本發(fā)明屬于醫(yī)藥及衛(wèi)生技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組天然殺菌/抗菌劑。
背景技術(shù)：
傷口感染對(duì)人類及各種動(dòng)物的危害是不言而喻的。感染常見(jiàn)的細(xì)菌有大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等，伴隨著抗生素的大量應(yīng)用，細(xì)菌出現(xiàn)了多重耐藥。在醫(yī)院感染菌的檢測(cè)中產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希氏菌占大腸埃希氏菌的74％，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌占金黃色葡萄球菌的76％，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的銅綠假單胞菌是醫(yī)院常見(jiàn)的耐藥菌株，以白色念珠菌為代表的真菌感染檢出率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。各種化學(xué)消毒劑與抗生素同屬于具有特殊抑殺微生物作用的化學(xué)物質(zhì)，它們對(duì)微生物的作用機(jī)制也有很多相同或相似之處，容易使菌株產(chǎn)生抗性，出現(xiàn)更難以殺滅的菌種，同時(shí)化學(xué)消毒劑和抗生素由于自身的毒性和蓄積作用對(duì)人體也有不同程度的傷害。如下述專利中消毒產(chǎn)品中使用的抗菌劑均為含有上述成分的物質(zhì)。
專利CN1321573C公布了一種脫乙?？啥嗵呛投洳槎衔餁⒕鷦Ｔ摻M分含有一定氣味，且必須保持pH值在5.5以下，否則殺菌效果降低。
專利CN1777577B公布了一類末端為羰基亞氨基羥基的化合物，通過(guò)抑制UDP-3-O-(R-3-羥基癸?；?-N-乙?；?萄)糖胺脫乙?；钢委煾锾m氏陰性細(xì)菌感染。
專利CN101766188公布了一種殼聚糖抗菌劑，由重均分子量為1500-3000，脫乙酰度為90-95％的殼聚糖、聚季銨鹽、EDTA、多元醇組成。
專利CN101808627B公布了一種由精油和氯己定組成的抗菌劑，能更深入滲透皮膚治療角質(zhì)層下皮膚感染。
專利CN102008459B公布了一種：取代的苯甲酰胺和吡啶酰胺類化合物，可以作為抗菌劑。
專利CN102802448B公布了一種煅燒鈣或氫氧化鈣、乙醇及乳酸鈉配合而成的水溶液或水分散體。可對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、其他食中毒菌得到高的殺菌力。
專利CN102480952B公布了一種安全性和抗菌性優(yōu)異的表兒茶素沒(méi)食子酸酯衍生物。使用該物質(zhì)或者其異構(gòu)體或它的鹽作為抗菌劑。
專利CN102824363B公布了一種以納米銀和殼聚糖或其衍生物為有效成分的抗菌劑。具有抗菌、消炎、止癢、促進(jìn)皮膚表面組織修復(fù)和創(chuàng)傷面愈合的作用，具有吸收快、見(jiàn)效快、使用方便、不會(huì)產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，可縮短傷口愈合時(shí)間，且產(chǎn)品可長(zhǎng)時(shí)間存放，不會(huì)變色，有利于提高患者的順應(yīng)性。
專利CN104126608A公布了公開(kāi)了一種殺菌劑，包括N-(β，β-二氯乙烯基)水楊酰胺、異佛酮、聚氧乙烯、乙烯、烷基苯磺酸、醋酸、過(guò)氧化氫。
專利CN104666329A公布了一種過(guò)氧化氫、N-(β，β-二氯乙烯基)水楊酰胺、乙烯、聚氧乙烯、烷基苯磺酸、醋酸和異佛酮組成的抗菌劑。
上述發(fā)明的抗菌劑大多為化學(xué)類有機(jī)或無(wú)機(jī)抗菌劑，長(zhǎng)期使用會(huì)使菌株產(chǎn)生抗性，并且會(huì)嚴(yán)重危害人類的健康。
本發(fā)明提供了一組純天然的對(duì)人體無(wú)毒害作用的殺菌/抗菌劑，其獨(dú)特的殺菌機(jī)理不會(huì)使各種菌種產(chǎn)生抗性，長(zhǎng)期使用也不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生任何毒副作用。各類天然殺菌物質(zhì)的特點(diǎn)和殺菌機(jī)理簡(jiǎn)述如下。
大部分菌類細(xì)胞壁的主要成分為肽聚糖，是一個(gè)含有四肽側(cè)鏈的二糖單位，二糖單位由β-1，4連接的N-乙酰葡萄糖胺(NAG)和N-乙酰胞壁酸(NAM)組成。肽聚糖的四肽側(cè)鏈的氨基酸，依次為L(zhǎng)-丙氨酸、D-谷氨酸、L-賴氨酸、D-丙氨酸，而首位的L-丙氨酸通過(guò)一個(gè)酰胺鍵與胞壁酸相連，該聚糖鏈四肽側(cè)鏈第三位的L-賴氨酸，通過(guò)五肽(五個(gè)甘氨酸)交聯(lián)橋連接到相鄰聚糖鏈四肽側(cè)鏈D-丙氨酸羧基上。由此縱橫交叉，左右連接構(gòu)成十分堅(jiān)韌的三維立體多孔結(jié)構(gòu)，并構(gòu)成較厚的肽聚糖層。
溶菌酶是由130個(gè)左右的氨基酸組成的球形蛋白，含有二硫鍵，分子量為14000左右，酸性條件下穩(wěn)定性很強(qiáng)。溶菌酶能夠切斷細(xì)菌細(xì)胞壁上N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的鍵，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂細(xì)胞內(nèi)容物溢出而使細(xì)菌死亡。
溶葡球菌酶為白色或淡黃色粉末，是一種含鋅的金屬蛋白酶，由246個(gè)氨基酸組成。表達(dá)該基因的核酸組成有1486個(gè)核苷酸。等電點(diǎn)為10.5-11.0，酶活性最適pH范圍為10～11。溶葡球菌酶可切斷肽聚糖中的Gly-Gly鍵導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂細(xì)胞內(nèi)容物溢出而使細(xì)菌死亡。但該物質(zhì)長(zhǎng)期放置會(huì)失活。
Iseganan、Indolicidin、Omiganan、Neuprex、乳酸鏈球菌素(Nisin)、比辛(Bisin)、桿菌肽(bacitracin)均屬于抗菌肽?？咕牡目咕饔脵C(jī)理各有特點(diǎn)，但主要有如下機(jī)理。1)抗菌肽都是陽(yáng)離子型或兩親性的，通過(guò)桶一板、地毯、環(huán)形孔三種方式作用于細(xì)胞膜，使膜形成孔洞從而殺死細(xì)胞。2)部分抗菌肽通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)線粒體作用，抑制細(xì)胞呼吸，達(dá)到殺菌目的。3)部分抗菌肽通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，引起細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)異常，生長(zhǎng)受限，從而促使細(xì)胞死亡。4)作用于胞內(nèi)生物大分子如核酸或蛋白，引起功能異常，最終殺死細(xì)菌。
抗菌肽可以通過(guò)破壞細(xì)胞膜來(lái)殺滅細(xì)菌，而哺乳動(dòng)物同樣含有細(xì)胞膜，但抗菌肽具有高的特異性，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞幾乎不作用?？咕牡年?yáng)離子兩親性特性以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞與細(xì)菌膜組成、膜結(jié)構(gòu)的區(qū)別是決定抗菌肽高特異性的重要因素。在生理?xiàng)l件下，絕大多數(shù)抗菌肽都是帶有凈正電荷的，而細(xì)菌的細(xì)胞膜富含磷脂酰甘油、心肌磷脂或絲氨酸磷脂之類的磷脂而使其帶有負(fù)電荷，所以兩者之間極易發(fā)生電荷相互作用，進(jìn)而使抗菌肽產(chǎn)生殺滅細(xì)菌的生物學(xué)效應(yīng)。而哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜主要由兩性離子磷脂如腦磷酯、鞘磷脂等組成，不易與抗菌肽相互作用。同時(shí)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上存在的甾醇類分子使抗菌肽不易對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生傷害?？咕牡母咛禺愋砸矝Q定了其臨床應(yīng)用會(huì)具有較高的安全性。
Iseganan是一個(gè)由17個(gè)氨基酸組成的多肽，內(nèi)部含有兩個(gè)二硫鍵分子量為1900.28，其鹽酸鹽能與細(xì)菌的胞外成分如脂多糖或脂膜酸等相結(jié)合，從而引起細(xì)菌膨脹、破裂，通過(guò)破壞細(xì)胞膜來(lái)殺死細(xì)菌。其序列為H-Arg-Gly-Gly-Leu-Cys-Tyr-Cys-Arg-Gly-Arg-Phe-Cys-Val-Cys-Val-Gly-Arg-NH2，(Cys5＆Cys14，Cys7＆Cys12)。
Indolicidin是來(lái)源于牛中性粒細(xì)胞的多肽抗生素。其C端是酰胺化的。對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有很強(qiáng)的殺菌活性。其序列為Ile-Leu-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-NH2。
Omiganan是陽(yáng)離子抗菌肽Indolicidin的類似物，由12個(gè)氨基酸組成，分子量為1779.17。最初從牛中性粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)顆粒中純化得到的，在體外有廣譜的抗細(xì)菌和抗真菌活性。序列為H-IIe-Leu-Arg-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-LyS-NH2。
Neuprex一種殺菌/滲透性增加蛋白，N-末端片斷結(jié)合并中和內(nèi)毒素，對(duì)一些細(xì)菌有強(qiáng)大的殺死作用。
乳酸鏈球菌素是由34個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量約為3500。其中有13個(gè)氨基酸被修飾，擁有兩個(gè)疏水性結(jié)構(gòu)域，氨基酸1到19構(gòu)成的A、B、C環(huán)為N端結(jié)構(gòu)域，氨基酸23到28構(gòu)成D、E兩環(huán)為第二結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間由Asn-Met-Lys形成的柔性鉸鏈區(qū)相連。其抗菌機(jī)理是在敏感細(xì)菌的質(zhì)膜上形成電位依賴性的離子通道，使離子和小分子快速溢出，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。乳酸鏈球菌素可抑制大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌，并對(duì)芽孢桿菌的孢子有強(qiáng)烈的抑制作用，但對(duì)革蘭氏陰性菌抑制效果不明顯。該物質(zhì)在蛋白酶的作用下很快水解成氨基酸。
比辛(Bisin)是由明尼蘇達(dá)大學(xué)Daniel J.O’Sullivan教授和他的學(xué)生在雙歧桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種“羊毛硫抗生素”，是由約30個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量3291.8，等電點(diǎn)9.5，能耐受高溫和蛋白酶的攻擊。對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有強(qiáng)烈的抑制作用。
桿菌肽(bacitracin)也是由肽鏈連結(jié)的氨基酸組成，對(duì)多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌及奈瑟球菌作用好。其作用機(jī)理主要是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。
由于各種物質(zhì)的殺局機(jī)理不同，兩種或兩種以上配合使用，會(huì)產(chǎn)生協(xié)同殺菌作用，殺菌效果比單一的殺菌物質(zhì)要高出幾十甚至上百倍。且本發(fā)明的殺菌/抗菌劑對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有非常強(qiáng)的殺滅作用，而對(duì)人體細(xì)胞和組織無(wú)毒害作用，且非常容易被人體吸收代謝或者排泄掉。因此，對(duì)殺菌和在醫(yī)療領(lǐng)域中各種菌類炎癥的治療的意義是不言而喻的。
同時(shí)本發(fā)明還提供了保持殺菌劑活性的輔料，所提供的輔料絕大部分為人體能夠吸收和代謝的天然糖類、脂類等物質(zhì)，對(duì)人體沒(méi)有任何毒副作用，但能夠明顯延長(zhǎng)配方中殺菌物質(zhì)的存活性。可能的作用機(jī)理為：殺菌物質(zhì)主要為蛋白質(zhì)類的生物大分子，蛋白質(zhì)的水溶液中，蛋白質(zhì)分子均被一層水膜包圍保護(hù)著，這層薄薄的水膜是維持其結(jié)構(gòu)和功能必不可少的物質(zhì)基礎(chǔ)；干燥脫水時(shí)水膜的除去，將導(dǎo)致這些大分子物質(zhì)發(fā)生不可逆變化，如蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化等；干燥過(guò)程中或者在溶液狀態(tài)長(zhǎng)時(shí)間放置時(shí)，如果加入本發(fā)明中的輔料，則這些具有高效氫鍵供體輔料小分子取代蛋白質(zhì)周圍的水膜中的水分子，與蛋白質(zhì)形成氫鍵，使蛋白質(zhì)在缺水條件下或溶液狀態(tài)長(zhǎng)時(shí)間放置時(shí)仍能保持原有的空間結(jié)構(gòu)，而不喪失活性。
本發(fā)明所使用的緩沖液，與人體等滲，對(duì)殺菌物質(zhì)的活性起到輔助保護(hù)的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一組天然殺菌/抗菌劑。
所述天然殺菌/抗菌劑包含一組殺菌/抗菌物，輔料，及基質(zhì)溶液。
殺菌/抗菌物為溶菌酶、溶葡球菌酶、Iseganan、Indolicidin、Omiganan、Neuprex、乳酸鏈球菌素(Nisin)、比辛(Bisin)、桿菌肽(bacitracin)等中的一種或多種組合。其中溶菌酶可以為蛋清溶菌酶、重組制備的溶菌酶；溶葡球菌酶可以從sigma公司購(gòu)買或基因重組制備；Iseganan、Indolicidin、Omiganan、Neuprex、乳酸鏈球菌素(Nisin)、比辛(Bisin)、桿菌肽(bacitracin)可以從菌類基因重組提取或者化學(xué)合成。
輔料為聚乙二醇系列、聚乙烯醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、纖維二糖、龍膽二糖、棉籽糖、龍膽三糖、松三糖、水蘇糖、環(huán)糊精、乙二醇、丙二醇、甘油、肌醇、甘露醇、山梨醇、赤蘚醇、半乳糖醇、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸中的一種或多種組合。
基質(zhì)溶液選用接近生理pH值和滲透壓的緩沖溶液，如PBS緩沖液、Tris緩沖液、Hanks溶液、Earle溶液中的一種。
本發(fā)明的殺菌/抗菌劑包括但不限于如下組成(均為每升溶液)。
組成一：
溶菌酶：0.01-100g；
聚乙二醇4000：0.01-100g；
PBS緩沖液：余量。
優(yōu)選：
溶菌酶：0.1-10g；
聚乙二醇4000：0.1-10g；
PBS緩沖液：余量。
組成二：
溶葡球菌酶：0.001-20g；
甘油：0.001-20g；
Tris緩沖液：余量。
優(yōu)選：
溶葡球菌酶：0.01-2g；
甘油：0.01-2g；
Tris緩沖液：余量。
組成三：
比辛：0.001-20g；
Hanks溶液：余量。
優(yōu)選：
比辛：0.01-2g；
Hanks溶液：余量。
組成四：
Omiganan：0.001-20g；
環(huán)糊精：0.001-20g；
甘露醇：0.001-20g；
Earle溶液：余量。
優(yōu)選；
Omiganan：0.01-2g；
環(huán)糊精：0.01-2g；
甘露醇：0.01-2g；
Earle溶液：余量。
組成五：
溶菌酶：0.01-100g；
Iseganan：0.001-10g；
聚乙二醇2000：0.01-100g；
PBS緩沖液：余量。
優(yōu)選：
溶菌酶：0.1-10g；
Iseganan：0.01-1g；
聚乙二醇2000：0.1-10g；
PBS緩沖液：余量。
組成六：
溶菌酶：0.01-100g；
比辛：0.001-10g；
聚乙烯醇17-92：0.01-100g；
肌醇：0.01-100g；
Tris緩沖液：余量。
優(yōu)選：
溶菌酶：0.1-10g；
比辛：0.01-1g；
聚乙烯醇17-92：0.1-10g；
肌醇：0.1-10g；
Tris緩沖液：余量。
組成七：
溶菌酶：0.001-20g；
桿菌肽：0.001-10g；
聚乙二醇2000：0.001-20g；
甘油：0.001-20g；
Hanks溶液：余量。
優(yōu)選：
溶菌酶0.01-2g；
桿菌肽：0.01-1g；
聚乙二醇2000：0.01-2g；
甘油：0.01-2g；
Hanks溶液：余量。
組成八：
溶葡球菌酶：0.001-20g；
Indolicidin：0.001-10g；
甘油：0.001-20g；
蔗糖：0.001-20g；
Hanks溶液：余量。
優(yōu)選：
溶葡球菌酶：0.01-2g；
Indolicidin：0.01-1g；
甘油：0.01-2g；
蔗糖：0.01-2g；
Hanks溶液：余量。
組成九：
Omiganan：0.001-10g；
Neuprex：0.001-10g；
乳糖：0.001-20g；
亞麻酸：0.001-20g；
Earle溶液：余量。
優(yōu)選：
Omiganan：0.01-1g；
Neuprex：0.01-1g；
乳糖：0.01-2g；
亞麻酸：0.01-2g；
Earle溶液：余量。
組成十：
溶菌酶：0.01-100g；
溶葡球菌酶：0.001-10g；
聚乙二醇：0.01-100g；
棉籽糖：0.01-100g；
龍膽三糖：0.01-100g；
Earle溶液：余量。
優(yōu)選：
溶菌酶：0.1-10g；
溶葡球菌酶：0.01-1g；
聚乙二醇：0.1-10g；
棉籽糖：0.1-10g；
龍膽三糖：0.1-10g；
Earle溶液：余量。
組成十一：
溶葡球菌酶：0.001-10g；
Iseganan：0.001-10g；
乳酸鏈球菌素：0.001-10g；
海藻糖：0.001-30g；
水蘇糖：0.001-30g；
亞油酸：0.001-30g；
Earle溶液：余量。
優(yōu)選：
溶葡球菌酶：0.01-1g；
Iseganan：0.01-1g；
乳酸鏈球菌素：0.01-1g；
海藻糖：0.01-3g；
水蘇糖：0.01-3g；
亞油酸：0.01-3g；
Earle溶液：余量。
組成十二：
溶葡球菌酶：0.001-10g；
溶菌酶：0.01-100g；
比辛：0.001-10g；
環(huán)糊精：0.01-30g；
PBS緩沖液：余量。
優(yōu)選：
溶葡球菌酶：0.001-1g；
溶菌酶：0.01-20g；
比辛：0.001-1g；
環(huán)糊精：0.01-20g；
PBS緩沖液：余量。
組成十三：
溶葡球菌酶：0.001-10g；
溶菌酶：0.01-100g；
乳酸鏈球菌素：0.001-10g；
纖維二糖：0.01-100g；
PBS緩沖液：余量。
優(yōu)選：
溶葡球菌酶：0.001-1g；
溶菌酶：0.01-20g；
乳酸鏈球菌素：0.001-1g；
纖維二糖：0.01-20g；
PBS緩沖液：余量。
組成十四：
溶葡球菌酶：0.001-10g；
溶菌酶：0.01-100g；
Omiganan：0.001-10g；
海藻糖：0.01-100g；
PBS緩沖液：余量。
優(yōu)選：
溶葡球菌酶：0.001-1g；
溶菌酶：0.01-20g；
Omiganan：0.001-1g；
海藻糖：0.01-20g；
PBS緩沖液：余量。
組成十五：
溶葡球菌酶：0.001-10g；
溶菌酶：0.01-100g；
Indolicidin：0.001-10g；
比辛：0.001-10g；
龍膽二糖：0.01-100g；
丙二醇：0.01-100g；
PBS緩沖液：余量。
優(yōu)選：
溶葡球菌酶：0.001-1g；
溶菌酶：0.01-20g；
Indolicidin：0.001-1g；
比辛：0.001-1g；
龍膽二糖：0.01-20g；
丙二醇：0.01-20g；
PBS緩沖液：余量。
本文雖然已經(jīng)給出了本發(fā)明的一些實(shí)施例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本文的實(shí)施例進(jìn)行改變。上述實(shí)施例只是示例性的，不應(yīng)以本文的實(shí)施例作為本發(fā)明權(quán)利范圍的限定。
具體實(shí)施方式
各實(shí)施例組成及殺菌效果見(jiàn)表1。
實(shí)施例一至四的組成為單一殺菌/抗菌劑，其殺菌效果只對(duì)某種菌效果明顯，或?qū)θN菌都有效，但效果只是良好。其中實(shí)施例一和實(shí)施例二中的組成對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅效果優(yōu)良，因此更適合用于金黃色葡萄球菌感染。
實(shí)施例五至十的組成為含兩種殺菌/抗菌劑，殺菌效果比單一殺菌/抗菌劑明顯增加，對(duì)三種菌的殺菌效果都較明顯。
實(shí)施例十一至十五的組成為含三種或三種以上殺菌/抗菌劑，其殺菌效果對(duì)三種菌(涵蓋革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、細(xì)菌、真菌等)的殺滅效果均非常明顯。而且顯著降低單組份殺菌/抗菌劑的使用量，成本也能顯著降低。
中和劑為：0.5％硫代硫酸鈉+2％吐溫-80+0.5％卵磷脂。
表1各種組成的殺菌/抗菌劑的殺菌效果數(shù)據(jù)表
經(jīng)過(guò)54℃在恒溫箱內(nèi)放置14天后的穩(wěn)定性試驗(yàn)見(jiàn)表2。
結(jié)果表明，實(shí)施例十的配方經(jīng)過(guò)放置后，殺菌效果只有很少的降低，而實(shí)施例十六的配方為實(shí)施例十中不加輔料和緩沖液而用水代替，殺菌效果已經(jīng)不是很明顯。
同樣實(shí)施例十五的配方經(jīng)過(guò)放置后，殺菌效果幾乎沒(méi)有降低，而實(shí)施例十七的配方為實(shí)施例十五中不加輔料和緩沖液而用水代替，殺菌效果也已經(jīng)不是很明顯。
表2部分配方的穩(wěn)定性試驗(yàn)