòu)式中已被硫酸化。因此，非末端葡萄糖單元被示為在c2、c3和c4位置硫酸化，具有游離c1位置的末端葡萄糖單元在c1、c2、c3和c4位置被硫酸化，具有游離c6位的末端葡萄糖單元在c2、c3、c4和c6位置硫酸化。

硫酸葡聚糖或其鹽的葡萄糖單元中的c2位置的平均硫酸化度為至少90％。在一個實施方案中，c2位置的平均硫酸化度至少為95％。

在一個實施方案中，硫酸葡聚糖或其鹽的葡萄糖單元中的c2、c3和c4位置處的平均硫酸根數(shù)在2.0至2.6的區(qū)間內(nèi)，優(yōu)選在2.2至2.6的區(qū)間內(nèi)，諸如在2.3至2.5的區(qū)間內(nèi)。

在一個實施方案中，硫酸葡聚糖或其鹽的葡萄糖單元中的c3位置的平均硫酸化度在80％至90％的區(qū)間內(nèi)，優(yōu)選在84％至87％的區(qū)間內(nèi)。

實施方案的硫酸葡聚糖或鹽由此在葡聚糖核心中的葡萄糖單元中的c2、c3和c4位置處具有高度的硫酸化。在一個具體實施方案中，這些位置的至少70％被硫酸化，更優(yōu)選這些位置的至少75％被硫酸化。在一個具體實施方案中，葡聚糖核心中的c2、c3和c4位置總數(shù)的75％至85％被硫酸化。

在一個實施方案中，端基c6的平均硫酸化度為至少80％，優(yōu)選至少85％。

端基c1可以采取α-構(gòu)型或β-構(gòu)型。通常地，在這兩種端基構(gòu)型之間存在平衡。

當假定β-構(gòu)型與α-構(gòu)型相比時，端基c1似乎更容易被硫酸化。因此，在一個具體實施方案中，與α-構(gòu)型相比，β-構(gòu)型中的端基c1的硫酸化度更高。在一個實施方案中，β-構(gòu)型中的端基c1的平均硫酸化度為至少75％，優(yōu)選至少80％或至少85％。相應(yīng)地，在一個實施方案中，α-構(gòu)型中的端基c1的平均硫酸化優(yōu)選為至少15％，優(yōu)選在15％至75％的區(qū)間內(nèi)，更優(yōu)選在15％至50％的區(qū)間內(nèi)，諸如在15％至45％的區(qū)間內(nèi)。

在一個實施方案中，端基c1位置被硫酸化或與-oh鍵合。因此，硫酸葡聚糖或其鹽優(yōu)選除硫酸化(-so3)外沒有任何末端修飾。

如背景中所述，葡聚糖的直鏈由葡萄糖單元之間的α-1,6糖苷鍵組成。葡聚糖分子可以是僅由非支鏈中的葡萄糖單元組成的直鏈。葡聚糖分子還可通常通過α-1,3鍵來支化。

在一個實施方案中，硫酸葡聚糖或其鹽具有小于5.0％，諸如小于3.0％，優(yōu)選小于1.5％，諸如小于1.0％的葡萄糖單元的平均支化。因此，實施方案的硫酸葡聚糖或其鹽優(yōu)選為具有少量分支(如果有的話)的高度直鏈的分子。

一個具體實施方案涉及具有如通過nmr光譜測量的在2100da至2300da的區(qū)間內(nèi)的數(shù)均分子量(mn)的硫酸葡聚糖的鈉鹽(包括na⁺抗衡離子)。硫酸葡聚糖的鹽平均具有5.0至5.2個葡萄糖單元，并且每個葡萄糖單元的平均硫酸根數(shù)在2.5至2.8的區(qū)間內(nèi)。在一個具體實施方案中，c2位置的平均硫酸化度為至少95％。葡萄糖單元中的c2、c3和c4位置處的平均硫酸根數(shù)更優(yōu)選在2.2至2.6的區(qū)間內(nèi)。

相較于市售的類似硫酸葡聚糖糖分子，實施方案的硫酸葡聚糖具有改善的生物效應(yīng)和/或較低的毒性，如下面的實驗中所示的。鑒于硫酸葡聚糖分子具有非常相似的分子量和硫酸化參數(shù)，生物效應(yīng)和毒性的這些差異是非常令人驚訝的。因此，似乎具有特定范圍的分子參數(shù)值和硫酸化參數(shù)值，所述參數(shù)值為硫酸葡聚糖糖分子提供優(yōu)于具有在實施方案的所述特定范圍或區(qū)間之外的分子量參數(shù)值和/或硫酸化參數(shù)值的其它硫酸葡聚糖分子的這些有利效應(yīng)。

硫酸葡聚糖通過在酯化反應(yīng)中使葡聚糖起始物質(zhì)硫酸化來產(chǎn)生。在用于生產(chǎn)硫酸葡聚糖的現(xiàn)有技術(shù)中公開了各種生產(chǎn)方法。公開此類生產(chǎn)方法的文獻的實例包括biochemicaljournal,51:129-133(1952)；瑞典專利第165090號；美國專利第2,715,091號、第3,141,014號、第3,498,972號和第4,855,416號。不同的生產(chǎn)方法使用不同的硫酸化劑，諸如濃硫酸(h2so4)、三氧化硫(so3)或氯磺酸(clso3h)；不同溶劑，諸如吡啶(c5h5n)、甲酰胺(nh2coh)或乙酰胺(ch3conh2)；和不同的工藝參數(shù)。這些差異可影響硫酸葡聚糖終產(chǎn)物的化學和物理性質(zhì)。

下面參考圖12描述當前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。硫酸葡聚糖通過硫酸化葡聚糖原料而產(chǎn)生。通過乙醇分餾法來實現(xiàn)具有適當分子量的硫酸葡聚糖的分離，其中最大分子量分子首先沉淀。

在第一步驟中，將葡聚糖原料在攪拌下添加至溶劑甲酰胺中。將容器內(nèi)容物攪拌并溫和地加熱，隨后將混合物轉(zhuǎn)移至洗滌器中冷卻。

在酯化反應(yīng)中，在用鹽水冷卻的情況下，在5-6小時中加入氯磺酸。使溫度保持恒定≤34℃，如果需要，用1個大氣壓的水蒸氣加熱。將混合物通過洗滌器轉(zhuǎn)移至另一個容器中，然后用純凈水漂洗。在第一次乙醇沉淀前進行攪拌。

在替代實施方案中，在用鹽水冷卻的情況下，在約3小時的過程中將氯磺酸添加至一部分甲酰胺中。然后將葡聚糖和剩余甲酰胺的混合物轉(zhuǎn)移至含有氯磺酸與甲酰胺的混合物的容器中，同時保持溫度≤34℃。

在沉淀步驟中，將乙醇-水混合物泵送到硫酸葡萄糖混合物中，攪拌所述混合物。將混合物在用鹽水冷卻的情況下放置過夜。第二天，去除頂層相，上清液(乙醇相)。將下層相用乙醇洗滌，攪拌，放置沉淀，除去上清液。將該方法進行5次。用鹽水進行冷卻，加入氫氧化鈉至ph為9.5。在第二和第四沉淀步驟后，用水溶解沉淀物。在第三次沉淀步驟后，在水和任選地磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉中溶解沉淀物。用無水乙醇進行第五沉淀步驟。在用鹽水或冷卻水(約10℃)冷卻下，將硫酸葡聚糖混合物泵送通過過濾器至乙醇容器。用純凈水漂洗泵，攪拌，并留下沉淀。將乙醇上清液移至罐中，并在攪拌下將無水乙醇添加至產(chǎn)物中?；旌衔镉美鋮s水冷卻。

上述沉淀方法是根據(jù)實施方案的硫酸葡聚糖的生產(chǎn)中的優(yōu)選方法。然而，沉淀方法的變型是可能的，諸如減少或增加沉淀步驟的數(shù)量。雖然乙醇是沉淀方法中使用的優(yōu)選醇，但也可使用其它醇，諸如甲醇。

在離心步驟中，將混合物移至離心機。離心后，取出離心液。將它置于內(nèi)襯雙重塑料袋的塑料容器內(nèi)。將離心分離物溶于乙醇中。然后再次離心，在離心機中用乙醇洗滌離心物。

將離心分離物置于laf5中的過濾器蓋的燒杯中，然后將燒杯置于真空干燥箱中。干燥后，將硫酸葡聚糖粉末通過710μm篩子進入內(nèi)襯pe袋的塑料容器中。

為了產(chǎn)生10-13kg的實施方案的約硫酸葡聚糖，通常使用以下材料和量。

產(chǎn)物

合成過程中的主要反應(yīng)：

(c6h10o6)n+nh2coh→(c6h10o6)n....nh2coh

(h3n⁺coh+clso3-)+(c6h10o6)n....nh2coh→(c6h10o6)n-so3-+h3n+coh+cl-

(c6h10o6)n-so3-+h3n⁺coh+na⁺oh-→(c6h10o6)n-so3-na⁺+nh2coh+na⁺

→(h2o+c2h5oh)→(c6h10o6)n-so3-na⁺

(c6h10o6)n-so3-na⁺+na2hpo4+nah2po4→(c6h10o6)n-so3-na⁺+po4²-

實施方案的另一方面涉及用作藥劑的根據(jù)實施方案的硫酸葡聚糖。

實施方案的另外方面涉及根據(jù)實施方案的硫酸葡聚糖，所述硫酸葡聚糖用于不同醫(yī)學應(yīng)用，包括用于將祖細胞和/或干細胞動員至受試者的外周血中，包括動員造血干細胞(hsc)和/或間充質(zhì)干細胞(msc)；用于將目標白細胞，特別是淋巴細胞動員至受試者的血流中；用于減少受試者中靜脈內(nèi)注射的細胞的肺吸收；用于誘導受試者中的肝細胞生長因子(hgf)，以及用作抗凝血藥。根據(jù)實施方案的硫酸葡聚糖還適用于治療、抑制或預防各種脫髓鞘疾病，包括cns脫髓鞘疾病，諸如髓鞘纖維性疾病(myelinoclasticdisorders)，例如多發(fā)性硬化癥(ms)和德維克氏病(devic’sdisease)、急性播散性腦脊髓炎(adem)、白細胞營養(yǎng)障礙(leukodystrophicdisorders)，例如cns神經(jīng)病、腦橋中央髓鞘溶解癥、脊髓病、腦白質(zhì)病和腦白營養(yǎng)不良，以及外周脫髓鞘疾病諸如格林-巴利綜合征(guillain-barrésyndrome)、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病和周圍神經(jīng)病變。

實施方案的硫酸葡聚糖還可用于治療，抑制和/或預防器官、組織以及特別是細胞植入物(諸如蘭格爾翰斯島(isletsoflangerhans))的即時血液介導的炎癥反應(yīng)(ibmir)和移植排斥反應(yīng)。

優(yōu)選通過注射向受試者施用實施方案的硫酸葡聚糖或其藥學上可接受的鹽，特別是通過靜脈內(nèi)(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射或(i.p.)腹膜內(nèi)注射，優(yōu)選i.v.或s.c.注射來施用?？梢允褂玫钠渌c胃外施用途徑包括肌內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)注射。

優(yōu)選用選擇的溶劑或賦形劑將實施方案的硫酸葡聚糖或其藥學上可接受的鹽配制為注射用水溶液。溶劑有利地是水性溶劑，特別是緩沖液。此類緩沖液的非限制性實例是檸檬酸緩沖液，諸如檸檬酸一水合物(cam)緩沖液或磷酸鹽緩沖液。例如，可將實施方案的硫酸葡聚糖溶解在鹽水諸如0.9％nacl鹽水中，然后任選地用75mmcam緩沖，并使用氫氧化鈉將ph調(diào)節(jié)至約5.9。非緩沖液也是可能的，包括水性注射液，諸如鹽水，即nacl(水性的)。此外，如果需要緩沖液，則可使用除cam或磷酸鹽緩沖液外的其它緩沖系統(tǒng)。

實施方案不限于注射，可替代地使用其它施用途徑，包括口服、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、經(jīng)直腸、經(jīng)皮膚、經(jīng)氣管、經(jīng)支氣管或局部途徑。然后用基于特定施用途徑選擇的合適的賦形劑或載體配制活性化合物硫酸葡聚糖。

實施方案的硫酸葡聚糖的合適劑量范圍可根據(jù)受試者的大小和體重，受治療者的狀況以及其它考慮而變化。特別是對于人受試者，可能的劑量范圍可以是1μg/kg體重至150mg/kg體重，優(yōu)選10μg/kg體重至100mg/kg體重。

在優(yōu)選實施方案中，將硫酸葡聚糖或其藥學上可接受的衍生物配制來以在0.05至50mg/kg受試者體重，優(yōu)選0.1至40mg/kg受試者體重，更優(yōu)選為0.1至30mg/kg或0.1至15mg/kg受試者體重的范圍內(nèi)的劑量施用。

硫酸葡聚糖或其藥學上可接受的鹽的施用不一定限于治療目前的醫(yī)療狀況，而是可以替代地或另外用于預防。

實施方案的硫酸葡聚糖可以在單一施用場合諸如以單次推注的形式施用。這種推注劑量可被相當快速地注射至患者體內(nèi)，但有利地隨時間輸注，以使得硫酸葡聚糖溶液在數(shù)分鐘的時間內(nèi)(諸如在5至10分鐘內(nèi))輸注至患者。

或者，可在治療期間多次，即至少兩次施用實施方案的硫酸葡聚糖。通常地，對于急性疾病，治療期的持續(xù)時間可以是單次施用，但優(yōu)選在例如一周、數(shù)周或一個月的治療期間以多次給藥的形式存在。長達三個月甚至一年的更長的治療期可進一步改善治愈和康復。

受試者是動物受試者，優(yōu)選哺乳動物受試者，更優(yōu)選人受試者。

實驗

葡聚糖和硫酸葡聚糖的表征

主要研究目的是表征新型硫酸葡聚糖，并比較所述硫酸葡聚糖與其它類似硫酸葡萄糖分子之間的物理和化學差異。

nmr光譜

在進行的nmr實驗中使用配備有5mm¹h/¹³c/¹⁵n三重共振探針的500mhzvarianinova光譜儀。使用標準版本的具有對應(yīng)于200毫秒混合時間的絕熱自旋鎖的1d¹h、2d¹h梯度-cosy(相關(guān)光譜)、¹h-¹³chsqc(異核單量子相干光譜)、¹h-¹³chmbc(異核多鍵相關(guān)光譜)和2d¹h-¹hroesy(旋轉(zhuǎn)框架核歐沃豪斯效應(yīng)光譜)來記錄以下類型的光譜。將配備有5mm¹h/¹³c可切換梯度探頭(¹³c內(nèi)圈)的400mhzvarianinova光譜儀用于記錄1d¹³c光譜。在室溫(25℃)下記錄光譜。使用60秒的掃描之間的總弛豫延遲、利用3秒的采集時間和14.5ppm的光譜寬度，獲得了定量1d¹hnmr譜。將殘余hdo信號在¹h維度中以4.75ppm為參考，而在¹³c維度中使用間接化學位移參考(通過使用¹³c和¹h的旋磁比)。

用mestrenova9.0.0處理和分析所有nmr譜。使用1hz洛倫茲線增寬和基線校正(自動whitaker或3階多項式函數(shù))進行1d¹h譜的處理。使用以下區(qū)域作為各種結(jié)構(gòu)元素的報告子，使用1d譜的mestrenova的“峰模式”進行積分：

將2dhsqc譜在兩個維度中經(jīng)歷純正弦方波函數(shù)，并對選擇的矩形光譜區(qū)域(見圖5)進行積分。

nmr化學品和材料

實驗驗證

為了評估基于nmr的端基測定的性能，使用用于完全定量分析的參數(shù)集(60秒的再循環(huán)延遲)對一組商購可得的葡聚糖分子量標準物進行1d¹hnmr實驗。值得注意的是，葡聚糖標準物通常也被用作用于硫酸葡聚糖的分子大小測定的標準物，因為市場上無硫酸葡聚糖分子大小標準物可售。

從腸膜明串珠菌獲得的葡聚糖標準物1000(產(chǎn)品編號31416，fluka，批號bcbm6794v，cas號9004-54-0)；用于gpc的分析標準物，mw1000da。

從腸膜明串珠菌獲得的葡聚糖標準物5000(產(chǎn)品編號31417，fluka，批號bcbl9398v，cas號9004-54-0)；用于gpc的分析標準物，mw5000da。

從腸膜明串珠菌獲得的葡聚糖標準物12000(產(chǎn)品編號31418，fluka，批號bcbn0032v，cas號9004-54-0)；用于gpc的分析標準物，mw12000da。

下表1將從nmr光譜測量獲得的mn值(以da計)與從供應(yīng)商獲得的mn值進行比較。該表還列出了從供應(yīng)商獲得的mw和mp值(以da計)。

表1–用于葡聚糖標準物的分子量參數(shù)

mn值之間存在良好的一致性，如使用nmr光譜利用從供應(yīng)商獲得的數(shù)據(jù)測量的。對于所述三種葡萄糖標準物，如通過nmr光譜測量的mn值分別對應(yīng)于6.4個、17.4個和49.9個葡萄糖單元。

葡聚糖原料的nmr表征

對用于產(chǎn)生實施方案的硫酸葡聚糖的葡聚糖原料進行nmr光譜研究。葡聚糖(pharmacosmos，葡聚糖1，批號345349)由來自腸膜明串珠菌b512f的酶葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)生。

在d2o中制備葡聚糖的nmr樣品，并通過2d¹h/¹³cnmr光譜進行詳細分析。從在25℃下于d2o中獲得的一組2dnmr譜獲得幾乎完整的¹h/¹³c化學位移分配，參見表2。結(jié)果表明，葡聚糖基本上是無支鏈的，即幾乎完全由通過α-(1→6)-糖苷鍵連接在一起的葡萄糖環(huán)組成。未能觀察到α-(1→3)-糖苷分支，這意味著任何此類分支都低于0.5％。此外，所述數(shù)據(jù)顯示，總分支<1％，包括α-(1→2)-、α-(1→3)-和α-(1→4)-支化。

表2-葡聚糖1(25℃，d2o)的¹h和¹³c化學位移分配

值得注意的是，具有游離異頭碳(c1末端環(huán))的末端葡萄糖環(huán)以α-構(gòu)型(42％)和β-構(gòu)型(58％)存在(如基于觀察到的¹h/¹³c化學位移)。使用1d¹h譜中的各種h1基團的積分值，將每個葡聚糖分子中的平均葡萄糖單元數(shù)測定為5.1個葡萄糖單元，并且平均分子量被測定為852da。支化度被測定為小于1％。圖1舉例說明聚焦在具有葡聚糖信號的區(qū)域上的1d¹h譜的擴展。

硫酸葡聚糖的nmr表征

在本研究中，已將實施方案的硫酸葡聚糖的3個批次(批號1、2和3)與以下從tdbconsultancy獲得的3種硫酸葡聚糖產(chǎn)物進行了比較：硫酸葡聚糖5ls(產(chǎn)品編號db005，批號20288，低硫酸化，分子量5kda)、硫酸葡聚糖5hs(產(chǎn)品編號db004，批號20281和20300，高硫酸化，分子量5kda)和硫酸葡聚糖3(批號20341，高硫酸化，分子量3kda)。

nmr樣品

一般nmr評論

硫酸葡聚糖由具有各種硫酸化模式、支化和大小以及端基構(gòu)型和化學差異的相似但不相同的分子的分布組成。這導致了挑戰(zhàn)性的結(jié)構(gòu)分析。硫酸葡聚糖的nmr譜是復雜的，見圖2，該圖舉例說明了葡聚糖原料與硫酸葡聚糖的1d¹hnmr譜的比較。因此，盡管與定量1d¹hnmr技術(shù)相比，2dnmr的定量性能通常不太準確和精確，但也可能必需使用2d譜的定量數(shù)據(jù)。

幾乎不存在關(guān)于該主題的nmr出版物(neville等，j.pharm.sci.,80(3):239-244(1991)和ludwig-baxter等，j.pharm.sci.,80(7):655-660(1991))。在硫酸化的葡萄糖中，¹h化學位移通常隨著至每個引入的硫酸根基團的距離而逐漸向低場移動(較高的化學位移)。另一方面，¹³c化學位移表現(xiàn)不同，且效應(yīng)取決于碳與硫酸根基團之間的共價鍵數(shù)。如果硫酸根與此碳相連，則碳的¹³c化學位移將增加4-10ppm，而如果硫酸根與相鄰的碳結(jié)合，則化學位移效應(yīng)較小但相反。對于連接至更遠的碳的硫酸根基團，效應(yīng)通常很小。預期支化后具有對¹³c化學位移的相似效應(yīng)?？傊?sup>13c化學位移是更有用的報告子，因為它們主要取決于局部幾何形狀，諸如二面角以及附近共價結(jié)合的原子類型(通常相隔2-4個鍵)。

端基表征

與葡聚糖相比，硫酸葡聚糖的nmr譜更復雜，因為對于硫酸化/非硫酸化的c2、c3和c4以及c1和c6端基的所有組合，源自各種化學環(huán)境的nmr信號數(shù)量顯著增加。

即使c1端基因例如β-構(gòu)型中的硫酸化的c1與無硫酸化的c2的非端基c1的峰之間的重疊而被復雜化，但因光譜特征，c1端基(游離異頭碳)比c6端基更容易分析。位于1h譜的c1區(qū)中的大的殘留水信號也使分析復雜化。

圖3舉例說明覆蓋有葡聚糖原料(葡聚糖1)的相應(yīng)譜的批號1的硫酸葡聚糖在25℃下的2d¹³c-¹hhsqc譜。該圖舉例說明了每個h1/c1基團至特定硫酸化狀態(tài)的暫時分配。該圖指示屬于c1-末端葡萄糖單元的峰和屬于豐富的中間和c6-末端葡萄糖環(huán)的峰。忽略因c6-末端葡萄糖環(huán)中的c6的可能硫酸化而產(chǎn)生的效應(yīng)。

圖4舉例說明來自批號3的硫酸葡聚糖在25℃下的1d¹hnmr譜。該圖舉例說明每個h1峰至特定硫酸化狀態(tài)的暫時分配。該圖指示屬于c1-末端葡萄糖單元的峰和屬于豐富的中間和c6-末端葡萄糖環(huán)的峰。特別地關(guān)于c3和c4的硫酸化的分配是暫時的，并且忽略了因c6-末端葡萄糖環(huán)中的c6的可能硫酸化而產(chǎn)生的那些效應(yīng)。

圖6舉例說明來自批號1-3的硫酸葡聚糖在25℃下的1d¹hnmr譜中的硫酸葡聚糖區(qū)域的比較。

除低硫酸化的硫酸葡聚糖外的所有tdb樣品都在c1-末端被修飾。c1的¹³cnmr化學位移約為74-80ppm。這表明修飾必須涉及羥基的取代，并且取代基團不經(jīng)由氧結(jié)合。因此，該c1-修飾不是硫酸根或磷酸根，其也不能為從化學位移考慮的氯。

表3-c1端基特征

支化

數(shù)據(jù)不排除在硫酸葡聚糖樣品中存在葡聚糖支化。然而，如果存在任何這此類支化，則其處于非常低的水平，<1-2％。

硫酸葡聚糖的硫酸化度和其它化學修飾的程度

已經(jīng)主要使補充有1d¹hnmr數(shù)據(jù)的2d¹h-¹³chsqc數(shù)據(jù)測定硫酸化。對于c2、c3和c4的總硫酸化程度，可從¹h-¹³chsqc譜中2d峰的積分獲得估計值。使用c1峰作為這三個鄰居的報告子，從組合的1d和2d數(shù)據(jù)估計平均各個c2和c3硫酸根水平。c4的硫酸化不能被測定，但通過使用總體c2-c4硫酸化的數(shù)據(jù)，c4硫酸化的平均程度必須低得多，絕對<70％。

表4-硫酸葡聚糖的硫酸化程度

*因經(jīng)修飾的c1末端而未被測定。

由于光譜重疊，僅預防作為精確積分的估計值

γ以每個c2-c4單元的硫酸根的百分比和總數(shù)給出

除了c2-c4硫酸化的研究之外，端基的硫酸化程度的表征也概述于上表4中。值得注意的是，如果存在端基β-c1，則硫酸化度高得多，與平伏位置處的硫酸根的空間位阻較小一致。

請注意，α-和β-構(gòu)型經(jīng)由開放醛狀態(tài)處于平衡狀態(tài)，然而，這不容易被觀察到，但始終處于非常低的水平。

分子量和大小

被研究的各批次硫酸葡聚糖的所有分析證書將mw報告為分子大小量度。另外，已測定了關(guān)于硫酸葡聚糖批號1-3的光散射數(shù)據(jù)(見附錄1)，報告了mw和mn。目前的nmr數(shù)據(jù)主要基于端基分析(即端基的峰面積對比中間基團的峰面積(nmr峰面積)之間的比率)提供mn作為輸出。測定葡聚糖原料上的葡萄糖單元的平均數(shù)，并所述平均數(shù)經(jīng)證實與相應(yīng)的硫酸葡萄糖批次的nmr數(shù)據(jù)完全一致。

表5-硫酸葡聚糖樣品的以da表示的分子大小特征

硫酸葡聚糖樣品(硫酸葡聚糖3除外)的數(shù)據(jù)與每個硫酸葡聚糖分子～5個葡萄糖單元的平均分子大小完全一致。

表6-來自不同技術(shù)的以da表示的分子量數(shù)據(jù)的比較

已使用sec獲得mw(分析證書)

如通過nmr測定的分子量參數(shù)與表6中所列的另外的分子量參數(shù)之間的這種巨大差異可以通過硫酸葡聚糖的分子量通常使用更間接的方法(如凝膠排阻/滲透色譜法、光散射或粘度)進行測定來解釋。所有這些方法反而報告了分子大小。這意味著如果硫酸葡聚糖分子形成各種聚集體或復合物，則更高的表觀分子量被測定。

這些間接方法反而報告了分子體積和形狀，所述分子體積和形狀可能不僅在批次間而且還在同一批次內(nèi)的樣品間顯著不同，這取決于例如硫酸葡聚糖材料是被如何儲存的，其在測量之前是如何制備的等。

硫酸葡聚糖的深入結(jié)構(gòu)表征

基于對硫酸葡聚糖批次3獲得的一組1d和2dnmr數(shù)據(jù)的全面分析，進行嚴肅的嘗試以進一步在原子分辨率下理解該硫酸葡聚糖樣品的硫酸化模式。鑒于硫酸葡聚糖批次1和2的1d¹h和2d¹³c-1hhsqc譜的密切相似性，假定該部分中呈現(xiàn)的結(jié)果對于實施方案的硫酸葡聚糖批次是有效的。

總硫酸化程度和樣品組成

從概述的角度出發(fā)，¹³c-¹hhsqc譜允許測定硫酸化程度的相對準確的估值，見圖7。硫酸葡聚糖批號3在c2、c3和c4位置處具有每個葡萄糖單元平均2.4±0.1個硫酸根基團。圖7的每個峰對應(yīng)于具有不同化學環(huán)境的c-h鍵。峰面積大致對應(yīng)于每個c-h鍵的群體。觀察到三個不同的區(qū)域，這使得能夠定量葡聚糖硫酸化的總體程度。在頂部，1d¹h譜的相應(yīng)區(qū)域被對齊。

使用每個葡萄糖單元2.66個硫酸根和5.1個葡萄糖單元的平均值，假定樣品由100％硫酸葡聚糖組成，硫的計算重量％為約19％。

c2、c3和c4處的硫酸化的研究

由于高度重疊的區(qū)域，幾乎完全使用位于不同種類的葡萄糖單元的h1/c1基團的¹h/¹³c化學位移和相應(yīng)的峰面積研究硫酸化模式。基于葡聚糖的¹h/¹³c化學位移分配、文獻數(shù)據(jù)，特別是基于獲得的2dnmr數(shù)據(jù)，將h1/c1信號暫時分配給具有各種化學環(huán)境和硫酸化程度的特定c1基團。該分配描繪于圖3和圖4中。

基于1d¹h峰和相關(guān)峰積分的分配和測量，c1-末端葡萄糖的異頭c1-基團的構(gòu)型群體似乎已移至更相等的0.49:0.51比率(對于α:β構(gòu)型而言)，從而假定葡聚糖本身的平均長度在進行化學硫酸化程序后未曾改變。游離α-c1基團被硫酸化至～30％，而β-c1的硫酸化程度經(jīng)估計明顯高于83％和為約83％。

關(guān)于測定c2、c3和c4的硫酸化程度，對于絕對高度硫酸化(>95％)的c2來說，分析是最容易的，并且假定正確地估計了c1-末端葡萄糖的α:β構(gòu)型的比率，硫酸化度計算為～99％。對于參與α(1→6)糖苷鍵的葡萄糖單元c1(即中間和c6-末端環(huán)以及具有游離c1的c1-末端葡萄糖單元)，c3被硫酸化至82％。對于具有硫酸化c1的c1-末端葡萄糖單元，c3的硫酸化似乎較高，～86％。每個c4的硫酸根數(shù)量的計算更為困難，但通過使用每個葡萄糖環(huán)2.4個硫酸根的總體比率和c2的99％的硫酸化、c3的82％的硫酸化，硫酸化程度估計為～60％。

來自meito的葡聚糖和硫酸葡聚糖的nmr表征

使用先前建立的用于葡聚糖和硫酸葡聚糖樣品的結(jié)構(gòu)表征的1d¹h和2d¹³c-¹hhsqcnmr方法，研究了從meitosangyoco.,ltd.獲得的葡聚糖和硫酸葡聚糖樣品。

nmr樣品

pn004-99-04通過將43.4mg來自meitosangyoco.,ltd.的葡聚糖(批號tl-2385)溶解在520μld2o中來制備nmr樣品。

pn004-99-05通過將58.7mg來自meitosangyoco.,ltd.的硫酸葡聚糖(批號n-3188)溶解在520μld2o中來制備nmr樣品。

nmr結(jié)果

葡聚糖中的葡萄糖單元的平均數(shù)被測定為11.7，mn為1920da。硫酸葡聚糖的硫18(sulfur18)的mn經(jīng)測定在4120da至4200da內(nèi)(不包括任何鈉抗衡離子)，以及在4710da至4790da內(nèi)(具有鈉抗衡離子)。α-構(gòu)型中的c1端基的程度為59％，且支化程度估計為4.8％。

位置c2-c4的硫酸化程度經(jīng)測定為76％(每個葡萄糖單元2.29個硫酸根基團)。c2位置的硫酸化程度估計為93％。α-構(gòu)型中c1端基的程度為71％，且α-c1端基的硫酸化程度為83％。β-構(gòu)型中的c1端基的硫酸化程度>90％。沒有檢測到除了硫酸化以外的c1端基的化學修飾。

不同硫酸葡聚糖分子的生物效應(yīng)的比較

本研究比較了不同硫酸葡聚糖分子的各種生物效應(yīng)，表明了本實施方案的硫酸葡聚糖具有優(yōu)異的生物效應(yīng)并且是無毒的。

關(guān)于具有不同平均分子量的分子量硫酸葡聚糖對造血細胞的動員的比較

動物

將雌性dba/2oia小鼠(harlan，holland)保存在烏普薩拉大學(uppsalauniversity)的動物設(shè)施中，在標準條件下飼養(yǎng)，并隨意提供食物和水。使用重為17-22g的動物。

實驗設(shè)計

將dba/2-雌性分為4組：1)媒介物(nacl水溶液)(n＝8)，2)50mg/kg硫酸葡聚糖3，ds3，(n＝5)，3)50mg/kg硫酸葡聚糖批號3(n＝5)和4)50mg/kg硫酸葡聚糖批號3，pnb，(n＝5)。組4)用戊巴比妥鈉(pnb)替代異氟烷來進行鎮(zhèn)靜，以評價麻醉方案的變化是否影響動員。

物質(zhì)的施用

將實施方案(批號3)的硫酸葡聚糖和硫酸葡聚糖3(tdbconsultancy，批號20341，ds3)溶解在0.9％nacl(freseniuskabi)中至20mg/ml，并通過20μm過濾器過濾以獲得無菌溶液。動物通過尾靜脈靜脈內(nèi)接受2.5ml/kg(施加50μl)。

血液學分析

結(jié)果示于圖8和表7中。硫酸葡聚糖3在整個wbc或淋巴細胞中沒有顯示任何顯著的改變，然而報告了中性粒細胞的略微減少。

表7-硫酸葡聚糖物質(zhì)施用后的外周血中的血液學變量

mvc＝平均紅細胞體積；mchc＝平均血細胞血紅蛋白濃度

相校于媒介物(nacl)的血液學變量：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

硫酸葡聚糖3沒有誘導cfc數(shù)量的顯著增加，如圖9所示。硫酸葡聚糖批號3誘導hgf的顯著增加，這與麻醉的使用無關(guān)，而較低分子量的物質(zhì)3未顯示hgf的顯著增加，見圖10。本文提供的數(shù)據(jù)表明，相較于實施方案的硫酸葡聚糖，硫酸葡聚糖3是較差的動員劑。硫酸葡聚糖3未使hgf增加至超過媒介物的任何程度。

分子量硫酸葡聚糖在mog1-125誘導的慢性eae中的預防性治療的比較

本研究的目的是比較實施方案的硫酸葡聚糖(批號3)與硫酸葡聚糖5hs(tdbconsultancy，批號20300)在mog1-125誘導的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(eae)中的預防性治療效果。

動物

所有動物實驗均按照美國國立衛(wèi)生研究院(nationalinstituteofhealth,nih)實驗動物護理和使用指南進行，并經(jīng)芬蘭國家動物實驗委員會(finnishnationalanimalexperimentboard)批準。在實驗中使用了總共90只雌性darkagouti大鼠(體重為120-170g，購自harlanlaboratories,uk)。將動物在標準溫度(22±1℃)下和輕度受控的環(huán)境(從上午7點至晚上8點照明)中圈養(yǎng)，隨意獲得食物(harlan2016)和水。動物分組如下：

組1：15只eae大鼠,在mogeae接種后第0天開始用媒介物(鹽水)s.c.處理(每日一次，每周3次)并按照給藥方案持續(xù)進行直至終點。

組2：15只eae大鼠，在接種后第0天開始用硫酸葡聚糖5hs(tdbconsultancy，批號20300)(30.0mg/kg)s.c.處理(每日一次，每周3次)并按照給藥方案持續(xù)進行直至終點。

組3：15只eae大鼠，在接種后第0天開始用根據(jù)實施方案的硫酸葡聚糖(批號3)(30.0mg/kg)s.c.處理(每日一次，每周3次)并按照給藥方案持續(xù)進行直至終點的eae大鼠。

eae的誘導和臨床評分

通過在尾部的基部皮內(nèi)施用100μl接種物誘導了eae。接種物由20μg用含有200μg熱滅活的結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)(菌株h37ra；difco,detroit,mi)的不完全弗氏佐劑(ifa)(sigmaf5506)(1:1)乳化的pbs(0.01m)中的重組mog1-125(nordicbiosite)組成。

每天進行臨床評分，持續(xù)36個研究日(從第0天開始，并持續(xù)至終點第35天)。在研究期間以盲法并根據(jù)下面所列的臨床評分原則進行臨床評分。

累積疾病指數(shù)(cdi)表示為研究過程中的累積疾病負擔，即臨床評分值的總和。疾病發(fā)作(do)表示首次觀察到eae的可見癥狀(臨床評分值≥0.5)時的研究日。

研究中的所有老鼠按照以下給藥方案在0和34天之間接受硫酸葡聚糖或相應(yīng)的媒介物：

組1每周三次(周一-周三-周五)在上午7-11點之間接受皮下(s.c.)施用的媒介物(鹽水，9mg/ml，baxter)。媒介物的給藥體積為5.0ml/kg。在誘導mogeae后第0天開始媒介物施用，并持續(xù)至研究第32天或研究第33天，這取決于接種的工作日和給藥方案。

組2每周三次(周一-周三-周五)在上午7-11點之間接受皮下(s.c.)施用的劑量為30.0mg/kg的硫酸葡聚糖5hs(tdbconsultancy，批號20300)。給藥體積為5.0ml/kg。在誘導mogeae后第0天開始施用，并持續(xù)至研究第32天或研究第33天，這取決于接種的工作日和給藥方案。

組3每周三次(周一-周三-周五)在上午7-11點之間接受皮下(s.c.)施用的劑量為30.0mg/kg的根據(jù)實施方案的硫酸葡聚糖(批號3)。給藥體積為5.0ml/kg。在誘導mogeae后第0天開始施用，并持續(xù)至研究第32天或研究第33天，這取決于接種的工作日和給藥方案。

終點組織和血漿收集

在終點時，在第35天，用戊巴比妥(60mg/ml,orionpharma)深度麻醉所有大鼠。之后，經(jīng)由心臟穿刺收集血液樣品。將總共800-1000μl血液收集至li-肝素微量管中，并在+4℃下以2000xg離心10分鐘。將兩個200μl的血漿等分試樣收集至兩個單獨的血漿收集基質(zhì)聚丙烯管中，在干冰上冷凍并在-80℃儲存直至用于進一步分析。

為了組織學樣品，用冷的肝素化(2.5iu/ml)鹽水經(jīng)心臟灌注大鼠10分鐘，然后用冷的4％的0.1m磷酸鹽緩沖液中的多聚甲醛灌注至少10分鐘。將小腦和腦的其余部分以及脊髓的c和t段(各1cm)切除，并通過在+4℃下浸入在4％的于0.1m磷酸緩沖液中的多聚甲醛中持續(xù)至少24小時來進行后固定。然后將樣品更換至含有0.001％疊氮化鈉(sigma)作為防腐劑的0.01mpbs中，在+4℃下儲存直至用于可能的組織學分析。

一般健康狀況和人道終點

實驗室人員每日進行兩次動物監(jiān)測(上午8點和下午4點)。如果動物的一般健康狀況明顯惡化，則通過過劑量的co2和頸部脫位來對大鼠實施安樂死。將安樂死的大鼠和被發(fā)現(xiàn)死亡的大鼠在死亡后盡可能快地進行肉眼檢查。當尸檢不及時時，將尸體在約4℃下冷藏，直至在charlesriverdrs,finland進行尸檢?？山邮艿慕K點的定義包括：在24小時觀察期間無自發(fā)運動和無法飲水或飲食、大量出血、自發(fā)性炎癥、缺失解剖學結(jié)構(gòu)、腫脹或腫瘤。

判斷大鼠安樂死的模型(eae)特異性終點包括：臨床評分達到4級(所有肢體部分無力或偏癱)、翻正反射>30秒和體重從基線下降超過25％。

統(tǒng)計分析

所有值均以平均值±標準偏差(sd)或平均值(sem)的標準誤差表示，且差異在p<0.05水平上被認為是統(tǒng)計學上顯著的。通過使用statsdirect統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。通過使用單因素方差分析，然后進行dunnet檢驗(與媒介物處理組比較)分析平均值之間的差異。用kruskal-wallisanova(組間)分析非參數(shù)數(shù)據(jù)。

體重

每天從第0天開始監(jiān)測大鼠的體重，并持續(xù)至終點第35天。在研究期間，組2和3中的所有大鼠獲得與媒介物組1相似的體重(p>0.05)。

疾病發(fā)病率和生存率

對于研究中的所有大鼠，各組的死亡率如下：

組1：40％(6/15)；

組2：20％(4/15)；和

組3：7％(1/15)。

累積疾病指數(shù)

累積疾病指數(shù)(cdi)表示36天期間的臨床評分值的總和；從接種第0天至終點第35天。高指數(shù)值代表晚期疾病，而低指數(shù)值表示輕度癥狀。

皮下施用的硫酸葡聚糖化合物和媒介物對累積疾病指數(shù)的影響示于圖11中。媒介物組動物(組1)與組2之間的累積疾病指數(shù)無顯著差異。然而，與媒介物相比，組3中的硫酸葡聚糖處理使平均cdi降低31％。

因此，根據(jù)實施方案的硫酸葡聚糖(批號3)相較于具有eae的受試者的硫酸葡聚糖5hs具有如通過cdi評估的改善的生物效應(yīng)。

eae是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的炎性脫髓鞘疾病的動物模型。其作為人cns脫髓鞘疾病(包括多發(fā)性硬化癥(ms)和急性播散性腦脊髓炎(adem))的動物模型而被廣泛研究。因此，實施方案的硫酸葡聚糖似乎在治療或至少減少ms和adem的癥狀方面具有有益作用。

硫酸葡萄糖分子之間的毒性比較

在2周觀察期期間評價通過i.v.注射施用的單劑量硫酸葡聚糖對spraque-dawley大鼠的毒性。這些實驗中使用的媒介物是75mm的于0.9％nacl中的cam。

在本研究中，通過以劑量水平70和140mg/kg單次推注注射給雄性spraguedawley大鼠提供實施方案的硫酸葡聚糖(批號3)和由meitosangyoco.,ltd.產(chǎn)生的硫酸葡聚糖(ds-18)(批號n-3188和n-3190)，觀察期為14天。該研究總共包括如下7個組：一個對照；ds-s18，批號n-3188；ds-s18，批號n-3190；以及硫酸葡聚糖批號3，見表8。除了硫酸葡聚糖批號3，70mg/kg(其中包括10只動物)外，每個劑量組包括五只動物。對來自研究中的所有動物的肺和對用硫酸葡聚糖批號3處理的組中的選定器官(腎上腺、具有骨髓的股骨、心臟、腎、肝、腸系膜淋巴結(jié)、脾、胸腺和注射部位)進行病理學研究。

表8-實驗設(shè)計

研究中沒有發(fā)生死亡。在給藥當天(第1天)，在所有組中在給藥后約10分鐘，接受硫酸葡聚糖的動物顯示呼吸困難，具有一定程度的劑量關(guān)系。在被給予140mg/kg的動物中觀察到最高的發(fā)病率。除接受140mg/kgds-s18(批次n-3188)的那些動物(其中在5只動物的4只中顯示中度呼吸困難)外，在大多數(shù)動物中觀察到的嚴重性是輕微的。在剩余觀察期(第2-15天)期間，大多數(shù)被給予140mg/kgds-s18的動物(兩個批次)顯示呼吸困難。一只被給予硫酸葡聚糖批號3的動物在第6-15天顯示呼吸困難。

在組織學檢查中，在肺中觀察到用測試化合物給藥的動物中的處理相關(guān)變化，并且該變化由肺泡組織細胞增多和肺泡間隔增厚/增加的細胞結(jié)構(gòu)(cellularity)組成。在接受140mg/kg的兩批測試化合物ds-s18的大多數(shù)動物中注意到這些變化的發(fā)生率和嚴重性增加。10只接受70mg/kg的硫酸葡聚糖批次3的動物中只有1只單個動物顯示最小的變化，且接受140mg/kg的5只動物中有3只顯示最小至中度的發(fā)現(xiàn)。除了肺部發(fā)現(xiàn)以外，還在所有劑量組中在脾中均注意到髓外血細胞生成的程度略有上升，然而這被認為具有問題的毒理學意義。

表9–經(jīng)處理的動物的肺中的微觀變化的發(fā)生率和嚴重性

在本研究中測試的化合物中，硫酸葡聚糖批號3顯示不如ds-18顯著的肺毒性。

來自sigma-aldrich的硫酸葡聚糖的nmr分析

已使用1d1h和2d13c-1hhsqcnmr光譜測定了來自sigma-aldrich(產(chǎn)品編號31404)的硫酸葡聚糖鈉鹽(dss)的結(jié)構(gòu)特征。來自sigma-aldrich的關(guān)于硫酸葡聚糖(產(chǎn)品編號31404)的分析證書指示5000da的分子量(mr)，并且平均硫含量為17％，這相當于每個葡糖基殘基約2.3個硫酸根基團。

通過將35.9mg來自sigma-aldrich(產(chǎn)品編號31404)的硫酸葡聚糖溶解在510μld2o中來制備nmr樣品。

結(jié)果

葡萄糖單元數(shù)：26-50個

mn：8600-16900da

α-構(gòu)型中的c1的程度：未測定但>50％(α-構(gòu)型>>β-構(gòu)型)

硫酸化的c2-c4的程度：74％

硫酸化的α-c1端基的程度：49％

硫酸化的β-c1端基的程度：未測定

測定硫酸葡聚糖分子中的葡萄糖單元數(shù)的最精確方法是同時分析用作硫酸葡聚糖生產(chǎn)原料的相應(yīng)葡聚糖。由于沒有關(guān)于相應(yīng)葡聚糖的nmr數(shù)據(jù)，2d13c-1hhsqc光譜中的4.8-5.2ppm的區(qū)域中的光譜重疊(見圖14)阻止β-端差異構(gòu)體構(gòu)型中的級分端基c1以及硫酸化的β-c1端基的程度的定量。圖13舉例說明來自sigmaaldrich的硫酸葡聚糖(產(chǎn)品編號31404)的1d¹hnmr譜。

因此，將樣品硫酸葡聚糖(產(chǎn)品編號31404)中計算的葡萄糖單元數(shù)量作為區(qū)間報告，其中α-構(gòu)型中的末端c1的程度在50％至100％的范圍內(nèi)。2d¹³c-¹hhsqc譜數(shù)據(jù)在β-c1端基的預期區(qū)域中未顯示任何信號，表明葡萄糖單元的數(shù)量位于所報告區(qū)間的上部。

討論

nmr結(jié)果表明，來自sigma-aldrich(產(chǎn)品編號31404)的分子量為mr5000da的硫酸葡萄聚糖的分子量實際上具有如通過nmr光譜測量的在8600da至16900da的區(qū)間內(nèi)的數(shù)均分子量mn。

來自不同制造商的硫酸葡聚糖的功能測試

本研究的目的是研究和比較來自不同制造商的硫酸葡聚糖在離體人測定中對活化部分凝血活酶時間(aptt)的功能影響。

aptt是表征血液凝固的醫(yī)學測試。除了檢測血液凝固中的異常之外，其也是接觸激活途徑和共同凝血途徑的功效的性能指標。

方法和設(shè)備

根據(jù)制造商的說明，使用diagnosticastago的4在人血漿中測量aptt。將硫酸葡聚糖在初始ph為5.9的75mm檸檬酸鹽緩沖液中溶解至1mg/ml，然后添加至人血漿中至10μg/ml的最終硫酸葡聚糖濃度。

分析來自meitosangyoco.,ltd.,japan的4個不同硫酸葡聚糖批次(n-3178、n-3179、n-3180、n-3181)、來自sigma–aldrich,u.s.的一個硫酸葡聚糖批次(平均分子量5000da，產(chǎn)品編號31404)和根據(jù)實施方案的兩個硫酸葡聚糖批次(批號1和批號2)。從每個批次處理四個單獨稱重的樣品，并且對于這些樣品中的每一個樣品以一式兩份測量aptt。所有樣品處理均在同一天并行進行。在第二天，對所有樣品進行所有aptt測量以獲得可比較的結(jié)果。

在aptt分析中使用血漿而非全血使分析更加穩(wěn)健，并且結(jié)果變化較小。

結(jié)果

aptt分析的結(jié)果示于下表10中。aptt的基線是作為陰性對照測量的血漿。

表10-硫酸葡聚糖處理后血漿中的aptt

如對于根據(jù)實施方的硫酸葡聚糖和來自其它制造商的硫酸葡聚糖所測量的，aptt存在顯著差異。具體地，相較于根據(jù)實施方案的硫酸葡聚糖，來自sigma-aldrich的硫酸葡聚糖(5000da，產(chǎn)品編號31404)導致顯著更高的aptt。

上述實施方案將被理解為本發(fā)明的幾個說明性實例。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，可對實施方案進行各種修改、組合和改變。特別地，在技術(shù)上可能的情況下，可將不同實施方案中的不同部分解決方案組合在其它構(gòu)型中。然而，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求限定。

附錄1

在由agilent1260infinity系列hplc系統(tǒng)和連接的minidawntreos光散射檢測器(wyatttechnologies)組成的尺寸排阻色譜多角度激光散射(size-exclusionchromatographymultianglelaserlightscattering,sec-malls)系統(tǒng)上進行光散射實驗。在光散射實驗中使用以下分析參數(shù)：

·流量＝1.00ml/分鐘。

·柱/dri檢測器溫度＝40℃

·收集間隔＝0.5秒。

·注射體積＝10μl

·dn/dc＝0.1470ml/g

·malls波長＝656nm

·校準常數(shù)(malls)＝4.7303×10^-51/(vcm)

將硫酸葡聚糖樣品溶解在2ml0.1m硝酸鈉(nano3)中，以400ppm疊氮化鈉(nan3)作為流動相(洗脫劑)。