本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，包含艾葉活性提取物、活性單體成分的制備及在保護胃黏膜，抗胃潰瘍、解酒方面的藥物開發(fā)與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
艾葉，來源于菊科植物艾Artemisia argyi Levl.et Vant.。夏季花未開時采摘，除去雜質(zhì)，曬干。有溫經(jīng)止血，散寒止痛，外用祛濕止癢的功效。主要用于吐血，衄血，崩漏，月經(jīng)過多，胎漏下血，少腹冷痛，經(jīng)寒不調(diào)，宮冷不孕的治療；外治皮膚瘙癢。醋艾炭溫經(jīng)止血，用于虛寒性出血。盡管艾葉具有極大的藥用價值，但時至今日國內(nèi)外仍無任何有關(guān)其保護胃黏膜，抗胃潰瘍方面的相關(guān)報道，極大的限制了其應(yīng)用。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，這一植物提取物具有較好的保護胃黏膜，抗胃潰瘍方面的生物活性，以及解酒的功效。
異澤蘭黃素(Eupatilin)，艾葉里的主要活性成分，能散熱止痛，溫經(jīng)止血，有治療胃潰瘍和鎮(zhèn)痙的作用，還能調(diào)控血糖。
黃色粉末，mp.231-233℃。三氯化鐵-鐵氰化鉀反應(yīng)陽性，提示 存在酚羥基；鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性，三氯化鋁反應(yīng)陽性，提示該化合物為黃酮類化合物。1H-NMR(600MHz，DMSO-d6)譜中，δ3.89(3H，s，-OCH3)，3.86(3H，s，-OCH3)，3.79(3H，s，-OCH3)，13.05(1H，s，5-OH)，10.67(1H，s，7-OH)，7.52(1H，br s，H-2′)，7.08(1H，d，J＝8.5Hz，H-5′)，7.63(1H，dd，J＝8.5Hz、1.0Hz，H-6′)，6.91(1H，s，H-8)，6.62(1H，s，H-3)。
棕矢車菊素(Jaceosidin)，艾葉中另一主要活性成分，
黃色粉末，mp.229-230℃。三氯化鐵-鐵氰化鉀反應(yīng)陽性，提示存在酚羥基；鹽酸-鎂粉反應(yīng)陽性，三氯化鋁反應(yīng)陽性，提示該化合物為黃酮類化合物。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)譜中，δ3.89(3H，s，-OCH3)，3.74(3H，s，-OCH3)，13.07(1H，s，5-OH)，7.56～7.54(2H，m，H-5′、6′)，6.94(1H，d，J＝9.0Hz，H-2′)，6.58(1H，s，H-8)，6.87(1H，s，H-3)。13C-NMR(75MHz，DMSO-d6)：δ163.9(C-2)，102.8(C-3)，182.3(C-4)，152.9(C-5)，131.5(C-6)，157.4(C-7)，94.3(C-8)，152.5(C-9)，104.2(C-10)，121.7(C-1′)，110.3(C-2′)，148.2(C-3′)，150.8(C-4′)，115.9(C-5′)，120.5(C-6′)，60.1(OCH3)，56.1(OCH3)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供艾葉活性提取物及其制備方法，棕矢車菊素、異澤蘭黃素及其制備方法，還涉及它們的組合物在制備保護胃黏膜，抗胃潰瘍、解酒方面的藥物、保健品、功能性食品、食品中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的艾葉提取物，是通過以下方法制備得到，
取干燥艾葉(Artemisia argyi Levl.et Vant.)藥材，經(jīng)醇提取，將提取液濃縮，回收溶劑，干燥，得艾葉總提取物。
總提物進一步經(jīng)大孔樹脂色譜法分離純化，得到艾葉精提取物；或?qū)⑸鲜隹偺嵛锓稚⒂谒?，用等體積的有機溶劑萃取，回收溶劑，得到艾葉精提取物。
其中，所述提取的醇為60-95％的醇水溶液，優(yōu)選為75-95％醇水溶液，提取方式為浸漬、滲漉、加熱回流、連續(xù)加熱回流(沙氏提取法)、超聲提取。
所述的艾葉藥材包括菊科植物艾Artemisia argyi Lévl.et Vant.的干燥葉、莖、或整個地上部分。
所述的醇為甲醇或乙醇；提取次數(shù)為2-3次；溶劑用量與藥材質(zhì)量的比例為1:4-1:12，其中滲漉提取每次溶劑用量與藥材質(zhì)量的比例為1:4-1:20；浸漬提取的時間為每次4-20小時，加熱回流、或連續(xù)加熱回流(沙氏提取法)、或超聲提取方法每次提取時間為0.5-4小時；
所述濃縮方式為常壓蒸餾或減壓蒸餾，干燥方式為常溫加熱干燥或減壓干燥。
所述大孔吸附樹脂分離純化，為依次用水，體積比例為40-60％乙醇/水、70-95％的乙醇-水洗脫，富集70-95％的乙醇/水洗脫液。所述步驟中，回收濃縮方式為常壓蒸餾和減壓蒸餾。
所述萃取采用的有機溶劑包括氯仿(或二氯甲烷)、乙酸乙酯、的一種或兩種。
本發(fā)明提供的兩種單體化合物異澤蘭黃素、棕矢車菊素，是通過以下方法制備得到，
上述艾葉提取物，經(jīng)硅膠柱色譜，采用溶劑梯度洗脫，制備異澤蘭黃素、棕矢車菊素。
梯度洗脫的方法為：用體積比50:1-10:1的二氯甲烷(或氯仿)-甲醇，優(yōu)選體積比30:1-12.5:1的二氯甲烷(或氯仿)-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，得到異澤蘭黃素、棕矢車菊素單體化合物；或采用體積比為12:1-3:1的石油醚(或正己烷)-丙酮，優(yōu)選體積比10:1-5:1石油醚(或正己烷)-丙酮系統(tǒng)梯度洗脫，得到異澤蘭黃素、棕矢車菊素單體化合物。
上述艾葉總提取物、精提取物、異澤蘭黃素、棕矢車菊素、或它們與藥物、食品、功能性食品和保健品等中可接受的賦形劑、輔料等組成的組合物，可用于制備抗腫瘤、抗痛風和抗高尿酸血癥的藥物、保健品、功能性食品、以及食品的應(yīng)用。
具體實施方式
下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。
實施例1
艾葉4kg，剪碎后用12倍，10倍和8倍的60％醇80℃下加熱提取三次，(第一次3小時，第二次2小時，第三次2小時)過濾，合并濾液，回收溶劑得總提取物，收率約15.5％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，含量約為1.45％。
實施例2
艾葉4kg，粉碎后用20倍，8倍的95％醇85℃下溫浸提取兩次，(第一次4小時，第二次3小時)過濾，合并濾液，回收溶劑得總提取物，收率約為8.3％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，含量約為2.55％。
實施例3
艾葉4kg，粉碎后用12倍，10倍和8倍的75％醇80℃下加熱提取三次，(第一次3小時，第二次2小時，第三次0.5小時)過濾，合并濾液，回收溶劑得提取物，收率約為12.6％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，含量約為1.25％。
實施例4
艾葉4kg，剪碎后用12倍，10倍和8倍的80％乙醇浸漬提取三次(第一次10小時，第二次6小時，第三次2小時)，過濾，合并濾液，回收溶劑得總提取物，收率約8.6％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，含量約為1.55％。
實施例5
艾葉4kg，剪碎后用10倍，8倍95％乙醇浸漬提取二次(第一 次10小時，第二次8小時)，過濾，合并濾液，回收溶劑得總提取物，收率約7.2％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，含量約為2.30％。
實施例6
艾葉4kg，剪碎后用12倍，10倍，8倍60％乙醇浸漬提取三次(第一次10小時，第二次8小時，第三次4小時)，過濾，合并濾液，回收溶劑得總提取物，收率約9.1％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，含量約為1.38％。
實施例7
艾葉4kg，剪碎后用20升95％醇滲漉提取，過濾，合并濾液，回收溶劑得總提取物，收率約6.6％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，含量約為1.65％。
實施例8
艾葉4kg，剪碎后用40升60％醇滲漉提取，過濾，合并濾液，回收溶劑得總提取物，收率約6.2％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，含量約為1.25％。
實施例9
艾葉4kg，剪碎后用16升75％醇滲漉提取，過濾，合并濾液，回收溶劑得總提取物，收率約5.2％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，含量約為1.30％。
實施例10
艾葉4kg，剪碎后用10倍，8倍85％乙醇超聲提取兩次次(第 一次1小時，第二次0.5小時)，過濾，合并濾液，回收溶劑得總提取物，收率約11.6％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，含量約為1.98％。
實施例11
取艾葉總提取物分散于水中，分別用等體積的石油醚、氯仿萃取，回收溶劑，得到氯仿萃取物，干燥后得艾葉精提取物，收率為3.9％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，其在精提取物中的含量約為6.9％。
實施例12
取艾葉總提取物分散于水中，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯萃取，回收溶劑，得到乙酸乙酯萃取物，干燥后得艾葉精提取物，收率為4.5％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，其在精提取物中的含量約為5.6％。
實施例13
取艾葉總提取物分散于水中，分別用等體積的石油醚、正丁醇萃取，回收溶劑，得到正丁醇萃取物，干燥后得艾葉精提取物，收率為5.0％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，其在精提取物中的含量約為4.3％。
實施例14
取艾葉總提取物，經(jīng)HPD100型大孔吸附樹脂色，依次用水，體積比例為60％乙醇/水、95％的乙醇-水洗脫，95％的乙醇/水洗脫液濃縮干燥，得到艾葉精提取物，收率為3.7％；以異澤蘭黃素和棕矢車 菊素的總含量計，其在精提取物中的含量約為6.7％。
實施例15
取艾葉總提取物，經(jīng)AB-8型大孔吸附樹脂色，依次用水，體積比例為40％乙醇/水、70％的乙醇-水洗脫，70％的乙醇/水洗脫液濃縮干燥，得到艾葉精提取物，收率為4.2％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，其在精提取物中的含量約為4.0％。
實施例16
取艾葉總提取物，經(jīng)D101型大孔吸附樹脂色，依次用水，體積比例為55％乙醇/水、80％的乙醇-水洗脫，80％的乙醇/水洗脫液濃縮干燥，得到艾葉精提取物，收率為3.9％；以異澤蘭黃素和棕矢車菊素的總含量計，其在精提取物中的含量約為5.8％。
實施例17
取艾葉總提取物，經(jīng)硅膠柱色譜，采用二氯甲烷-甲醇混合溶劑50:1、30:1、25:1、20:1、10:1梯度洗脫，其中從25:1洗脫部位，分離得到兩個單體化合物異澤蘭黃素和棕矢車菊素，純度分別為99.0％、98.5％。
實施例18
取艾葉總提取物，經(jīng)硅膠柱色譜，采用氯仿-甲醇混合溶劑40:1、25:1、12.5:1梯度洗脫，其中從25:1洗脫部位，分離得到兩個單體化合物異澤蘭黃素和棕矢車菊素，純度分別為99.0％、98.5％。
實施例19
取艾葉精提取物，經(jīng)硅膠柱色譜，采用氯仿-甲醇混合溶劑30:1、 25:1、20:1、12.5:1梯度洗脫，其中從30:1洗脫部位，分離得到異澤蘭黃素，純度分為98.5％；從25:1洗脫部位，分離得到棕矢車菊素，純度為99.0％。
實施例20
取艾葉精提取物，經(jīng)硅膠柱色譜，采用石油醚-丙酮混合溶劑12:1、10:1、8:1、5:1梯度洗脫，其中從10:1洗脫部位，分離得到異澤蘭黃素和棕矢車菊素，純度均為98.5％。
實施例21
取艾葉精提取物，經(jīng)硅膠柱色譜，采用正己烷-丙酮混合溶劑10:1、8:1、5:1、3:1梯度洗脫，其中從8:1洗脫部位，分離得到異澤蘭黃素和棕矢車菊素，純度均為98.5％。
實施例22
艾葉提取物及其活性成分異澤蘭黃素、棕矢車菊素對胃粘膜損傷的保護作用(乙醇致潰瘍模型)。
(1)胃粘膜損傷模型制備：大鼠禁食24后，30g·L-1戊巴比妥鈉(4mg·kg-1)腹腔麻醉，用l mL無水乙醇灌胃，l h后腹正中切口進入腹腔，沿胃大彎處剪開胃，并進行各項實驗指標測定。
(2)給藥和分組：取SD大鼠55只，隨機分為5組，每組11只。I組：假手術(shù)組，作為正常對照；II組：損傷模型組，作為損傷對照；III組：艾葉粗提取物組、IV組：精提取物。在用無水乙醇灌胃30min前，灌胃艾葉提取物(200mg·kg-1)；V組：異澤蘭黃素組。 在用無水乙醇灌胃30min前，尾靜脈注射異澤蘭黃素(20mg·kg-1)；VI組：棕矢車菊素。在用無水乙醇灌胃30min前，尾靜脈注射異棕矢車菊素(20mg·kg-1)。
(3)胃粘膜損傷指數(shù)(Ulcer index，UI)判定：按Guth標準汁算潰瘍指數(shù)，處死動物，取出胃及十二指腸，沿大彎例剪開后，展平，按潰瘍或糜爛面積大小給予計分：斑點狀糜爛為1分，糜爛<1mm為2分，糜爛介于1-2mm之間為3分，糜爛為2-4mm為4分，糜爛>4mm為5分。
(4)組織學(xué)觀察：將全胃固定于福爾馬林液，制成石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察，評定標準如下：(1)壞死物質(zhì)：未見為0，僅在潰瘍底面邊緣有少許為(+)，薄層覆蓋整個潰瘍底為(++)，厚層覆蓋為(+++)(2)中性粒細胞浸潤：未見為0，偶見(+)，明顯(+++)，介于后兩者之間為(++)。
結(jié)果：
(1)UI測定：損傷模型組大鼠UI(25.33±2.47)比正常對照組UI(0)明顯升高(P<0.01)；艾葉提取物組、異澤蘭黃素組及棕矢車菊素組與損傷模型組比明顯降低(P<0.01)。
(2)胃組織學(xué)觀察：損傷模型組大鼠潰瘍底部可見大量壞死物質(zhì)，周圍組織中中性粒細胞浸潤明顯；艾葉提取物組(III,IV)、異澤蘭黃素組及棕矢車菊素組潰瘍底部壞死物質(zhì)和周圍組織中中性粒細胞浸潤均比損傷模型組明顯減輕(P<0.01)。結(jié)果見表l。
表l各組大鼠胃粘膜損傷指數(shù)變化和組織學(xué)觀察(n＝11，X±S)
注：與Ⅱ組比較**P<0.01
結(jié)論：艾葉粗提取物和精提取物，以及其主要成分異澤蘭黃素、棕矢車菊素具有顯著的胃粘膜保護作用，可以用于對抗酒精等多種因素對胃粘膜的損傷，并對胃潰瘍具有預(yù)防和治療的功效。
實施例23
艾葉提取物及其活性成分異澤蘭黃素、棕矢車菊素對胃粘膜損傷的保護作用(水應(yīng)激模型)。
(1)胃粘膜損傷模型制備：試驗前大鼠禁食12小時，將大鼠捆綁于特制的模板上，放于25℃水浴中，使水面平劍突，18h后處死動物，腹正中切口進入腹腔，沿胃大彎處剪開胃，并進行各項實驗指標測定。
(2)給藥和分組：取SD大鼠55只，隨機分為5組，每組11只。I組：空白組，作為正常對照；II組：損傷模型組，作為損傷對照；III組：艾葉粗提取物組、IV組：精提取物。在水應(yīng)激模型制備前7天，每天灌胃艾葉提取物(200mg·kg-1)；V組：異澤蘭黃素組。在水應(yīng)激模型制備前7天，每天尾靜脈注射異澤蘭黃素(20mg·kg-1)； VI組：棕矢車菊素。在水應(yīng)激模型制備前7天，每天尾靜脈注射異棕矢車菊素(20mg·kg-1)。
(3)胃粘膜損傷指數(shù)(Ulcer index，UI)判定：按Guth標準汁算潰瘍指數(shù)，處死動物，取出胃及十二指腸，沿大彎例剪開后，展平，按潰瘍或糜爛面積大小給予計分：斑點狀糜爛為1分，糜爛<1mm為2分，糜爛介于1-2mm之間為3分，糜爛為2-4mm為4分，糜爛>4mm為5分。
(4)組織學(xué)觀察：將全胃固定于福爾馬林液，制成石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察，評定標準如下：(1)壞死物質(zhì)：未見為0，僅在潰瘍底面邊緣有少許為(+)，薄層覆蓋整個潰瘍底為(++)，厚層覆蓋為(+++)(2)中性粒細胞浸潤：未見為0，偶見(+)，明顯(+++)，介于后兩者之間為(++)。
結(jié)果：
(1)UI測定：損傷模型組大鼠UI(19.68±1.74)比正常對照組UI(0)明顯升高(P<0.01)；艾葉提取物組(粗體、精提)、異澤蘭黃素組及棕矢車菊素組與損傷模型組比明顯降低(P<0.01)。
(2)胃組織學(xué)觀察：損傷模型組大鼠潰瘍底部可見大量壞死物質(zhì)，周圍組織中中性粒細胞浸潤明顯；艾葉提取物組(粗體、精提)、異澤蘭黃素組及棕矢車菊素組潰瘍底部壞死物質(zhì)和周圍組織中中性粒細胞浸潤均比損傷模型組明顯減輕(P<0.01)。結(jié)果見表2。
表2各組大鼠胃粘膜損傷指數(shù)變化和組織學(xué)觀察(n＝11，X±S)
注：與Ⅱ組比較**P<0.01
結(jié)論：艾葉粗提取物和精提取物，以及其主要成分異澤蘭黃素、棕矢車菊素對水應(yīng)激導(dǎo)致的胃粘膜損傷具有顯著的保護作用，可以用于對抗焦慮等多種因素對胃粘膜的損傷，并對胃潰瘍具有預(yù)防和治療的功效。