本發(fā)明涉及一種植物提取物的醫(yī)藥新用途，迷迭香提取物在制備治療糖尿病腎病藥物中的應(yīng)用，屬于天然藥物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來，隨著社會(huì)進(jìn)步、生活改善和膳食結(jié)構(gòu)改變，糖尿病的發(fā)病率逐年增長(zhǎng)，低齡化趨勢(shì)加劇。糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病人的最重要的合并癥之一，最終有可能發(fā)展成高致死率的終末期腎病(End stage renal disease，ESRD)。在我國(guó)DN是終末期腎病的第二大病因，而在西方國(guó)家，DN早已成為終末期腎病發(fā)病的首要因素。糖尿病腎病是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。由于其存在復(fù)雜的代謝紊亂，一旦發(fā)展到終末期腎臟病，往往比其他腎臟疾病的治療更加棘手，因此及時(shí)防治對(duì)于延緩糖尿病腎病的意義重大。

近些年隨著DN發(fā)病率的增高，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究也取得了較大的進(jìn)展。一般認(rèn)為主要由遺傳因素、腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變、生化代謝紊亂、氧化應(yīng)激損傷、高血壓、細(xì)胞生長(zhǎng)因子異常增多和血管活性物質(zhì)代謝異常等多種原因相互影響共同導(dǎo)致DN的發(fā)生。

糖尿病病人臨床上出現(xiàn)腎臟損害應(yīng)考慮糖尿病腎病，家族中有腎臟病者、明顯高血壓、胰島素抵抗，腎小球率過濾(Glomerular filtration rate，GFR)明顯過高或伴嚴(yán)重高血壓者為發(fā)生糖尿病腎病的高危因素。糖尿病臨床表現(xiàn)主要分為5期，分別是腎小球肥大高功能期、無臨床癥狀腎損害期、糖尿病腎病早期、顯性蛋白尿腎病期、腎功能衰竭期。

臨床糖尿病腎病診斷主要為糖尿病患者持續(xù)性蛋白尿＞0.5g/24h，早期糖尿病腎病的尿蛋白量為0.15-0.5g/24h，尿白蛋白排泄率為15-200μg/min。診斷較困難者，應(yīng)結(jié)合其他器官的糖尿病微血管病損情況。必要時(shí)科進(jìn)行腎活檢。

目前糖尿病腎病沒有良好的針對(duì)性藥物。患者主要靠控制血糖、血壓，調(diào)節(jié)日常飲食以緩解癥狀。進(jìn)入終末期腎衰竭的患者則需要進(jìn)行透析和器官移植，但此舉并不能防止糖尿病腎病再發(fā)生。

迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)唇形科灌木，原產(chǎn)于地中海地區(qū)。中國(guó)科學(xué)院植物研究所于1981年成功地從西班牙引進(jìn)了迷迭香，成分主要為鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚、熊果酸、迷迭香酸等。迷迭香植物為常綠灌木，株直立，主莖高約1米(有時(shí)達(dá)2米)。葉狹細(xì)尖狀，長(zhǎng)約1厘米，形似彎曲的松針；深綠色，上面光亮，下面白色，葉緣向葉背卷曲，葉片發(fā)散松樹香味。

迷迭香具有鎮(zhèn)靜安神、醒腦作用，對(duì)消化不良和胃痛均有一定療效。也可用于治療失眠、心悸、頭痛、消化不良等多種疾病。外用可治療外傷和關(guān)節(jié)炎。還具有強(qiáng)壯心臟、促進(jìn)代謝、促進(jìn)末梢血管的血液循環(huán)等作用。同時(shí)還改善語(yǔ)言、視覺、聽力方面的障礙，增強(qiáng)注意力，治療風(fēng)濕痛，強(qiáng)化肝臟功能，降低血糖，有助于動(dòng)脈硬化的治療，幫助麻痹的四肢恢復(fù)活動(dòng)能力。近年來，迷迭香在糖尿病治療上也有所進(jìn)展，但是迷迭香石油醚提取物在糖尿病腎病方向上卻未曾有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了迷迭香石油醚提取物在制備治療糖尿病腎病的組合物中的應(yīng)用。

本發(fā)明公開了提取物為深綠色粉末或膏狀固體。

本發(fā)明公開了迷迭香石油醚提取物的組分是：鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚、表迷迭香酚、表異迷迭香酚、鼠尾酸甲酯、Salviol、1-Phenanthrenecarboxylic acid、2-Phenanthrenemethanol。

本發(fā)明公開了迷迭香石油醚提取物的組分是：迷迭香酚，鼠尾草酚，鼠尾草酸，鼠尾酸甲酯，Salviol。其相對(duì)質(zhì)譜峰面積比值為：2.23∶10.12∶39.64∶2.93∶32.32。(保留時(shí)間如表1.所示，質(zhì)譜圖如圖1.所示)

本發(fā)明公開了用于制備防治糖尿病腎病的組合物，迷迭香石油醚提取物的含量范圍是1mg-2g/mg。

本發(fā)明公開了的組合物，其制備為：藥物、保健品、或功能性食品，賦形劑或載體為制藥或食品領(lǐng)域中常用的賦形劑或載體，如稀釋劑，崩解劑，潤(rùn)滑劑等。

本發(fā)明公開了用于制備防治糖尿病腎病的組合物，迷迭香石油醚提取物的 制備方法是：醇提取迷迭香藥材，用水溶解醇提取物，用石油醚萃取水溶液，合并石油醚層，回收石油醚得迷迭香石油醚提取物。

本發(fā)明公開了用于制備防治糖尿病腎病的組合物，迷迭香石油醚提取物的制備方法是：

迷迭香藥材用乙醇提取，合并95％乙醇提取液，回收乙醇，浸膏加水使溶，加入石油醚，石油醚和溶液萃取多次，合并石油醚層，回收石油醚得迷迭香石油醚提取物。

迷迭香藥材用甲醇提取，合并甲醇提取液，回收甲醇，浸膏加水使溶，加入石油醚，石油醚和溶液按照萃取多次，合并石油醚層，回收石油醚得迷迭香石油醚提取物。

迷迭香藥材用正丁醇提取，合并正丁醇提取液，回收正丁醇，浸膏加水使溶，加入石油醚，石油醚和溶液萃取多次，合并石油醚層，回收石油醚得迷迭香石油醚提取物。

本發(fā)明公開了迷迭香石油醚提取物的制備方法是：迷迭香藥材用10倍量95％乙醇提取3次，1h/次，合并95％乙醇提取液，回收乙醇，浸膏加水使溶，加入石油醚，石油醚和溶液按照1；1萃取三次，合并石油醚層，回收石油醚得迷迭香石油醚提取物。

本發(fā)明公開了迷迭香石油醚提取物的制備方法是：迷迭香藥材用10倍量甲醇提取3次，1h/次，合并甲醇提取液，回收甲醇，浸膏加水使溶，加入石油醚，石油醚和溶液按照1；1萃取三次，合并石油醚層，回收石油醚得迷迭香石油醚提取物。

本發(fā)明公開了迷迭香石油醚提取物的制備方法是：迷迭香藥材用10倍量正丁醇提取3次，1h/次，合并正丁醇提取液，回收正丁醇，浸膏加水使溶，加入石油醚，石油醚和溶液按照1；1萃取三次，合并石油醚層，回收石油醚得迷迭香石油醚提取物。

基于上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明現(xiàn)已完成相關(guān)實(shí)驗(yàn)。為了便于理解，下面將通過附圖和具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。需要特別指出的是，具體實(shí)施例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修正或改變，這些修正和改變也將納入本發(fā)明范圍之內(nèi)。

附圖說明

圖1.迷迭香石油醚提取物HPLC-ESI-Q-TOF-MS總離子流圖

圖2.C57BL/6組、STZ+Vehicle組、STZ+Irbesartan組和STZ+PFR組對(duì)DN小鼠血糖的影響

圖3.C57BL/6組、STZ+Vehicle組、STZ+Irbesartan組和STZ+PFR組對(duì)DN小鼠尿白蛋白排泄率的影響

圖4.C57BL/6組、STZ+Vehicle組、STZ+Irbesartan組和STZ+PFR組對(duì)DN小鼠UAlb/UCr的影響

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

迷迭香石油醚提取物提取工藝

迷迭香藥材10倍量95％乙醇提取3次，1h/次，合并95％乙醇提取液，回收乙醇，浸膏加水使溶，加入石油醚，石油醚和溶液按照1；1萃取三次，合并石油醚層，回收石油醚得迷迭香石油醚提取物。

實(shí)施例2

迷迭香石油醚提取物成分鑒定

95％乙醇溶解迷迭香石油醚提取物10mg/ml，12，000rpm離心10min，取上清進(jìn)行液相分析，

采用Agilent 1290 UPLC-6520 QTOF MS，

流動(dòng)相為(A)0.1％甲酸水溶液和(B)乙腈.

流動(dòng)相洗脫程序?yàn)椋?/p>

10％B(0min)，

30％B(5min)，

50％B(10min)，

80％B(15min)，

100％B(25-30min).

流速為0.8ml/min.

質(zhì)譜干燥氣體溫度350℃，干燥氣體流速10L/h，霧化氣壓35psig，ESI離子源，電噴霧電壓3500v，裂解電壓120v，skimmer 65v，OCTIRF Vgp750v，掃描離子范圍100-1100.二級(jí)碰撞電壓20v；40v；70v。

質(zhì)譜鑒定結(jié)果如下表

能確定本發(fā)明公開了迷迭香石油醚提取物的組分是：鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚、表迷迭香酚、表異迷迭香酚、鼠尾酸甲酯、Salviol、1-Phenanthrenecarboxylic acid、2-Phenanthrenemethanol等化合物。

表1.迷迭香石油醚提取物質(zhì)譜表征

迷迭香酚，鼠尾草酚，鼠尾草酸，鼠尾酸甲酯，Salviol。其質(zhì)譜相對(duì)峰面積比值為：2.23∶10.12∶39.64∶2.93∶32.32(圖譜如圖1.所示)。

實(shí)施例3

提取物對(duì)C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病的治療作用實(shí)驗(yàn)研究

本實(shí)驗(yàn)所用英文縮寫詞如下。

英文縮寫詞表

英文縮寫 英文全稱 中文全稱

PFR Petroleum ether fraction of rosemary 迷迭香石油醚提取物

DN Diabetic nephropathy 糖尿病腎病

ESRD End-stage renal diseas 終末期腎病

FBG Fasting blood glucose 空腹血糖

STZ Streptozocin 鏈脲佐菌素

UAER Urinary albumin excretion rate 尿白蛋白排泄率

UAlb Urinary albumin 尿微量白蛋白

UCr Urinary creatinine 尿肌酐

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下

2.1實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠，雄性，體重20±2g，由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心提供，質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK-(蘇)2012-0004。

2.1.2藥品與試劑

微量白蛋白(m-Alb)測(cè)試盒(ELISA方法)南京建成生物研究所

批號(hào)：20150526

以下將迷迭香石油醚提取物簡(jiǎn)稱為PFR。

2.1.3實(shí)驗(yàn)儀器

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1藥物配制

飲食配方：正常小鼠飼料。

鏈脲佐菌素(STZ)溶液的配制：STZ于-20℃以下保存。臨用時(shí)以檸檬酸2.1g加入雙蒸水100mL中配成A液。檸檬酸鈉2.94g加入雙蒸水100mL中配成B液。A、B液按1∶1.32混合，pH計(jì)測(cè)定pH值，調(diào)節(jié)pH＝4.2-4.5，即是所需檸檬酸鈉緩沖液。臨用時(shí)將STZ用檬酸鈉緩沖液配制成3mg/ml的鏈脲佐菌素溶液，避光，30min內(nèi)注射完畢。

藥物配制：將PFR用0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配成7.72mg/ml的溶液。Irbesartan用0.5％的CMC-Na配成0.75mg/ml的溶液。

2.2.2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒓敖o藥方法

將38只C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后隨機(jī)分為正常組(12只)和模型組(26只)，每日喂食正常飲食。7d后，給予模型組連續(xù)腹腔注射STZ(60mg/kg)5d。2w后，尾尖取血，檢測(cè)空腹血糖。將空腹血糖值＞16mmol/L的小鼠列入糖尿病動(dòng)物。

將造模成功的糖尿病小鼠按血糖和體重隨機(jī)分為3組，即：STZ+Vehicle組(10只)、STZ+PFR(154.4mg/kg)組(5只)、STZ+Irbesartan組(9只)。另選12只正常組小鼠作為C57BL/6組。具體的給藥方案為：

各組動(dòng)物每日按照上述方案灌胃給藥，連續(xù)24w。實(shí)驗(yàn)前一周，收集尿液。將小鼠放入代謝籠中24h，不禁食不禁水，收集24h尿液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前12h禁食不禁水，用血糖儀測(cè)空腹血糖。

2.3觀察指標(biāo)及標(biāo)本采集

2.3.1一般指標(biāo)的觀察

監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)過程中各組小鼠的一般狀態(tài)、空腹血糖、體重、攝食及攝水量等變化。

2.3.2尿蛋白的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)前一周收集各組小鼠24h尿樣，留尿期間不禁食，不禁水，將小鼠放入洗凈的代謝籠內(nèi)，記錄尿量后取2ml，5000rpm離心1min，去除沉渣，分裝于EP管中，-80℃冰箱保存。用ELISA試劑盒檢測(cè)尿白蛋白濃度。

2.3.3尿肌酐的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)前一周收集各組小鼠24h尿樣，用試劑盒檢測(cè)尿中肌酐濃度。

2.4統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，P＜0.05為具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)

2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1一般狀態(tài)觀察

模型組小鼠腹腔注射STZ 14d后，一般狀態(tài)表現(xiàn)為：活動(dòng)減少；多飲，平均飲水量是C57BL/6組的三倍；多尿，墊料明顯潮濕，每日需更換1-2次，體 重逐漸下降，精神萎靡，毛色灰暗，粗糙。與STZ+Vehicle組比較，STZ+PFR組，STZ+Irbesartan組小鼠的飲水量、尿量增多，體重下降及精神狀態(tài)等均有所改善。

2.5.2 PFR對(duì)的影響

與C57BL/6組比較，24周后，STZ+Vehicle組小鼠血糖值均顯著升高(P＜0.001)。與STZ+Vehicle組比較，STZ+PFR組血糖值均顯著降低(P＜0.05)，STZ+Irbesartanl組血糖值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2.。

表2.實(shí)驗(yàn)C56BL/6小鼠空腹血糖(mM)

2.5.3 PFR對(duì)DN小鼠尿白蛋白排泄率的影響

與C57BL/6組比較STZ+Vehicle組尿白蛋白排泄率(UAER)均顯著升高(P＜0.001)。與STZ+Vehicle組比較，STZ+PFR組UAER顯著降低(P＜0.01)。STZ+Irbesartanl組UAER無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3.。

表3.實(shí)驗(yàn)C56BL/6小鼠尿白蛋白排泄率(μg/24h)

2.5.4 PFR對(duì)DN小鼠尿微量白蛋白與肌酐比值的影響

與C57BL/6組比較，STZ+Vehicle組尿微量白蛋白與肌酐比值(UAlb/UCr)均顯著升高(P＜0.001)。與STZ+Vehicle組比較，STZ+PFR組UAlb/UCr值顯著降低(P＜0.01)。STZ+Irbesartanl組UAlb/UCr值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4.。

表4.實(shí)驗(yàn)C56BL/6小鼠尿微量白蛋白與肌酐比值(μg/mg)

實(shí)施例4

迷迭香石油醚提取物的制劑

迷迭香石油醚提取物的片劑：迷迭香石油醚提取物10mg，淀粉88g，硬脂酸鎂3g

制備工藝：取實(shí)施例1的迷迭香石油醚提取物過100目篩，加淀粉、硬脂酸鎂混合均勻，制成顆粒，干燥，壓片，即得。

迷迭香石油醚提取物的膠囊

迷迭香石油醚提取物10mg，淀粉88g，硬脂酸鎂3g

制備工藝：取實(shí)施例1的迷迭香石油醚提取物過100目篩，加淀粉、硬脂酸鎂混合均勻，制成顆粒，干燥，裝膠囊，即得。

迷迭香石油醚提取物的軟膠囊

迷迭香石油醚提取物10mg，大豆卵磷脂100g

制備工藝：取實(shí)施例1的迷迭香石油醚提取物，加大豆軟磷脂，膠體磨混勻，抽真空，壓制，即得軟膠囊。

迷迭香石油醚提取物的凍干粉：

迷迭香石油醚提取物2.0g，亞硫酸鈉4.0g，乙醇50ml，加水定容至1000mL；

制備工藝：取實(shí)施例1的迷迷迭香石油醚提取物分散在乙醇中，亞硫酸鈉溶于水中，在超聲或攪拌條件下將拿硫酸鈉溶液逐漸加入，使成澄清透明溶液；補(bǔ)加水定容至足量；經(jīng)0.22μM微孔濾膜過濾，冷凍干燥得到。

取迷迭香提取物10克，加入1000ml丙二醇和1000ml注射用水，攪拌溶解，過濾，滅菌，罐裝，每支2ml，得迷迭香提取物注射液。

實(shí)施例5

迷迭香石油醚提取物的食品制劑

干酵母5g、溫水90ml、水少許、面粉150g、迷迭香石油醚提取物5mg，植物油10g、低鈉鹽少許

餅干做法：把酵母撒在溫水里攪拌倒溶化，加入實(shí)施例1的迷迭香石油醚提取物。加入面粉攪拌，再加入植物油，揉成光滑的面團(tuán)；面團(tuán)制成0.2cm厚的薄片；壓出造型，刺洞，表面撒上水，撒上一點(diǎn)低鈉鹽，室溫發(fā)酵10分鐘；烤箱預(yù)熱120度，放在上層，烤約10分鐘，得含迷迭香石油醚提取物的食品。

實(shí)施例6

迷迭香石油醚提取物提取工藝

迷迭香藥材10倍量甲醇提取3次，1h/次，合并甲醇提取液，回收甲醇， 浸膏加水使溶，加入石油醚，石油醚和水溶液按照1；1萃取三次，合并石油醚層，回收石油醚得迷迭香石油醚提取物。

實(shí)施例7

迷迭香石油醚提取物提取工藝

迷迭香藥材10倍量正丁醇提取3次，1h/次，合并正丁醇提取液，回收正丁醇，浸膏加水使溶，加入石油醚，石油醚和水溶液按照1；1萃取三次，合并石油醚層，回收石油醚得迷迭香石油醚提取物。