本申請對2014年6月20日提出于韓國專利局的韓國專利申請第10-2014-0075507號主張優(yōu)先權(quán)，上述申請的公開內(nèi)容作為參照插入于本說明書。本發(fā)明涉及包含具有抗菌及防腐活性的綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物的組合物及其的用途。
背景技術(shù)：
：眾所周知，對羥基苯甲酸酯作為主要例用于在化妝品、食品、藥品等中抑制微生物的生長且增加保存期間的殺菌防腐劑，一般不具有毒性，來從1920年中期第一次適用于藥品以來很長時間使用。對羥基苯甲酸酯的使用廣泛，并且在多種產(chǎn)品中長時間使用，相反，隨著報告對對羥基苯甲酸酯的雌激素性的研究，并提出對對羥基苯甲酸酯類的穩(wěn)定性問題?；趯?shí)驗(yàn)動物作為對象的多種分析結(jié)果進(jìn)行對對羥基苯甲酸酯的急性、亞急性及慢性毒性的研究，從而報告羥苯甲酯的皮膚炎癥反應(yīng)、對羥基苯甲酸甲基酯和對羥基苯甲酸丙基酯的延遲性、接觸性、過敏性誘發(fā)等致敏反應(yīng)，針對于對羥基苯甲酸酯的致癌性對羥基苯甲酸酯具有雌激素性，因此提出通過使用化妝品的對羥基苯甲酸酯和乳腺癌的關(guān)聯(lián)性。眾所周知，對羥基苯甲酸酯的抗雌激素性還妨礙雄性生殖類的功能，并且作為污水放出的對羥基苯甲酸酯對包括生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境產(chǎn)生的內(nèi)分泌障礙影響也討論過。雖然具有潛在性的有害性，但是在多種領(lǐng)域中持續(xù)使用對羥基苯甲酸酯，對上述問題分析為，原因在于天然成分的防腐力沒有現(xiàn)有化學(xué)合成防腐劑優(yōu)秀。但是，隨著報告在上述中涉及的對羥基苯甲酸酯的危險性，消費(fèi)者對使用對羥基苯甲酸酯防腐劑表示反感，當(dāng)前對替代天然保存劑的需求正增加。生物表面活性劑(biosurfactant)作為從如動物、植物等生物原材料取得的表面活性劑是低毒性，并且由生態(tài)系統(tǒng)分解容易，因此受到矚目。生物表面活性劑對化學(xué)合成表面活性劑具有的優(yōu)點(diǎn)如下：第一.無毒性且生物降解容易，因此在使用生物表面活性劑的情況下不成為二次污染源，第二.因利用現(xiàn)有方法難以合成的復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，可作為特殊的目的使用，第三.對表面張力、降低能力、溫度、pH的穩(wěn)定性等表面活性劑的物理·化學(xué)性能方面上，表現(xiàn)出與現(xiàn)有的化學(xué)合成表面活性劑幾乎相等的結(jié)果。實(shí)際生物表面活性劑在使用化學(xué)合成表面活性劑的食品、化妝品、洗滌劑、原油的二次回收、紙漿和造紙產(chǎn)業(yè)、陸上和海上的油類污染凈化、處理槽的乳脂肪分解等但部分的產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域中使用，并且還發(fā)表如下：從假單胞菌(Pseudomonassp.)生產(chǎn)的鼠李糖脂-生物表面活性劑通過改變細(xì)胞表面形態(tài)來發(fā)揮對病原菌的抑制效果，因此作為生物醫(yī)學(xué)的新的領(lǐng)域具有被嫁接的可能性。因此，在全世界上正活躍地進(jìn)行對具有如上所述的優(yōu)點(diǎn)的生物表面活性劑的研究，來報告多種類的生物表面活性劑。在本發(fā)明之前，從假單胞菌培養(yǎng)液提取包含鼠李糖脂的混合物狀態(tài)的生物表面活性劑，來測定對多種病原菌的抑制效果，其結(jié)果，確認(rèn)了與現(xiàn)有的抗生素相比，對特定病原菌(痤瘡誘發(fā)菌：痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))具有卓越的抑制效果。并且，確認(rèn)了與多種病原菌相比，在低濃度下具有殺菌效果，基于這種結(jié)果研究可替代現(xiàn)有的雖然作為化妝品防腐劑使用，但是報告對人體的的危險性的羥苯甲酯的環(huán)保且生物相容性的保存劑的開發(fā)，同時研究了通過抑制具有抗生素的耐性的痤瘡誘發(fā)菌來可緩和痤瘡的原料的開發(fā)，以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果可成為用于實(shí)施本發(fā)明的具體內(nèi)容及根據(jù)。本說明書全文中，參照了多篇論文及專利文獻(xiàn)，并表示了其引用。所引用的論文及專利文獻(xiàn)的公開內(nèi)容全部插入于本說明書作為參照，從而更加明確說明本發(fā)明所屬的
技術(shù)領(lǐng)域：
的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明人為了開發(fā)通過有效地抑制微生物的生長，來可增加化妝品或食品的儲存期間的來源于天然物質(zhì)的防腐用組合物而付出努力。其結(jié)果，提出綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)培養(yǎng)液提取物對各種細(xì)菌表現(xiàn)出抗菌效果，并確認(rèn)了本發(fā)明的綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物可替代合成對羥基苯甲酸酯類的化妝品防腐劑來用作化妝品防腐劑及食品防腐劑，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明的目的在于，提供包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物作為有效成分的防腐用組合物。本發(fā)明的再一目的在于，提供包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物作為有效成分的抗生組合物。本發(fā)明的再一目的在于，提供包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物作為有效成分的痤瘡預(yù)防或治療用組合物。本發(fā)明的另一目的在于，提供包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物作為有效成分的抗氧化用組合物。本發(fā)明的再一目的在于，揭示綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物的引起抗菌效果的有效成分。根據(jù)以下發(fā)明的詳細(xì)說明及發(fā)明要求保護(hù)范圍更加明確本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明提供包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物作為有效成分的防腐用組合物。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方式，本發(fā)明提供包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物作為有效成分的抗生組合物。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方式，本發(fā)明提供包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物作為有效成分的痤瘡預(yù)防或治療用組合物。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方式，本發(fā)明提供包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物作為有效成分的痤瘡預(yù)防或治療用組合物。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方式，本發(fā)明提供包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物作為有效成分的抗氧化用組合物。本發(fā)明人為了開發(fā)有效抑制微生物的生長來可增減化妝品或食品的儲存期間的來源于天然物質(zhì)的防腐用組合物而付出了努力。其結(jié)果，提出了對包含綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)培養(yǎng)液提取物的皮膚正常菌群及包含痤瘡誘發(fā)菌的各種細(xì)菌表現(xiàn)出抗菌效果，并確認(rèn)了本發(fā)明的綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物可替代合成對羥基苯甲酸酯類的化妝品防腐劑來用作化妝品防腐劑及食品防腐劑。本發(fā)明的組合物包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物作為有效成分。在本說明書中，術(shù)語“綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物”是指從培養(yǎng)綠膿桿菌的培養(yǎng)液提取而取得的綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物包含作為生物表面活性劑的鼠李糖脂(rhamnolipid)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，包含于本發(fā)明的組合物的鼠李糖脂為由以下化學(xué)式1表示的雙-鼠李糖脂或由化學(xué)式2表示的單-鼠李糖脂。化學(xué)式1化學(xué)式2根據(jù)本發(fā)明，在綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物中存在多種結(jié)構(gòu)的鼠李糖脂，其中，上述化學(xué)式1或化學(xué)式2的鼠李糖脂與在綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物中提取的其他鼠李糖脂相比具有顯著高的抗菌活性。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，本發(fā)明的綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物如下獲?。簩⒕G膿桿菌接種于培養(yǎng)基來培養(yǎng)之后，對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離來獲取上清液，在上清液中添加鹽酸溶液來進(jìn)行沉淀，然后重新進(jìn)行離心分離來僅獲取沉淀物，在其沉淀物中添加乙醚之后僅分離乙醚層進(jìn)行濃縮。本發(fā)明的提取物不僅包含利用上述的溶劑而取得的提取物，而且還包含在其中追加適用純化過程來取得的提取物。例如，使上述提取物通過具有規(guī)定的分子量截留值的超濾膜，來取得的分餾物，基于多種色譜法(為了基于大小、電荷、疏水性、親水性的分離而制作的)的分離等，通過追加進(jìn)行的多種純化方法取得的分餾物也包含于本發(fā)明的提取物。本發(fā)明的提取物可通過減壓蒸餾及冷凍干燥或噴霧干燥等追加過程制備成粉末狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在本發(fā)明的組合物中，相對于100重量份的總組合物，包含0.005～1.0重量份的上述綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)例，在本發(fā)明的組合物中，相對于100重量份的總組合物，包含0.01～0.5重量份的上述綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物。根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)例，在本發(fā)明的組合物中，相對于100重量份的總組合物，包含0.02～10.1重量份的上述綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，本發(fā)明的組合物具有抗細(xì)菌和/或抗真菌活性。本發(fā)明的組合物對多種微生物，尤其，對細(xì)菌、真菌及酵母表現(xiàn)出廣泛的抗生活性。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)例，本發(fā)明的組合物對選自由葡萄球菌(Staphylococcus)屬、芽孢桿菌(Bacillus)屬、綠膿桿菌(Pseudomonas)屬、念珠菌(Candida)屬、丙酸桿菌(Propionibacterium)屬、鏈球菌(Streptococcus)屬、變形桿菌(Proteus)屬、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬、腸球菌(Enterococcus)屬、克雷伯氏菌(Klebsiella)屬及大腸菌(Escherichiacoli)組成的一種以上的細(xì)菌表現(xiàn)出抗菌活性。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)例，本發(fā)明的組合物具有與在0.5％以上的濃度下具有抗氧化效果的作為代表成分的抗壞血酸(AA)相同的水平的高的抗氧化效果。如上所示，具有廣泛的抗生譜及抗氧化效果的本發(fā)明的防腐/抗生組合物不僅在化妝品，而且在食品、生活用品、農(nóng)藥、醫(yī)藥等中為了實(shí)現(xiàn)抗菌、殺菌、消毒、防腐等的目的可廣泛地使用。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的防腐用組合物可制備成化妝品組合物。在本發(fā)明的組合物制備成化妝品組合物的情況下，綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物預(yù)防由細(xì)菌化妝品組合物變質(zhì)，因此可替代化妝品防腐劑來使用。在本發(fā)明的組合物制備成化妝品組合物的情況下，本發(fā)明的組合物不僅包含作為上述有效成分的綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物、其的鹽或它們的溶劑化物或水化物，而且還可包括通常利用于化妝品組合物的成分，例如可包含抗氧化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、維生素、顏料及香料等的通常的助劑及載體。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的防腐用組合物可制備成食品組合物。在本發(fā)明的組合物制備成食品組合物的情況下，綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物預(yù)防由細(xì)菌食品變質(zhì)，因此可替代食品防腐劑來使用。在本發(fā)明的組合物制備成食品組合物的情況下，作為有效成分不僅包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物，還包含制備食品時通常所添加的成分，例如，包含蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、營養(yǎng)素、調(diào)味劑及香味劑。作為上述碳水化合物，例如有作為單糖的葡萄糖、果糖等、作為二糖的麥芽糖、蔗糖、寡糖等以及作為多糖的糊精、環(huán)糊精等的普通的糖及木糖醇、山梨糖醇及赤蘚糖醇等的糖醇。作為香味劑，可使用天然香味劑(索馬甜、甜葉菊提取物(例如，萊鮑迪苷A、甘草甜素等))及合成香味劑(糖精、阿斯巴甜等)。例如，在本發(fā)明的食品組合物制備成提神飲料的情況下，除了本發(fā)明的綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物之外，還可包含檸檬酸、液相果糖、食糖、葡萄糖、醋酸、蘋果酸、果汁、杜仲提取液、大棗提取液、甘草提取。在本說明書中，術(shù)語“抗生組合物(antibioticcomposition)”是指包含使病毒、菌類(fungi)、原生動物(protozoa)及細(xì)菌的微生物失望或抑制生長的抗生物質(zhì)(antibiotics)的組合物。因此，上述抗生物質(zhì)具有抗生活性，即，抗細(xì)菌活性(antibacteriaLactivity)、抗真菌活性(antifungaLactivity)或抗病毒活性(antiviraLactivity)。本發(fā)明的組合物對由上述細(xì)菌誘發(fā)的皮膚感染或痤瘡的預(yù)防及治療表現(xiàn)出顯著效果。如在以下一實(shí)施例中證明，本發(fā)明的組合物顯著抑制如作為痤瘡誘發(fā)菌公知的痤瘡丙酸桿菌(propionibacteriumacnes)及作為革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌(Staphylococusaureus)及作為革蘭氏陰性菌的綠膿桿菌(pseudomonasaeroginosa)、白色念珠菌(candidaalbicans)等多種細(xì)菌的生長。本發(fā)明的痤瘡預(yù)防或治療用組合物可包含作為上述的本發(fā)明的有效成分的綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物的化妝品學(xué)上有效劑量(cosmeticallyeffectiveamount)及在化妝品學(xué)上接受的載體來制備。在本說明書中，術(shù)語“化妝品學(xué)上有效劑量”是指對本發(fā)明的組合物的微生物的實(shí)現(xiàn)抗生功效的充分的量。本發(fā)明的皮膚外用劑組合物可制備成本發(fā)明所屬領(lǐng)域中通常制備的任何劑型，例如，可劑型化成溶液、懸浮液、乳濁液、糊劑、凝膠、乳霜、乳液、粉、肥皂、含表面活性劑的潔面劑、油、粉狀粉底、乳濁液粉底、蠟粉底及噴霧劑等，但不局限于此。更詳細(xì)地，可制備成柔膚化妝水、營養(yǎng)化妝水、營養(yǎng)霜、按摩霜、精華素、眼霜、潔面霜、洗面奶、卸妝水、面膜、噴霧劑或粉的劑型。在本發(fā)明的劑型為糊劑、乳霜或凝膠的情況下，可利用動物性油、植物性油、蠟、石蠟、淀粉、胺黃樹膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅、膨潤土、二氧化硅、滑石或氧化鋅等作為載體成分。在本發(fā)明的劑型為粉或噴霧劑的情況下，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氫氧化鋁、硅酸鈣或聚酰胺粉作為載體成分，尤其，在噴霧劑的情況下，還可包含氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚等的推進(jìn)劑。在本發(fā)明的劑型為溶液或乳濁液的情況下，利用溶劑、增溶劑或乳化劑作為載體成分，例如有水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或山梨糖醇的脂肪酸酯。在本發(fā)明的劑型為懸浮液的情況下，可利用如水、乙醇或丙二醇等液體稀釋劑、乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯等懸浮劑、微晶纖維素、甲基氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂或胺黃樹膠等。在本發(fā)明的劑型為含表面活性劑的潔面劑的情況下，可利用脂肪醇硫酸鹽、脂肪醇醚硫酸鹽、磺基琥珀酸單酯、羥乙基磺酸鹽、咪唑啉衍生物、甲基?；撬猁}、肌氨酸鹽、脂肪酸酰胺醚硫酸鹽、烷基酰胺甜菜堿、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物性油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等作為載體成分。包含于本發(fā)明的皮膚外用劑組合物的成分除了上述有效成分及載體成分之外，包含通常利用于皮膚外用劑組合物多種成分，例如，可包含抗氧化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、維生素、顏料及香料等的通常的助劑。對本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行歸納如下：(ⅰ)本發(fā)明提供包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物作為有效成分的防腐用及抗生組合物。(ⅱ)本發(fā)明提供包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物作為有效成分的痤瘡預(yù)防或治療用組合物。(ⅲ)包含本發(fā)明的綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物的組合物對多種菌表現(xiàn)出廣域的抗菌譜及高的抗氧化效果，這種組合物可適用于如化妝品等化妝品組合物，除此之外，可在食品、醫(yī)藥品、農(nóng)藥及生活用品等多種領(lǐng)域中作為抗菌、殺菌及防腐目的有效地利用。(ⅳ)提出了引起本發(fā)明的綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物的引起高的抗菌效果的有效成分在多種鼠李糖脂也是特定結(jié)構(gòu)(RhaC10C10、RhaRhaC10C10)的鼠李糖脂，通過上述提高了對鼠李糖脂的產(chǎn)業(yè)適用的效率性。附圖說明圖1為執(zhí)行紙片擴(kuò)散法(paperdiskdiffusiontest)來確認(rèn)綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物(R1)的抗菌效果的結(jié)果。圖2作為對包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物的爽膚水劑型的產(chǎn)品的防腐力試驗(yàn)(challengetest)結(jié)果，是表示菌落形成單位(cfu)的曲線圖。圖3為當(dāng)對包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物的爽膚水劑型的產(chǎn)品進(jìn)行防腐力試驗(yàn)時，表示涂抹于板之后的形狀的照片。圖4為測定根據(jù)綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物的含有濃度的與痤瘡相關(guān)的過敏改善率的結(jié)果(紅色桿意味著膏劑型、紫色桿意味著乳霜劑型)。圖5為通過照片確認(rèn)將包含綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物的本發(fā)明的組合物涂敷于被驗(yàn)者的皮膚之后，與痤瘡相關(guān)的過敏改善的結(jié)果。圖6為表示鼠李糖及鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)的圖。圖7為通過1D1H-核磁共振(NMR)譜來分析鼠李糖脂的結(jié)果。圖8為鼠李糖質(zhì)子分析結(jié)果。圖9為二維核磁共振(2D-NMR)分析結(jié)果。圖10為二維核磁共振ROESY實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖11為通過1D1H-核磁共振譜預(yù)分析的測定樣品內(nèi)鼠李糖的相對密度的結(jié)果。圖12為綠膿桿菌培養(yǎng)液提取物R1的抗氧化效果試驗(yàn)結(jié)果。圖13為對R1和從R1分離的分餾物的對金黃色葡萄球菌(S.aureus)的抗菌活性的試驗(yàn)結(jié)果。圖14為R1和從R1分離的分餾物的液相色譜(LC)分析結(jié)果。圖15為利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)、液相二級質(zhì)譜(LC-MS/MS)的有效成分峰1、峰2的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。圖16為R1的液相色譜分析結(jié)果。具體實(shí)施方式以下，通過實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明。這些實(shí)施例只用于更詳細(xì)地說明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的要旨，本發(fā)明的范圍并不限制于這些實(shí)施例，這對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。材料及方法1.生物表面活性劑的生產(chǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，篩選了菌株(CJM01).鑒定結(jié)果確定為綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)，并將菌株接種于M9培養(yǎng)基(0.015g/L的CaCl2、6g/L的Na2HPO4、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的NaCl、1g/L的NH4Cl、0.0625g/L的MgSO4、20g/L的葡萄糖)來在37℃溫度下培養(yǎng)了72小時。培養(yǎng)之后對培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離來取得了完全去除細(xì)胞的培養(yǎng)液。對去除細(xì)胞的培養(yǎng)液利用HCl降低為pH2之后，在4℃溫度下進(jìn)行沉淀。沉淀之后再次進(jìn)行離心分離來去除上清液，并僅取得了沉淀物。利用乙醚提取其沉淀物之后，僅分離乙醚層，來利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮器進(jìn)行濃縮來使乙醚全部蒸發(fā)而取得的提取物(biosurfactantscrude)命名為R1。2.提取的生物表面活性劑的抗菌力試驗(yàn)(paperdiskdiffusiontest)將從微生物(綠膿桿菌)培養(yǎng)液提取的混合物狀態(tài)的生物表面活性劑命名為R1，并針對革蘭氏陽性病原性菌(金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus))、革蘭氏陰性病原性菌(綠膿桿菌、大腸桿菌(Escherichiacoli))施行了紙片擴(kuò)散法(paperdiskdiffusiontest)。將金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及綠膿桿菌和大腸桿菌(E.coli)分別接種于LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L、NaCL10g/L、酵母提取物5g/L)來在37℃的好氧性條件下，液體培養(yǎng)了18小時。培養(yǎng)之后在LB瓊脂板上涂抹了各個200μl的菌培養(yǎng)液。在甲醇中以2mg/ml的濃度溶解從微生物(綠膿桿菌)培養(yǎng)液提取的R1，并在甲醇中以10mg/ml的濃度溶解作為對照區(qū)使用的羥苯甲酯(MethylParaben)、苯氧基乙醇(PhenoxyEthanol)、Naturotics。在甲醇中以2mg/ml的濃度溶解從微生物(綠膿桿菌)培養(yǎng)液提取的R1，以10mg/ml的濃度溶解作為對照區(qū)使用的羥苯甲酯(MethyLParaben)、苯氧基乙醇(PhenoxyEthanol)及Naturotics。以每次20μl的方式將溶解的R1、羥苯甲酯、苯氧基乙醇、Naturotics溶液分別沾于紙片(直徑：6mm)之后，將紙片放置于涂抹有金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿桿菌及大腸桿菌的瓊脂板上。在37℃的好氧性條件下，將各個瓊脂板培養(yǎng)了18小時。18小時之后對向紙片周圍生成的清除區(qū)進(jìn)行了觀察。3.提取的生物表面活性劑的防腐力試驗(yàn)(challengetest)與羥苯甲酯進(jìn)行比較，來為了確認(rèn)R1作為保存劑的可能性而施行了在爽膚水劑型和乳液劑型中，測定對革蘭氏陽性病原性菌(金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌)、革蘭氏陰性病原性菌(綠膿桿菌)、真菌類(白色念珠菌)的殺菌力的防腐力試驗(yàn)。以美國化妝品協(xié)會、即，美國化妝品協(xié)會(CTFA，Thecosmetics、ToiletryandFragranceAssociation)的法為基準(zhǔn)施行防腐力試驗(yàn)，其基準(zhǔn)為若特定物質(zhì)在爽膚水劑型和乳液劑型中使在7天之內(nèi)接種的菌數(shù)的99.9％凋亡，則具有作為保存劑的可能性。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，制備爽膚水劑型和乳液劑型，其組成如表1及表2。表1爽膚水的組成表2乳液的組成4.對在爽膚水劑型中的革蘭氏陽性病原性菌(金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌)的實(shí)驗(yàn)在制備的爽膚水劑型中添加溶解于甲醇的R1，來使R1的最終濃度成為0％、0.01％、0.05％及0.1％，并將金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌的培養(yǎng)液接種于各個容器。并且，向爽膚水劑型添加溶解于甲醇的羥苯甲酯來使羥苯甲酯的最終弄額度成為0％、0.1％、0.5％及1％，并將金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)液接種于各個容器。使接種菌數(shù)成為106-107cfu(集落形成單位(colonyformingunit))/ml。在常溫條件下，儲存接種有菌的爽膚水，并菌接種直后，1天、3天、5天、7天之后，對各個爽膚水進(jìn)行稀釋，來在LB瓊脂板涂敷200μl而計算細(xì)胞數(shù)之后，與初期接種菌數(shù)進(jìn)行比較來掌握了是否凋亡。作為對照區(qū)，在爽膚水劑型中僅添加甲醇，來接種菌培養(yǎng)液之后進(jìn)行了反復(fù)試驗(yàn)。5.對在爽膚水劑型中的革蘭氏陰性病原性菌(綠膿桿菌)、真菌類(白色念珠菌)的實(shí)驗(yàn)在制備的爽膚水劑型中分別添加溶解于甲醇的R1和羥苯甲酯，來使R1的最終濃度成為0％、0.1％、0.5％及1％，并將綠膿桿菌、白色念珠菌的培養(yǎng)液接種于各個容器。使接種菌數(shù)成為106-107cfu(集落形成單位)/ml。在常溫條件下，儲存接種有菌的爽膚水，并菌接種直后，1天、3天、5天、7天之后，對各個爽膚水進(jìn)行稀釋，來在LB瓊脂板涂抹200μl的接種有綠膿桿菌的爽膚水，在酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)瓊脂板涂抹200μl的接種有白色念珠菌的爽膚水來計算細(xì)胞數(shù)之后，與初期接種菌數(shù)進(jìn)行比較來掌握了是否凋亡。作為對照區(qū)，在爽膚水劑型中僅添加甲醇，來接種菌培養(yǎng)液之后進(jìn)行了反復(fù)試驗(yàn)。酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂(5g/L的蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的葡萄糖及15g/L的瓊脂)6.對在爽膚水劑型中的革蘭氏陰性病原性菌(金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌)、革蘭氏陰性病原性菌(綠膿桿菌)及真菌類(白色念珠菌)的實(shí)驗(yàn)在制備的爽膚水劑型中分別添加溶解于甲醇的R1和羥苯甲酯，來使R1的最終濃度成為0％、0.5％，并將金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿桿菌及白色念珠菌的培養(yǎng)液接種于各個容器。使接種菌數(shù)成為106-107cfu(集落形成單位)/ml。在常溫條件下，儲存接種有菌的乳液，并菌接種直后，1天、3天、5天、7天之后，對各個乳液進(jìn)行稀釋，來在LB瓊脂板涂抹200μl的接種有金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及綠膿桿菌的乳液，在酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)瓊脂板涂抹200μl的接種有白色念珠菌的乳液來計算細(xì)胞數(shù)之后，與初期接種菌數(shù)進(jìn)行比較來掌握了是否凋亡。作為對照區(qū)，在爽膚水劑型中僅添加甲醇，來接種菌培養(yǎng)液之后進(jìn)行了反復(fù)試驗(yàn)。7.含有提取的生物表面活性劑的產(chǎn)品的與痤瘡相關(guān)的過敏改善效果7-1.產(chǎn)品的種類、產(chǎn)品的分量及劑型制備從微生物(綠膿桿菌)培養(yǎng)液提取的含有生物表面活性劑R1的天然化妝品，來適用(5g/1人/2周)于具有與痤瘡相關(guān)的過敏癥狀(化膿性、小米粒痤瘡、痤瘡疤痕、癤子)的被驗(yàn)者，來觀察了改善效果。表3產(chǎn)品的種類表4含有0.5％的R1混合物的膏劑型產(chǎn)品的組成表5含有0.1％的R1混合物的膏劑型產(chǎn)品的組成表6含有0.02％的R1混合物的膏劑型產(chǎn)品的組成表7含有0％的R1混合物的膏劑型產(chǎn)品的組成表8含有0％的R1混合物的乳霜劑型產(chǎn)品的組成表9含有0.02％的R1混合物的乳霜劑型產(chǎn)品的組成表10含有0.1％的R1混合物的乳霜劑型產(chǎn)品的組成7-2.被驗(yàn)者本研究為在單一機(jī)關(guān)中，作為對照組、實(shí)驗(yàn)組的觀察研究臨床試驗(yàn)、當(dāng)對具有與痤瘡相關(guān)的過敏的被驗(yàn)者涂抹產(chǎn)品時，評價與痤瘡相關(guān)的過敏的癥狀改善等有效性及穩(wěn)定性一次結(jié)果變數(shù)(主要終點(diǎn)(Primaryendpoint))為使用產(chǎn)品之后兩周后的與痤瘡相關(guān)的過敏的癥狀改善率，并評價了試驗(yàn)之前和試驗(yàn)之后的與痤瘡相關(guān)的過敏的癥狀的改善率是否有差異。基于過去執(zhí)行的臨床試驗(yàn)考慮約10％的淘汰率，來將總被驗(yàn)者數(shù)確定為30名，由個人原因未同意臨床試驗(yàn)同意書的3名未參加臨床試驗(yàn)，參與臨床試驗(yàn)的被驗(yàn)者為共27名，中途淘汰率為0％，從而可進(jìn)行最終評價的被驗(yàn)者數(shù)為27名。7-3.試驗(yàn)方法2周使用5g的試驗(yàn)產(chǎn)品，一天2次以上(早晨、晚上、常時)，在試驗(yàn)者指定的皮膚病變部位將乳霜或膏形態(tài)的產(chǎn)品涂敷2周。將仁荷大學(xué)和仁川大學(xué)的學(xué)生為對象，招募與痤瘡相關(guān)過敏化妝品功效評價臨床試驗(yàn)參與人員，在自愿申請的申請人員中將適合于選定基準(zhǔn)，且未相當(dāng)于排除標(biāo)準(zhǔn)的申請人員為對象進(jìn)行了臨床研究。通過篩選來篩選被驗(yàn)者，共27名的被驗(yàn)者同意參與試驗(yàn)，男性為16名、女性為11名，被驗(yàn)者的年齡分布在從20周歲至28周歲之間。淘汰及中途放棄的被驗(yàn)者為0名結(jié)束評價的最終被驗(yàn)者為27名。為了進(jìn)行對與痤瘡相關(guān)的過敏改善效果的評價，每次進(jìn)行訪問時，進(jìn)行肉眼評價及圖像拍攝，并進(jìn)行了具有每天對本人的變化程度(感到變化的程度及是否存在異常反應(yīng))進(jìn)行直接檢查的被驗(yàn)者的主觀意志的問卷調(diào)查。作為肉眼評價，在臨床試驗(yàn)開始第0天的時間點(diǎn)上，將涂敷產(chǎn)品之前存在于試驗(yàn)者規(guī)定的病變部位的進(jìn)行狀態(tài)的痤瘡數(shù)量規(guī)定為始發(fā)點(diǎn)，在此部位中，試驗(yàn)經(jīng)過2周后對利用眼睛觀察得到改善的程度進(jìn)行數(shù)值化，對參與臨床研究的研究對象的病變部位，每次進(jìn)行試驗(yàn)之前和臨床試驗(yàn)測定訪問時拍攝的圖像。并且，進(jìn)行了被驗(yàn)者主觀意見的問卷調(diào)查。7-4.效果評價記住、評價方法及解析方法將適合于選定基準(zhǔn)的被驗(yàn)者及將提供的鏟平使用2周的被驗(yàn)者選定為有效性評價對象，在第0周、第1周及第2周施行對進(jìn)行中的痤瘡數(shù)量的了解及圖像拍攝等對與痤瘡相關(guān)的過敏改善的肉眼性評價，并進(jìn)行了具有被驗(yàn)者的主觀意見的問卷調(diào)查。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)推定分析了試驗(yàn)的結(jié)果整理及分析。8.核磁共振分析對與從微生物(綠膿桿菌)培養(yǎng)液提取的生物表面活性劑R1相同的綠膿桿菌變更培養(yǎng)及提取方式二取得的R2、R3及含有90％的鼠李糖脂(生物表面活性劑的一個種類)的從西格瑪奧德里奇(SIGMA-ALDRICH)公司購買的R90進(jìn)行了核磁共振分析。鼠李糖脂的結(jié)構(gòu)由包含一個或兩個鼠李糖(糖)部分(圖6的左側(cè))和兩個脂肪族鏈(aliphaticchains)的脂質(zhì)部分形成(圖6的右側(cè))。鼠李糖脂結(jié)構(gòu)的多樣性基于一個或兩個鼠李糖環(huán)的數(shù)和脂質(zhì)部分的兩個脂肪族鏈的結(jié)構(gòu)(長度及飽和度)。在氯仿-甲醇(2：1)混合物中溶解4個不同的生物表面活性劑提取物(樣品0、樣品1、樣品2及樣品3)和在商業(yè)上銷售(西格瑪(Sigma))的鼠李糖脂(樣品90)之后進(jìn)行了核磁共振分析。9.綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)培養(yǎng)液提取物的抗氧化效果為了綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)培養(yǎng)液提取物的作為防腐劑的適用進(jìn)行了對抗氧化效果的實(shí)驗(yàn)。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基呈現(xiàn)紫色，若上述1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基與抗氧化劑進(jìn)行反應(yīng)則呈現(xiàn)黃色。與抗氧化能力越優(yōu)秀的試樣進(jìn)行反應(yīng)，就1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的顏色的變化也明顯。以分別不同的濃度在甲醇中溶解R1、抗壞血酸(Ascorbicacid、AA)及羥苯甲酯(MTP)溶解。將像這樣取得的試樣(100μl)混合于100μl的在甲醇中分別以0.006％的濃度溶解的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基，來制備共200μl之后，在阻隔光的空間下反應(yīng)了30分鐘。反應(yīng)結(jié)束之后在517nm條件下，對各個混合液測定吸光度值來測定了各試樣的抗氧化能力。10.引起綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)培養(yǎng)液提取物的抗氧化效果的有效成分的探索綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)培養(yǎng)液提取物是不是單一成分，而是由多種成分混合而成的狀態(tài)。探索在包含于綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)培養(yǎng)液提取物的多種成分中引起抗菌效果的有效成分是什么，并進(jìn)行了明確其結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)。從微生物(綠膿桿菌)培養(yǎng)液提取的混合物狀態(tài)的R1的分離在甲醇中溶解1mg的從微生物(綠膿桿菌)培養(yǎng)液提取的混合物狀態(tài)的R1之后注入于sep-Pakvac1cctc18藥筒柱。其后，利用溶劑A洗滌柱，并注入了作為展開溶劑的溶劑B。以分別不同的濃度向柱注入溶劑B之后分別收集通過柱的分餾物(fraction)來分別命名為分餾物1、分餾物2、分餾物3、分餾物4、分餾物5及分餾物6。以50％、55％、60％、65％、70％及75％分別不同的濃度向柱注入溶劑B，溶劑A和溶劑B的組成如表11。表11溶劑A和溶劑B的組成從R1分離的分餾物的抗菌活性分析干燥取得的各分餾物之后，以10mg/ml的濃度在甲醇溶液中溶解。將20μl的溶解于甲醇的各個分餾物滴落于涂抹有金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液的瓊脂板上后，在37℃溫度下，培養(yǎng)18小時，18小時之后觀察了生成于瓊脂板上的清除區(qū)。通過從R1分離的分餾物的液相色譜/MS的結(jié)構(gòu)分析為了分離的分餾物的結(jié)構(gòu)分析執(zhí)行的液相色譜–MS在陰性模式的離子極性下，使用1.8μm的2.1*100mm的SB-AqRRHD(分析柱)和2.1*5mm的1.8μm的ZorbaxSB-C8(引導(dǎo)柱)來進(jìn)行。在甲醇中溶解經(jīng)分離的分餾物來準(zhǔn)備了樣品。將20μl的樣品注入于安裝有柱的高效液相色譜法，還連接質(zhì)量分析儀來進(jìn)行了分析。在高效液相色譜法中使用溶劑A和溶劑B的混合液作為展開溶劑，初期的溶劑A和溶劑B的混合比率為50％，其之后的順序如下。以100％的溶劑B(19分鐘)、100％的溶劑B(20.5分鐘)、50％的溶劑B(21分鐘)、50％的溶劑B(25分鐘)、高效液相色譜法流速：0.15ml/分鐘及掃描質(zhì)量范圍為75～1000m/z來準(zhǔn)備。對引起抗菌效果的特定成分進(jìn)行了MS/MS。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.提取的生物表面活性劑的抗菌力試驗(yàn)將從微生物(綠膿桿菌)培養(yǎng)液提取的混合物狀態(tài)的生物表面活性劑命名為R1，并對革蘭氏陽性病原性菌(金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌)、革蘭氏陰性病原性菌(綠膿桿菌綠膿桿菌、大腸桿菌)施行了抗菌力試驗(yàn)。進(jìn)行紙片擴(kuò)散法(paperdiskdiffusiontest)，最終R1與作為現(xiàn)有的化妝品保存劑使用的羥苯甲酯、苯氧基乙醇、Naturotics相比，在低于5倍的濃度下生成了明顯大的清除區(qū)(圖1)。2.提取的生物表面活性劑的防腐力試驗(yàn)進(jìn)行防腐力試驗(yàn)，最終在爽膚水劑型中，R1對所接種的全部菌7天之內(nèi)使接種菌數(shù)的99.9％凋亡，尤其，R1在作為比羥苯甲酯少10倍的0.01％下，對革蘭氏陽性病原性菌放入金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌1天使接種菌數(shù)的99.9％凋亡。對于革蘭氏陰性病原性菌(綠膿桿菌)和真菌類(白色念珠菌)，在作為與羥苯甲酯相同的濃度的0.5％下，5天使接種菌數(shù)的99.9％凋亡(圖2-3)。并且，在乳液劑型中，對于接種的全部菌，R1在作為與羥苯甲酯相同的濃度的0.5％下，7天之內(nèi)使接種菌數(shù)的99.9％凋亡(表12)。這種結(jié)果表示R1具有作為保存劑的可能性。表12在乳液劑型中R1的防腐力試驗(yàn)(％-接種菌數(shù)的生存率)3.含有提取的生物表面活性劑的產(chǎn)品的與痤瘡相關(guān)的過敏改善效果制備從微生物(綠膿桿菌)培養(yǎng)液提取的含有生物表面活性劑R1的天然化妝品，來適用于具有與痤瘡相關(guān)的過敏癥狀的被驗(yàn)者，最終，與未含有R1的產(chǎn)品相比，在使用含有R1的產(chǎn)品的被驗(yàn)者中與痤瘡相關(guān)的過敏改善率明顯增加，在全部被驗(yàn)者中未觀察到皮膚異常反應(yīng)(瘙癢、燒灼感、紅斑、紅腫、癤子、熱等)。表13痤瘡相關(guān)過敏改善率在臨床試驗(yàn)開始第0天的時間點(diǎn)上，將涂敷產(chǎn)品之前存在于試驗(yàn)者規(guī)定的病變部位的進(jìn)行狀態(tài)的痤瘡數(shù)量規(guī)定為始發(fā)點(diǎn)，在此部位中，試驗(yàn)經(jīng)過2周后對利用眼睛觀察得到改善的程度進(jìn)行數(shù)值化，與不含有微生物培養(yǎng)液提取物的產(chǎn)品相比，在使用含有微生物培養(yǎng)液提取物的產(chǎn)品的被驗(yàn)者中確認(rèn)了更高的改善率。尤其，在使用含有0.02％的微生物培養(yǎng)液提取物的乳霜形態(tài)的產(chǎn)品的被驗(yàn)者中確認(rèn)了最高的改善率，其次，在使用含有0.1％的微生物培養(yǎng)液提取物的乳霜形態(tài)的產(chǎn)品的被驗(yàn)者中確認(rèn)了高的改善率(圖4)。據(jù)此，可判斷含有本發(fā)明人制備的微生物培養(yǎng)液提取物的天然化妝品有助于痤瘡改善。被驗(yàn)者的圖像拍攝結(jié)果如圖5a～圖5i。表14概括的有效性評價被驗(yàn)者號評價被驗(yàn)者號評價141542316434173451845419463204732138322393234105244113254123265134274144平均3.75：癥狀消失，4：整體上癥狀明顯變好3：整體上癥狀明略變好，2：與試驗(yàn)之前無癥狀的變化1：與試驗(yàn)之前癥狀變壞表15使用之后對產(chǎn)品的滿足度評價結(jié)果被驗(yàn)者號評價被驗(yàn)者號評價131552416334174451855419464204742148322493234105244112253124.5265134274144平均3.91：不清楚、2：不滿足、3：普通、4：滿足、5：非常滿足臨床試驗(yàn)2周之后，對被驗(yàn)者的與痤瘡相關(guān)的過敏的改善效果的整體滿足度評價得高。在問卷評價和肉眼評價中呈現(xiàn)最明顯的變化的部分為化膿性痤瘡和一時發(fā)生的如癤子等皮膚過敏。相反，對小米粒痤瘡和痤瘡痤瘡疤痕改善相對地變化少。并且，確認(rèn)如下：與膏劑型相比，在使用乳霜劑型的產(chǎn)品的被驗(yàn)者的改善效果和滿足度更高。通過2周的臨床試驗(yàn)結(jié)果，肉眼評價及問卷評價、圖像拍攝，來可知含有本發(fā)明人制作的微生物培養(yǎng)液提取物的天然化妝品是有助于與痤瘡相關(guān)過敏改善的產(chǎn)品。4.核磁共振分析一般觀測所有樣品包括由4種主要成分(兩種類型的雙-鼠李糖脂和兩種類型的單-鼠李糖脂)形成地相似的鼠李糖脂系列。在各樣品中，雙-鼠李糖脂的A分餾物的含有率均不同(在樣品90的情況下，含有至35％，樣品2和樣品3含有65％以上)(表17)。并且，樣品0、樣品1、樣品2、樣品3還含有預(yù)計可對抗菌活性產(chǎn)生影響的芳香族成分。1D-核磁共振分析在圖7中示出，在對樣品1的1D1H-核磁共振譜中相當(dāng)于鼠李糖脂的部分。在譜下面示出信號強(qiáng)度(integrals)。根據(jù)在0.82ppm中的甲基峰進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，其峰相當(dāng)于6個質(zhì)子(proton)(2甲基)。因此，預(yù)計單一質(zhì)子(proton)峰示出大致100單位程度的信號強(qiáng)度。例如，在1.4-1.5ppm和2.4～2.6ppm中示出的兩組的峰呈現(xiàn)～400程度的信號強(qiáng)度，分別與在C2H2/C5H2及C7H2/C10H2組中呈現(xiàn)的4個質(zhì)子信號一致。通過比較從脂質(zhì)和鼠李糖組取得的單-鼠李糖脂及雙-鼠李糖脂的信號的強(qiáng)度，來可測定單-鼠李糖脂及雙-鼠李糖脂的質(zhì)量比。若樣品僅包含單-鼠李糖脂，則僅來自鼠李糖的一個質(zhì)子與位于脂質(zhì)部分的一個質(zhì)子一致。并且，若樣品僅包含雙-鼠李糖脂，則與“2-to-1”一致。如在圖8中得到證明，H1和H4的脂質(zhì)質(zhì)子(暗橙色箱體)呈現(xiàn)相同類型的信號，其強(qiáng)度的之合圍大致100左右，這是說明位于混合物的各個鼠李糖脂分子準(zhǔn)確地具有一個上述類型的質(zhì)子。最終，從H1’/1”、H2’/2”、H3’/3”及H5’/5”鼠李糖質(zhì)子(圖8的藍(lán)色箱體)取得的信號強(qiáng)度的之和高于在單-鼠李糖脂混合物中預(yù)計的信號強(qiáng)度。位于單-鼠李糖脂混合物里的每一個分子一個的H1’質(zhì)子應(yīng)得出具有100值的信號。三個H2’、H3’、H5’的質(zhì)子應(yīng)呈現(xiàn)具有300值的信號。但是，在樣品1中的這種信號強(qiáng)度測定為大致150～480左右。從這種信號強(qiáng)度數(shù)值可推定為在樣品1中雙-鼠李糖脂大致存在60％左右。通過1D1H-核磁共振譜，來執(zhí)行了作為相似的分析的樣品0、樣品2、樣品3及樣品90。二維核磁共振分析通過2D1H-13C-HSQC實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了樣品中雙-鼠李糖脂的存在。β-L-Rhap(1″→2′)-β-L-Rhap鍵的形成引起了通過氧相連結(jié)的雙-鼠李糖的C2’和C1’原子的強(qiáng)的核磁共振信號移動(圖6的結(jié)構(gòu))。在圖9中示出HSQC譜的C1’/1”H及C2’/2”H區(qū)域。在102ppm中呈現(xiàn)的交叉峰(13C標(biāo)尺、紅色箱體)與在雙-鼠李糖脂中的H1”/C1”的相關(guān)系數(shù)一致。相反，在95-96ppm中呈現(xiàn)的交叉峰與單-鼠李糖脂的H1’/C1’的相關(guān)系數(shù)一致(圖6的結(jié)構(gòu))。在～79ppm中呈現(xiàn)的兩個交叉峰(圖9藍(lán)色箱體)與雙-鼠李糖脂部分的兩個C2’原子一致。自旋系統(tǒng)分配為了測定樣品里的其他鼠李糖脂的相對密度和數(shù)，利用二維核磁共振譜(異核單量子相關(guān)譜(HSQC)、總相關(guān)譜(TOCSY)、COSY-DQF)分離自旋系統(tǒng)，這是與鼠李糖脂分子的鼠李糖環(huán)結(jié)構(gòu)的脂肪酸尾部結(jié)構(gòu)一致。并且，這是可證明鼠李糖部分(系統(tǒng)1-系統(tǒng)6)的未知的系統(tǒng)和脂肪酸尾部的8個系統(tǒng)。以鼠李糖部分的類型預(yù)先分配其系統(tǒng)(雙-鼠李糖的第一(’)或第二(”)單一環(huán)結(jié)構(gòu)，羥基脂肪酸的位置(直接或間接地與鼠李糖相連接，圖6)基于公知的化學(xué)移動(部分3，二維核磁共振分析，圖9的例示)。系統(tǒng)1和系統(tǒng)2分配于雙-鼠李糖的第二個鼠李糖結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)3和系統(tǒng)4分配于雙-鼠李糖的第一個鼠李糖環(huán)結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)5和系統(tǒng)6與單-鼠李糖脂中的鼠李糖環(huán)結(jié)構(gòu)一致。不僅是它們的最少成分9和最少成分10，而且系統(tǒng)8和系統(tǒng)9分配于脂質(zhì)里的第二個脂肪酸(未與鼠李糖部分直接相連接)。最終，分配于系統(tǒng)11～系統(tǒng)14的第一個脂肪酸鏈，直接與鼠李糖部分相連接。自旋系統(tǒng)連接分配用于鼠李糖脂分子的結(jié)構(gòu)性部分的自旋系統(tǒng)之后，執(zhí)行了將其與鼠李糖脂內(nèi)部相連接的幾種可能的方法。為了檢測存在于鼠李糖環(huán)的通過質(zhì)子和脂肪酸的質(zhì)子表面的偶極-偶極相互作用，利用了二維核磁共振ROESY實(shí)驗(yàn)。如預(yù)計，鼠李糖系統(tǒng)3-鼠李糖系統(tǒng)6的H1質(zhì)子和脂肪酸系統(tǒng)11-脂肪酸系統(tǒng)14的H1質(zhì)子之間的交叉峰(圖10)。這實(shí)驗(yàn)可實(shí)現(xiàn)使分配于鼠李糖第一個環(huán)結(jié)構(gòu)或單一結(jié)構(gòu)的自旋系統(tǒng)與分配于脂肪酸的自旋系統(tǒng)相連接。在雙-鼠李糖里的第二環(huán)結(jié)構(gòu)和分配于脂肪酸質(zhì)子的系統(tǒng)1和系統(tǒng)2的H1質(zhì)子之間未觀察到任何交叉峰。最終，自旋系統(tǒng)整理成4個鼠李糖脂分子I～I(xiàn)V(表16)。表16核磁共振樣品中I-IV分子的相度密度1D1H-核磁共振譜的預(yù)分析明確地示出樣品中鼠李糖的相對密度(圖11)。在脂肪酸系統(tǒng)中，還觀察到了相同的結(jié)果。利用I-IV分子的相對密度推定信號強(qiáng)度，為了取得在H1/H1”、H2/H2”鼠李糖質(zhì)子及H1和H4脂肪酸質(zhì)子中分離得均勻的信號，利用1D1H核磁共振譜測定信號強(qiáng)度。在表16種提出分析的概要。對與從微生物(綠膿桿菌)培養(yǎng)液提取的生物表面活性劑R1相同的綠膿桿菌變更培養(yǎng)及提取方式來取得的R2、R3及含有90％的鼠李糖脂的從西格瑪奧德里奇購買的R90進(jìn)行核磁共振分析，最終明確各提取物和購入的R90均包含鼠李糖脂。由此，可證明從微生物(綠膿桿菌)培養(yǎng)液提取的R1含有鼠李糖脂系列生物表面活性劑(圖11)(表16)。并且，通過核磁共振分析可知5個樣品含有鼠李糖脂，其含有率各不同。并且，鼠李糖脂有可能與其他生物學(xué)研究相關(guān)聯(lián)。表175.綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)培養(yǎng)液提取物的抗氧化效果為了調(diào)查綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)培養(yǎng)液提取物R1的抗氧化效果，進(jìn)行1，1-二苯基-2-三硝基苯肼消除活性試驗(yàn)，結(jié)果R1在0.5％以上的濃度條件下，表現(xiàn)出與作為具有抗氧化效果的代表成分的抗壞血酸(AA)相同水平的抗氧化效果。相反，羥苯甲酯(MTP)與R1進(jìn)行比較，在相同的濃度下，表現(xiàn)出顯著低的抗氧化效果?；谶@種結(jié)果具有抗氧化效果的綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)培養(yǎng)液提取物R1可作為防腐劑適用(圖12)。6.引起綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)培養(yǎng)液提取物的抗氧化效果的有效成分的探索分離從微生物(綠膿桿菌)培養(yǎng)液提取的混合物狀態(tài)的R1來取得了分餾物1、分餾物2、分餾物3、分餾物4、分餾物5及分餾物6。對取得的各試樣進(jìn)行對金黃色葡萄球菌的抗菌活性的試驗(yàn)，分餾物1、分餾物2、分餾物3表現(xiàn)出與R1相應(yīng)的抗菌活性，分餾物4、分餾物5表現(xiàn)出較弱于R1的抗菌活性，分餾物6未表現(xiàn)出抗菌活性(圖13)。對全部試樣進(jìn)行液相色譜分析，最終，在發(fā)現(xiàn)在示出抗菌活性的分餾物1、分餾物2及分餾物3中存在得高，并在分餾物4、分餾物5中逐漸減少的共同的2個峰，并命名為峰1、峰2(圖14)。與抗菌活性試驗(yàn)相連接判斷時，判斷為是否存在峰1、峰2確定抗菌活性，進(jìn)行峰1、峰2的MS及MS/MS試驗(yàn)，最終，分析為峰1是具有650的分子量、Rha-Rha-C10-C10的結(jié)構(gòu)的雙-鼠李糖脂(Di-rhamnolipid)、峰2分析為具有504的分子量、Rha-C10-C10的結(jié)構(gòu)的單-鼠李糖脂(Mono-rhamnolipid)(圖15a-d)。在R1中存在具有多種結(jié)構(gòu)的鼠李糖脂(圖16、表18)，其中，還確認(rèn)了具有Rha-C10-C10的結(jié)構(gòu)的鼠李糖脂為具有抗菌活性的有效成分。并且，對從韓國西格瑪奧德里奇購入的綠膿桿菌培養(yǎng)液提取的鼠李糖脂(R90、R95)的金黃色葡萄球菌的抗菌活性與R1相比，顯著低(圖17)。表18MS主峰(MSofmainpeaks(R1))以上，對本
發(fā)明內(nèi)容的特定部分進(jìn)行了詳細(xì)說明，這種詳細(xì)技術(shù)只屬于優(yōu)選實(shí)例，本發(fā)明的范圍不局限于此，這對于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性的范圍應(yīng)根據(jù)所附的發(fā)明要求保護(hù)范圍和其的等同技術(shù)方案來定義。當(dāng)前第1頁1 2 3