本發(fā)明涉及用于癌癥的給藥系統(tǒng)，更具體地說，涉及一種硫酸長春新堿脂質(zhì)體及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

硫酸長春新堿(vincristinesulfate，vcr)是夾竹桃科植物長春花生物堿類的細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥物，抗腫瘤作用靶點(diǎn)是微管，主要抑制微管蛋白的聚合而影響紡錘體微管的形成，使有絲分裂停止于中期。和其它長春花生物堿類一樣，vcr對于許多淋巴組織的惡性腫瘤，包括侵襲性非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴細(xì)胞白血病，有著很好的治療效果。臨床主要應(yīng)用于急性白血病、惡性淋巴瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、慢性淋巴細(xì)胞白血病等疾病的治療。雖然vcr抗腫瘤效果好，但vcr制劑體內(nèi)代謝迅速、半衰期短、神經(jīng)毒性大、胃腸道反應(yīng)和骨髓抑制作用嚴(yán)重，vcr在臨床上的應(yīng)用受到限制。因此，迫切需要研發(fā)新型靶向藥物制劑，降低vcr的毒副作用、提高白血病的治療效果。

脂質(zhì)體(liposome)，由磷脂或其他類脂化合物形成的具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊泡，是一種性質(zhì)穩(wěn)定、在血液循環(huán)中具有長效半衰期的非病毒載體。將抗腫瘤藥物包封在脂質(zhì)體中，不僅可以保護(hù)藥物在進(jìn)入病灶部位前免受機(jī)體酶的分解，延長藥物循環(huán)時(shí)間，增加藥物在病灶部位的濃度和作用時(shí)間，提高療效，降低毒性；而且和其它傳遞系統(tǒng)相比，脂質(zhì)體能夠提供優(yōu)越的生物相溶性、生物可降解性、低毒性、尺寸可控性及表面功能可修飾性。

雖然硫酸長春新堿的脂質(zhì)體制劑傳遞藥物的高效性，降低了硫酸長春新堿的毒副作用，增強(qiáng)了癌癥的治療效果。但是以傳統(tǒng)的卵磷脂、膽固醇制備的常規(guī)脂質(zhì)體在體內(nèi)多被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(reticuloendothelialsystem，res)吞噬，在血液循環(huán)中駐留時(shí)間較短，并且其物理化學(xué)穩(wěn)定性差，儲存和應(yīng)用過程中容 易發(fā)生融合聚集，包封藥物容易泄漏，難以抵抗體內(nèi)的化學(xué)和生物的降解，因而也不適于制備尺寸較小的納米顆粒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對常規(guī)磷脂制備的硫酸長春新堿脂質(zhì)體穩(wěn)定性不高的缺陷，提供一種使用鞘磷脂制備的硫酸長春新堿脂質(zhì)體及制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：構(gòu)造一種硫酸長春新堿脂質(zhì)體，由硫酸長春新堿以及使用鞘磷脂制備的納米脂質(zhì)體組成，其中所述硫酸長春新堿包裹在所述納米脂質(zhì)體中。

在根據(jù)本發(fā)明所述的硫酸長春新堿脂質(zhì)體中，所述使用鞘磷脂制備的納米脂質(zhì)體包括鞘磷脂、磷脂穩(wěn)定劑和膽固醇類成分；其中，所述磷脂穩(wěn)定劑選自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇和磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇中的一種或多種。

在根據(jù)本發(fā)明所述的硫酸長春新堿脂質(zhì)體中，所述硫酸長春新堿脂質(zhì)體的粒徑為100-120nm。

在根據(jù)本發(fā)明所述的硫酸長春新堿脂質(zhì)體中，所述硫酸長春新堿脂質(zhì)體還包括通過化學(xué)鍵連接在所述納米脂質(zhì)體上用于特異識別腫瘤細(xì)胞的核酸適配體；所述核酸適配體為sgc8、a10、s2.2、as1411或tls11a。

在根據(jù)本發(fā)明所述的硫酸長春新堿脂質(zhì)體中，優(yōu)選地，所述核酸適配體為sgc8，使用鞘磷脂制備的納米脂質(zhì)體包括以下成分：鞘磷脂、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇、膽固醇和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-馬來酰亞胺交聯(lián)物。

本發(fā)明還提供了一種硫酸長春新堿脂質(zhì)體的制備方法，該制備方法包括：

s1、將鞘磷脂、膽固醇類成分和磷脂穩(wěn)定劑按摩爾比為50-60：35-45：4-6溶解在有機(jī)溶劑中制備空白脂質(zhì)體；

s2、使用步驟s1的空白脂質(zhì)體制備包裹硫酸長春新堿的脂質(zhì)體；

s3、將核酸適配體連接至包裹硫酸長春新堿的脂質(zhì)體上，制備硫酸長春 新堿脂質(zhì)體。

在根據(jù)本發(fā)明所述的硫酸長春新堿脂質(zhì)體的制備方法中，所述步驟s1具體為：將鞘磷脂成分、膽固醇類成分和磷脂穩(wěn)定劑按摩爾比為50-60：35-45：4-6溶解在氯仿中的混合，在50-70℃下以轉(zhuǎn)速為100-200rpm/min旋轉(zhuǎn)并抽真空形成干燥的脂質(zhì)薄膜，去除有機(jī)溶劑；所述脂質(zhì)薄膜分散在枸櫞酸緩沖液中，在液氮和50-60℃水浴反復(fù)凍融多次，并經(jīng)過粒徑篩選后得到空白脂質(zhì)體。

在根據(jù)本發(fā)明所述的硫酸長春新堿脂質(zhì)體的制備方法中，所述步驟s1中將鞘磷脂、膽固醇類成分、磷脂穩(wěn)定劑和功能性磷脂按摩爾比為50-60：35-45：4-5：0.2-0.4溶解在有機(jī)溶劑中制備空白脂質(zhì)體；且所述方法還包括：s3、在步驟s2制備的硫酸長春新堿脂質(zhì)體的溶液中按照核酸適配體sgc8和功能性磷脂的摩爾比為1：5-1：10加入核酸適配體sgc8，氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下室溫反應(yīng)，并透析洗滌多余的功能性磷脂、硫酸長春新堿和核酸適配體sgc8，得到連接核酸適配體sgc8的硫酸長春新堿脂質(zhì)體。

本發(fā)明還提供了一種治療和/或預(yù)防腫瘤藥物，該治療和/或預(yù)防腫瘤藥物的活性成分為如前所述的硫酸長春新堿脂質(zhì)體。

本發(fā)明還提供了如前所述的硫酸長春新堿脂質(zhì)體在治療和/或預(yù)防腫瘤中的應(yīng)用。

實(shí)施本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質(zhì)體及制備方法和應(yīng)用，具有以下有益效果：本發(fā)明使用鞘磷脂來制備納米脂質(zhì)體，并包裹硫酸長春新堿得到硫酸長春新堿脂質(zhì)體，其中鞘磷脂含有較多的酰胺鍵能夠更好地抵抗化學(xué)和生物的降解，保護(hù)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，提高腫瘤細(xì)胞的藥物富集量，從而提高抗腫瘤效果。

附圖說明

下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：

圖1為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的硫酸長春新堿脂質(zhì)體的制備方法圖；

圖2為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的硫酸長春新堿脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3a-c分別為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的硫酸長春新堿脂質(zhì)體各個(gè)階段顆 粒的透射電鏡圖；

圖4為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的硫酸長春新堿脂質(zhì)體各個(gè)階段顆粒的粒徑分布圖；

圖5為cem細(xì)胞與sgc8/vcr-lipo和vcr-lipo的結(jié)合實(shí)驗(yàn)圖；

圖6為荷瘤小鼠在不同的存活率時(shí)距接種腫瘤的時(shí)間圖；

圖7為不同處理的荷瘤balb/c裸鼠的腫瘤大小圖；

圖8為硫酸長春新堿脂質(zhì)體的體內(nèi)靶向作用圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。

本發(fā)明提供了一種硫酸長春新堿脂質(zhì)體，由硫酸長春新堿以及使用鞘磷脂制備的納米脂質(zhì)體組成，其中硫酸長春新堿包裹在納米脂質(zhì)體中。本發(fā)明中主要用鞘磷脂制備納米脂質(zhì)體，其成分包括鞘磷脂、磷脂穩(wěn)定劑和膽固醇類成分。其中鞘磷脂作為一種磷脂，與膽固醇類成分一起共同構(gòu)成脂質(zhì)體的基礎(chǔ)物質(zhì)。該膽固醇類成分選自膽固醇及其衍生物、膽甾烷、膽酸和膽汁酸中的一種或多種。膽固醇類成分具有調(diào)節(jié)膜流動性的作用，因此被稱為脂質(zhì)體的“流動性緩沖劑”。磷脂主要由一個(gè)磷酸基團(tuán)和一個(gè)季銨鹽基團(tuán)組成的親水性基團(tuán)，以及由兩個(gè)較長的烴基組成的親脂性基團(tuán)。使用的磷脂類可以是天然磷脂，也可以是合成磷脂。天然磷脂主要以卵磷脂，又名磷脂酰膽堿(pc)為主，主要來源于蛋黃磷脂和大豆磷脂，顯中性。合成磷脂主要有二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(dspc)等，這些均屬氫化磷脂類。本發(fā)明中選用鞘磷脂(sphingomyelin)來替代常規(guī)的磷脂，這是因?yàn)榍柿字休^多的酰胺鍵連接的脂肪鏈，能更好地抵抗化學(xué)和生物的降解，保護(hù)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

前述磷脂穩(wěn)定劑也稱為mpeg化磷脂或mpeg磷脂，其加入可使由鞘磷脂和膽固醇類成分構(gòu)成的普通脂質(zhì)體成為空間穩(wěn)運(yùn)脂質(zhì)體、隱形脂質(zhì)體或長循環(huán)脂質(zhì)體。該磷脂穩(wěn)定劑選自二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇 (dspe-peg)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dmpe-peg)和磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(pe-peg)中的一種或多種。

本發(fā)明還提供了一種治療和/或預(yù)防腫瘤藥物，該治療和/或預(yù)防腫瘤藥物的活性成分為本發(fā)明中所述的硫酸長春新堿脂質(zhì)體。本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質(zhì)體在治療和/或預(yù)防腫瘤中具有應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明還特別針對鞘磷脂提供了適用的硫酸長春新堿脂質(zhì)體的制備步驟和參數(shù)，這是因?yàn)椴煌字幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和親水性等有所不同，并且包裹的藥物性能不同，導(dǎo)致現(xiàn)有技術(shù)中其它磷脂制備包裹抗腫瘤藥物的步驟和參數(shù)并不完全適用于本發(fā)明。請參閱圖1，為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的硫酸長春新堿脂質(zhì)體的制備方法，可以制備出如前所述的硫酸長春新堿脂質(zhì)體。如圖所示，該制備方法包括：

首先，在步驟s1中，將鞘磷脂成分、膽固醇類成分和磷脂穩(wěn)定劑按摩爾比為50-60：35-45：4-6溶解在有機(jī)溶劑中制備空白脂質(zhì)體。優(yōu)選地，該步驟s1具體為：將鞘磷脂成分、膽固醇類成分和磷脂穩(wěn)定劑按摩爾比為50-60：35-45：4-6溶解在氯仿中的混合，在50-70℃下以轉(zhuǎn)速為100-200rpm/min旋轉(zhuǎn)并抽真空形成干燥的脂質(zhì)薄膜，去除有機(jī)溶劑；所述脂質(zhì)薄膜分散在枸櫞酸緩沖液中，在液氮和50-60℃水浴反復(fù)凍融多次，并經(jīng)過粒徑篩選后得到空白脂質(zhì)體，即使用鞘磷脂制備的納米脂質(zhì)體。更優(yōu)選地，鞘磷脂成分、膽固醇類成分和磷脂穩(wěn)定劑的摩爾比為55：40：5。

隨后，在步驟s2中，使用步驟s1的空白脂質(zhì)體制備包裹硫酸長春新堿的脂質(zhì)體。優(yōu)選地，該步驟s2具體為：將硫酸長春新堿和所述空白脂質(zhì)體按照質(zhì)量比1:9-11溶解，并調(diào)節(jié)水相ph為中性，放置在50-65℃水浴5-10分鐘，制得包裹硫酸長春新堿的脂質(zhì)體的溶液。進(jìn)一步通過冷凍干燥等方式可以得到本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質(zhì)體。

本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明方法，并使用鞘磷脂制備的納米脂質(zhì)體構(gòu)建的硫酸長春新堿脂質(zhì)體，與使用常規(guī)磷脂制備的硫酸長春新堿脂質(zhì)體相比，其性能更為穩(wěn)定，到達(dá)腫瘤局部的藥物濃度更高，且能夠有效延長荷瘤小鼠的生存時(shí)間。

請參閱圖2，為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的硫酸長春新堿脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)示意圖。該硫酸長春新堿脂質(zhì)體vcr-lipo，是由空白脂質(zhì)體(lipo)和硫酸長春新堿(vcr)構(gòu)成；該空白脂質(zhì)體為使用鞘磷脂制備的納米脂質(zhì)體，即peg長循環(huán)脂質(zhì)體。圖2中標(biāo)號1代表磷脂(lipid)即鞘磷脂，標(biāo)號2代表膽固醇(cholesterol)，標(biāo)號3代表dspe-peg2000。如圖所示，使用鞘磷脂制備的空白脂質(zhì)體與硫酸長春新堿(vcr)反應(yīng)后，對vcr進(jìn)行包裹。

該vcr-lipo的具體制備方法如下：

s1、peg長循環(huán)脂質(zhì)體(lipo)的制備：

將溶解在氯仿中的雞蛋鞘磷脂(sphingomyelin，sm)、膽固醇(cholesterol)和dspe-peg2000dspe-peg2000-mal按摩爾比50-60：35-45：4-6加入園底燒瓶中，在50-70℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，以轉(zhuǎn)速為100-200rpm/min旋轉(zhuǎn)并打開真空泵抽真空10-20min形成干燥薄膜，真空干燥儀過夜干燥以去除殘留的有機(jī)溶劑。

將瓶底的脂質(zhì)薄膜用lml300mm的枸櫞酸緩沖液(ph＝4.0)進(jìn)行水化，50-60℃水浴超聲20-30min后，在液氮、50-60℃水浴反復(fù)凍融4-6次。將產(chǎn)物裝入脂質(zhì)體擠推器，依次通過200nm、100nm的聚碳酸酯膜各15-25次，最后過50nm的聚碳酸酯膜15-25次，形成直徑在100nm左右的peg修飾的空白脂質(zhì)體(lipo)。

s2、包裹藥物脂質(zhì)體(vcr-lipo)的制備

按照硫酸長春新堿：空白脂質(zhì)體質(zhì)量比1:9-11，取0.5mg長春新堿溶液(1mg/ml)和對應(yīng)空白脂質(zhì)體，加入1mlna2hpo4溶液(500mmol/l，ph9.0)調(diào)節(jié)外水相ph為7.0-7.2，放置50-65℃水浴5-10分鐘，即制備硫酸長春新堿脂質(zhì)體vcr-lipo。

在本發(fā)明的另一些優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質(zhì)體還可進(jìn)一步包括通過化學(xué)鍵連接在納米脂質(zhì)體上用于特異識別腫瘤細(xì)胞的核酸適配體。這些核酸適配體為sgc8、a10、s2.2、as1411或tls11a。其中核酸適配體sgc8可以靶向識別白血病ccrf-cem腫瘤細(xì)胞，核酸適配體a10可以靶向識別前列腺腫癌細(xì)胞；核酸適配體s2.2和核酸適配體as1411可以靶向識別乳腺癌細(xì) 胞；核酸適配體tls11a可以靶向識別肝癌細(xì)胞。

本發(fā)明還相應(yīng)提供了上述連接核酸適配體時(shí)的硫酸長春新堿脂質(zhì)體的制備方法，其在步驟s1制備空白脂質(zhì)體的過程中需要加入一定量的功能化磷脂，具體為：將鞘磷脂成分、膽固醇類成分、磷脂穩(wěn)定劑和功能化磷脂按摩爾比為50-60：35-45：4-5：0.2-0.4溶解在氯仿中的混合，在50-70℃下以轉(zhuǎn)速為100-200rpm/min旋轉(zhuǎn)并抽真空形成干燥的脂質(zhì)薄膜，去除有機(jī)溶劑；所述脂質(zhì)薄膜分散在枸櫞酸緩沖液中，在液氮和50-60℃水浴反復(fù)凍融多次，并經(jīng)過粒徑篩選后得到空白脂質(zhì)體，即使用鞘磷脂制備的納米脂質(zhì)體。更優(yōu)選地，鞘磷脂成分、膽固醇類成分、磷脂穩(wěn)定劑和功能化磷脂的摩爾比為55：40：4.7：0.3。本發(fā)明所述功能化磷脂也稱為功能化peg磷脂，其peg一端與鞘磷脂連接，另一端被馬來酰亞胺基、竣基等修飾，除了使脂質(zhì)體具有空間穩(wěn)定、隱形或長循環(huán)的特點(diǎn)外，功能化peg磷脂所修飾的馬來酰亞胺基、竣基等可與核酸適配體靶頭連接使脂質(zhì)體具有主動靶向性。該功能性磷脂選自二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-馬來酰亞胺交聯(lián)物(dspe-peg-mal)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-羧基交聯(lián)物(dspe-peg-cooh)、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-n-琥珀酰亞胺(dspe-peg-nhs)和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-氨基交聯(lián)物(dspe-peg-nh2)中的一種或多種，根據(jù)所需連接的核酸適配體確定。

并且，上述連接核酸適配體時(shí)的硫酸長春新堿脂質(zhì)體的制備方法還包括步驟s3，將核酸適配體連接至硫酸長春新堿脂質(zhì)體上。優(yōu)選地，該步驟具體為在步驟s2硫酸長春新堿脂質(zhì)體的溶液中按照核酸適配體和功能性磷脂的摩爾比為1：5-1：10加入核酸適配體，氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下室溫反應(yīng)，并洗滌多余的功能性磷脂、硫酸長春新堿和核酸適配體，得到硫酸長春新堿脂質(zhì)體。本發(fā)明中特別針對鞘磷脂制備的納米脂質(zhì)體，研究了核酸適配體的優(yōu)化連接量，這是本發(fā)明的另一個(gè)獨(dú)特之處。這是因?yàn)樵谂c脂質(zhì)體結(jié)合時(shí)，過少的核酸適配體會影響納米載藥系統(tǒng)的靶向性，過多的適配體會影響納米載藥系統(tǒng)的穩(wěn)定性。因此本發(fā)明對核酸適配體的投入量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示核酸適配體和功能性磷脂的摩爾比為1：5-1：10范圍內(nèi)，所形成的脂質(zhì)體更加符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求的靶 向藥物傳遞系統(tǒng)。

本發(fā)明中以核酸適配體sgc8、硫酸長春新堿以及鞘磷脂制備的納米脂質(zhì)體構(gòu)成的硫酸長春新堿脂質(zhì)體最為穩(wěn)定，在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間長。該硫酸長春新堿脂質(zhì)體為靶向急性t淋巴細(xì)胞白血病的硫酸長春新堿脂質(zhì)體系統(tǒng)，其名稱縮寫為sgc8/vcr-lipo。其中使用鞘磷脂制備的納米脂質(zhì)體采用以下成分構(gòu)成：鞘磷脂、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)、膽固醇和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-馬來酰亞胺交聯(lián)物(dspe-peg-mal)。在其制備方法中，在步驟s1中將前述鞘磷脂、膽固醇類成分、磷脂穩(wěn)定劑和功能性磷脂按摩爾比為50-60：35-45：4-5：0.2-0.4溶解在有機(jī)溶劑中制備空白脂質(zhì)體；在步驟s3中：按照核酸適配體sgc8和功能性磷脂的摩爾比為1：5-1：10在硫酸長春新堿脂質(zhì)體的溶液中加入核酸適配體sgc8，氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下室溫反應(yīng)，并透析洗滌多余的功能性磷脂、硫酸長春新堿和核酸適配體sgc8，得到連接核酸適配體sgc8的硫酸長春新堿脂質(zhì)體。本發(fā)明還針對核酸適配體sgc8等獲取了優(yōu)化的連接量，其中核酸適配體和功能性磷脂的摩爾比優(yōu)選為1：9。

實(shí)施例1

該實(shí)施例1制備硫酸長春新堿脂質(zhì)體vcr-lipo。

s1、peg長循環(huán)脂質(zhì)體(lipo)的制備：

將溶解在氯仿中的雞蛋鞘磷脂(sphingomyelin，sm)、膽固醇(cholesterol)、和dspe-peg2000按摩爾比55：40：5加入園底燒瓶中，在60℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，以轉(zhuǎn)速為200rpm/min旋轉(zhuǎn)并打開真空泵抽真空10min形成干燥薄膜，真空干燥儀過夜干燥以去除殘留的有機(jī)溶劑。

其中sm為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為860061p；膽固醇為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為700100p；dspe-peg2000為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為880128p。

將瓶底的脂質(zhì)薄膜用lml300mm的枸櫞酸緩沖液(ph＝4.0)進(jìn)行水化，50℃水浴超聲20min后，在液氮、60℃水浴反復(fù)凍融5次。將產(chǎn)物裝入脂質(zhì)體擠推器，依次通過200nm、100nm的聚碳酸酯膜各20次，最后過50nm的聚 碳酸酯膜21次，形成直徑在100nm左右的peg修飾的空白脂質(zhì)體(lipo)。

s2、包裹藥物脂質(zhì)體(vcr-lipo)的制備

按照硫酸長春新堿：空白脂質(zhì)體質(zhì)量比1:10，取0.5mg長春新堿溶液(1mg/ml)和5mg空白脂質(zhì)體，加入1mlna2hpo4溶液(500mmol/l，ph9.0)調(diào)節(jié)外水相ph為7.0，放置60℃水浴10分鐘，即制備包裹硫酸長春新堿的納米脂質(zhì)體vcr-lipo。其中，硫酸長春新堿為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號為130501。

實(shí)施例2

該實(shí)施例2制備硫酸長春新堿脂質(zhì)體vcr-lipo。

s1、peg長循環(huán)脂質(zhì)體(lipo)的制備：

將溶解在氯仿中的雞蛋鞘磷脂(sphingomyelin，sm)、膽固醇(cholesterol)、和dspe-peg2000按摩爾比50：45：4加入園底燒瓶中，在70℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，以轉(zhuǎn)速為100rpm/min旋轉(zhuǎn)并打開真空泵抽真空20min形成干燥薄膜，真空干燥儀過夜干燥以去除殘留的有機(jī)溶劑。

其中原料sm、膽固醇和dspe-peg2000選用的產(chǎn)品與實(shí)施例1中相同。

將瓶底的脂質(zhì)薄膜用lml300mm的枸櫞酸緩沖液(ph＝4.0)進(jìn)行水化，60℃水浴超聲30min后，在液氮、50℃水浴反復(fù)凍融6次。將產(chǎn)物裝入脂質(zhì)體擠推器，依次通過200nm、100nm的聚碳酸酯膜各25次，最后過50nm的聚碳酸酯膜15次，形成直徑在100nm左右的peg修飾的空白脂質(zhì)體(lipo)。

s2、包裹藥物脂質(zhì)體(vcr-lipo)的制備

按照硫酸長春新堿：空白脂質(zhì)體質(zhì)量比1:9，取0.5mg長春新堿溶液(1mg/ml)和對應(yīng)空白脂質(zhì)體，加入1mlna2hpo4溶液(500mmol/l，ph9.0)調(diào)節(jié)外水相ph為7.2，放置65℃水浴5分鐘，即制備包裹硫酸長春新堿的納米脂質(zhì)體vcr-lipo。其中，硫酸長春新堿使用的產(chǎn)品與實(shí)施例1中相同。

實(shí)施例3

該實(shí)施例3制備硫酸長春新堿脂質(zhì)體vcr-lipo。

s1、peg長循環(huán)脂質(zhì)體(lipo)的制備：

將溶解在氯仿中的雞蛋鞘磷脂(sphingomyelin，sm)、膽固醇(cholesterol)、和dspe-peg2000按摩爾比60：35：4：6加入園底燒瓶中，在50℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，以轉(zhuǎn)速為200rpm/min旋轉(zhuǎn)并打開真空泵抽真空15min形成干燥薄膜，真空干燥儀過夜干燥以去除殘留的有機(jī)溶劑。

其中原料sm、膽固醇和dspe-peg2000選用的產(chǎn)品與實(shí)施例1中相同。

將瓶底的脂質(zhì)薄膜用lml300mm的枸櫞酸緩沖液(ph＝4.0)進(jìn)行水化，55℃水浴超聲25min后，在液氮、55℃水浴反復(fù)凍融4次。將產(chǎn)物裝入脂質(zhì)體擠推器，依次通過200nm、100nm的聚碳酸酯膜各15次，最后過50nm的聚碳酸酯膜25次，形成直徑在100nm左右的peg修飾的空白脂質(zhì)體(lipo)。

s2、包裹藥物脂質(zhì)體(vcr-lipo)的制備

按照硫酸長春新堿：空白脂質(zhì)體質(zhì)量比1:11，取0.5mg長春新堿溶液(1mg/ml)和對應(yīng)空白脂質(zhì)體，加入1mlna2hpo4溶液(500mmol/l，ph9.0)調(diào)節(jié)外水相ph為7.0，放置50℃水浴8分鐘，即制備包裹硫酸長春新堿的納米脂質(zhì)體vcr-lipo。其中，硫酸長春新堿使用的產(chǎn)品與實(shí)施例1中相同。

實(shí)施例4

該實(shí)施例4制備硫酸長春新堿脂質(zhì)體sgc8/vcr-lipo。

s1、peg長循環(huán)脂質(zhì)體(lipo)的制備：

將溶解在氯仿中的雞蛋鞘磷脂(sphingomyelin，sm)、膽固醇(cholesterol)、dspe-peg2000和dspe-peg2000-mal按摩爾比55：40：4.7：0.3加入園底燒瓶中，在60℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，以轉(zhuǎn)速為200rpm/min旋轉(zhuǎn)并打開真空泵抽真空10min形成干燥薄膜，真空干燥儀過夜干燥以去除殘留的有機(jī)溶劑。

其中sm為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為860061p；膽固醇為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為700100p；dspe-peg2000為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為880128p；dspe-peg2000-mal為avantipolarlipids公司產(chǎn)品，貨號為880126p。

將瓶底的脂質(zhì)薄膜用lml300mm的枸櫞酸緩沖液(ph＝4.0)進(jìn)行水化， 50℃水浴超聲20min后，在液氮、60℃水浴反復(fù)凍融5次。將產(chǎn)物裝入脂質(zhì)體擠推器，依次通過200nm、100nm的聚碳酸酯膜各20次，最后過50nm的聚碳酸酯膜21次，形成直徑在100nm左右的peg修飾的空白脂質(zhì)體(lipo)。

s2、包裹藥物脂質(zhì)體(vcr-lipo)的制備

按照硫酸長春新堿：空白脂質(zhì)體質(zhì)量比1:10，取0.5mg長春新堿溶液(1mg/ml)和5mg空白脂質(zhì)體，加入1mlna2hpo4溶液(500mmol/l，ph9.0)調(diào)節(jié)外水相ph為7.0，放置60℃水浴10分鐘，即制備包裹硫酸長春新堿的納米脂質(zhì)體vcr-lipo。其中，硫酸長春新堿為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號為130501。

s3、連接核酸適配體sgc8，制備sgc8/vcr-lipo；

根據(jù)核酸適配體和mal-peg2000-dspe的摩爾比為1：9范圍內(nèi)，取適量vcr-lipo，加入適量核酸適配體sgc8，在氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下室溫反應(yīng)24小時(shí)。該核酸適配體sgc8為上海生物工程公司合成，sgc8的核苷酸序列為5’-atctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttag(t)10-sh-3’。再加入2mm的β-半胱胺除去未反應(yīng)的mal基團(tuán)。用超濾離心管對sgc8/vcr-lipo進(jìn)行超濾離心后，10000rpm離心10min后，加入1ml去離子水，10000rpm離心10min，洗去游離的硫酸長春新堿、β-半胱胺和核酸適配體sgc8，得到硫酸長春新堿脂質(zhì)體sgc8/vcr-lipo。

實(shí)施例5

該實(shí)施例5制備硫酸長春新堿脂質(zhì)體a10/vcr-lipo。該實(shí)施例5與實(shí)施例4相同，只需將其中核酸適配體更換為a10即可。

實(shí)施例6

該實(shí)施例6制備硫酸長春新堿脂質(zhì)體s2.2/vcr-lipo。該實(shí)施例6與實(shí)施例4相同，只需將其中核酸適配體更換為s2.2即可。

實(shí)施例7

該實(shí)施例7制備硫酸長春新堿脂質(zhì)體as1411/vcr-lipo。該實(shí)施例7與實(shí)施例4相同，只需將其中核酸適配體更換為as1411即可。

實(shí)施例8

該實(shí)施例8制備硫酸長春新堿脂質(zhì)體tls11a/vcr-lipo。該實(shí)施例8與實(shí)施例4相同，只需將其中核酸適配體更換為tls11a即可。

本發(fā)明對上述各個(gè)實(shí)施例制備的硫酸長春新堿脂質(zhì)體進(jìn)行了載藥量、包封率、粒徑及對腫瘤細(xì)胞的靶向作用及治療作用的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明本發(fā)明中最終制得的硫酸長春新堿脂質(zhì)體的粒徑為100-120nm。這些硫酸長春新堿脂質(zhì)體具有良好的穩(wěn)定性，在體內(nèi)不易被化學(xué)和生物降解，能夠很好地靶向至目標(biāo)部位，且對靶向的腫瘤細(xì)胞具有很好的治療效果，尤其采用實(shí)施例1和4制備的產(chǎn)品效果最佳。下面以實(shí)施例1和4制備的硫酸長春新堿脂質(zhì)體vcr-lipo和sgc8/vcr-lipo為例對本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)效果進(jìn)行說明。

1、硫酸長春新堿藥物的包封率、載藥量計(jì)算

分別取0.3mlvcr-lipo和sgc8/vcr-lipo樣本加入超濾離心管，10000rpm離心10min后，加入1ml去離子水，10000rpm離心10min，洗去游離的vcr。

取超濾離心管濾上液，放入5ml容量瓶，加入250μl10％聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)，室溫放置20min，加入二次去離子水(millq)定容至5ml。吸取20μl，在上述色譜條件下注入液相色譜儀中，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算包入脂質(zhì)體的藥物含量。按照以下公式計(jì)算脂質(zhì)體的載藥量和包封率：

dlc(％)＝[脂質(zhì)體中藥物量/(脂質(zhì)體中藥物+載體總量)]×100％；

包封率dle(％)＝(脂質(zhì)體中包封的藥物/脂質(zhì)體中藥物總量)×100％。

實(shí)驗(yàn)測得本發(fā)明實(shí)施例1制得的sgc8/vcr-lipo的載藥量為14.16％，包封率為90.63％。vcr-lipo的載藥量為13.23％，包封率為91.07％。

2、粒徑檢測

請參閱圖3a-c，為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的硫酸長春新堿脂質(zhì)體各個(gè)階 段顆粒的透射電鏡圖。該實(shí)驗(yàn)中使用的透射電鏡為型號為h-7650的日立透射掃描電子顯微鏡，加速電壓為80kv，放大倍率為200000x。圖3a為空白脂質(zhì)體lipo，圖3b為包裹硫酸長春新堿的納米脂質(zhì)體vcr-lipo，圖3c為連接核酸適配體的硫酸長春新堿脂質(zhì)體sgc8/vcr-lipo。請結(jié)合參閱圖4，為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的硫酸長春新堿脂質(zhì)體各個(gè)階段顆粒的粒徑分布圖。其中，a為空白脂質(zhì)體lipo；b為vcr-lipo；c為sgc8/vcr-lipo。結(jié)果顯示，每種納米粒子的粒徑分布均呈現(xiàn)正態(tài)分布，空白脂質(zhì)體lipo的粒徑在90nm左右；vcr-lipo的粒徑在100nm左右；sgc8/vcr-lipo的粒徑在110nm左右。

3、硫酸長春新堿脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞的靶向作用

將實(shí)施例1和4的磷脂雙分子層中標(biāo)記細(xì)胞膜紅色熒光探針(dii)熒光染料,在核酸適配體sgc8上標(biāo)記異硫氰酸熒光素(fitc)熒光。分別得到fitc和dii同時(shí)標(biāo)記的sgc8/vcr-lipo，以及dii標(biāo)記的空白脂質(zhì)體lipo。

在15ml離心管中加入3×10⁶cem細(xì)胞，每管分別加入dii標(biāo)記的lipo、sgc8/vcr-lipo(核酸適配體的終濃度控制在200nm)，37℃孵育20-30min。離心收集細(xì)胞并用pbs洗3次。用多聚甲醛(4％)固定30min后用pbs洗3次。細(xì)胞用1mg/mldapi染核5分鐘，用pbs洗3次并離心收集細(xì)胞。在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度并拍照。

請參閱圖5，為cem細(xì)胞與sgc8/vcr-lipo和vcr-lipo的結(jié)合實(shí)驗(yàn)圖。其中dapi為4',6-二脒基-2-苯基吲哚，用于染細(xì)胞核，呈藍(lán)色熒光；dii用于標(biāo)記脂質(zhì)體，呈紅色熒光；fitc用于標(biāo)記核酸適配體sgc8，呈綠色熒光；merge表示帶有熒光的納米材料與不同細(xì)胞結(jié)合合并的熒光。圖5中a為sgc8/vcr-lipo與cem細(xì)胞孵育后的熒光圖；b為vcr-lipo與cem細(xì)胞孵育后的熒光圖；c為con/vcr-lipo與cem細(xì)胞孵育后的熒光圖；con代表對照適配體，其與核酸適配體sgc8具有相同堿基數(shù)的dna序列，但是與靶細(xì)胞不結(jié)合。

4、硫酸長春新堿脂質(zhì)體對腫瘤的治療作用

分別將vcr、vcr-lipo和sgc8/vcr-lipo用pbs溶解或懸浮，得到vcr濃度均為1.0ng/μl的vcr注射液、vcr-lipo注射液和sgc8/vcr-lipo注射液。

取4-6周齡的近交系雌性裸鼠(balb/cnudemice)，每只于左前肢腋窩皮下接種1×10⁷個(gè)ccrf-cem(人急性淋巴細(xì)胞白血病t淋巴細(xì)胞)。該近交系雌性裸鼠(balb/cnudemice)為上海邦耀生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。ccrf-cem腫瘤細(xì)胞為由湖南大學(xué)譚蔚泓教授饋贈。取一批30只荷瘤裸鼠，隨機(jī)分成五組，其中一組每只荷瘤balb/c裸鼠的尾靜脈中注射200μlsgc8/vcr-lipo進(jìn)行治療，將第一次注射記為治療第0天，分別在治療第3天、治療第6天和治療第9天均注射200μl上述sgc8/vcr-lipo注射液，共處理6只荷瘤balb/c裸鼠。

按照上述方法，分別將sgc8/vcr-lipo注射液替換為pbs、vcr注射液、vcr-lipo注射液和sgc8-lipo注射液，其他步驟均不變，分別得到pbs治療的荷瘤小鼠、vcr治療的荷瘤小鼠、vcr-lipo治療的荷瘤小鼠、sgc8-lipo治療的荷瘤小鼠。從治療第1天開始記錄每組荷瘤balb/c裸鼠的存活時(shí)間，統(tǒng)計(jì)存活率參見圖6和表格1。表格1為荷瘤小鼠在不同的存活率時(shí)距接種腫瘤的時(shí)間(天)。

表格1

結(jié)果顯示，vcr-lipo和sgc8/vcr-lipo能明顯延長荷瘤balb/c裸鼠的生存時(shí)間。vcr-lipo在治療的荷瘤balb/c裸鼠存活率為50％時(shí)距第1次治療的時(shí)間分別為pbs、sgc8/lipo和vcr的治療的荷瘤小鼠存活率為50％時(shí)距第1次治療的時(shí)間的1.78倍、1.64倍和1.08倍。在sgc8/vcr-lipo治療的荷瘤balb/c裸鼠存活率為50％時(shí)距第1次治療的時(shí)間分別為pbs、sgc8/lipo、vcr、vcr-lipo的治療的荷瘤小鼠存活率為50％時(shí)距第1次治療的時(shí)間的2.18倍、2.0倍、1.32倍和1.22倍。

圖7為不同處理的荷瘤balb/c裸鼠的腫瘤大小。圖7中為開始治療后的第十天，處死老鼠，取出腫瘤的拍攝照片之后的樣品圖，每組取5個(gè)樣品，通過游標(biāo)卡尺測量其腫瘤體積。圖8為硫酸長春新堿脂質(zhì)體的體內(nèi)靶向作用圖，分別在0.5h、2h、6h、12h、24h、36h、48h、72h和96h分別對處理后的荷瘤balb/c裸鼠進(jìn)行活體成像拍攝，腫瘤區(qū)域?yàn)橛疑现巢?。?shí)驗(yàn)證明，vcr-lipo處理的荷瘤balb/c裸鼠在腫瘤處的熒光強(qiáng)度明顯高于dir組。并且，本發(fā)明的sgc8修飾的硫酸長春新堿脂質(zhì)體sgc8/vcr-lipo對腫瘤有靶向作用：熒光標(biāo)記的sgc8/vcr-lipo處理的荷瘤balb/c裸鼠在腫瘤處的熒光強(qiáng)度明顯高于熒光標(biāo)記的vcr-lipo處理的荷瘤balb/c裸鼠在腫瘤處的熒光強(qiáng)度。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質(zhì)體vcr-lipo和sgc8/vcr-lipo具有很好的抗腫瘤效果，可明顯抑制腫瘤生長，延長荷瘤balb/c裸鼠的生存時(shí)間。

綜上所述，本發(fā)明制備的硫酸長春新堿脂質(zhì)體具有以下特點(diǎn)：

(1)本發(fā)明在制備脂質(zhì)體過程中，選擇了含有較多的酰胺鍵連接脂肪鏈的鞘磷脂，與其它常用的磷脂相比，其能更好地抵抗化學(xué)和生物的降解，保護(hù)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，即使制備的硫酸長春新堿脂質(zhì)體粒徑為100nm左右時(shí)也能維持到達(dá)靶向部位的藥物濃度；

(2)本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質(zhì)體可選擇是否連接核酸適配體，并且當(dāng)連接時(shí)對核酸適配體例如sgc8的連接濃度的優(yōu)化，不僅保證了脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)的穩(wěn)定，而且最大程度增加了該系統(tǒng)的靶向性；

(3)本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質(zhì)體的制備方法簡單，可大規(guī)模制備；

(4)本發(fā)明在制備納米脂質(zhì)體時(shí)加入了peg2000，使得納米藥物傳遞系統(tǒng)在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間長；

(5)本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質(zhì)體可以實(shí)現(xiàn)對腫瘤的靶向，提高腫瘤細(xì)胞的藥物富集量，從而提高抗腫瘤效果。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的硫酸長春新堿脂質(zhì)體能抑制腫瘤的生長，并能延長荷瘤動物的存活時(shí)間，可用來治療腫瘤。

本發(fā)明是根據(jù)特定實(shí)施例進(jìn)行描述的，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明白在不脫離本發(fā)明范圍時(shí)，可進(jìn)行各種變化和等同替換。此外，為適應(yīng)本發(fā)明技術(shù)的特 定場合或材料，可對本發(fā)明進(jìn)行諸多修改而不脫離其保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明并不限于在此公開的特定實(shí)施例，而包括所有落入到權(quán)利要求保護(hù)范圍的實(shí)施例。